Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تعبير البروتينات الفلورية الانصهار في مورين الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم والضامة

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58081
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1
1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

Summary

في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكول مفصل للتعبير عن البروتينات الفلورية الانصهار في نخاع العظام مورين اشتقاق الخلايا الجذعية والضامة. ويستند الأسلوب في توصيل نخاع العظام المتكفل بنيات فيروسات النسخ العكسي متبوعاً بتمايز إلى الضامة والجذعيه الخلايا في المختبر.

Abstract

الخلايا الجذعية والضامة هي خلايا الحاسمة التي تشكل الخط الأول للدفاع ضد العوامل الممرضة. كما أنها تؤدي أدواراً هامة في بدء استجابة مناعية تكيفية. العمل التجريبي مع هذه الخلايا بدلاً من ذلك التحدي. كثرة في الأعضاء والأنسجة منخفضة نسبيا. كنتيجة لذلك، لا يمكن أن تكون معزولة بإعداد كبيرة. وأيضا صعوبة في ترانسفيكت مع بنيات كدنا. في طراز مورين، يمكن تجاوز هذه المشاكل جزئيا بالتمايز في المختبر من فروعه نخاع العظام بحضور م-CSF الضامة أو GM-CSF للخلايا الجذعية. وبهذه الطريقة، من الممكن الحصول على كميات كبيرة من هذه الخلايا من عدد قليل جداً من الحيوانات. وعلاوة على ذلك، يمكن أن ترانسدوسيد المتكفل نخاع العظام مع الفيروسات التراجعية ناقلات تحمل نيات كدنا خلال المراحل المبكرة لزراعة قبل على التمايز في الخلايا الجذعية نخاع العظام المشتقة والضامة. وهكذا، يمكن توصيل النسخ العكسي متبوعاً بتمايز في المختبر للتعبير عن مختلف بنيات كدنا في هذه الخلايا. القدرة على التعبير عن البروتينات خارج الرحم إلى حد كبير يمتد مجموعة التجارب التي يمكن إجراؤها على هذه الخلايا، بما في ذلك تصوير الخلايا الحية من البروتينات الفلورية، وتنقية جنبا إلى جنب لتحليلات إينتيراكتومي، تحليل بنية دالة، ورصد الوظائف الخلوية مع أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، وغيرها الكثير. في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكول مفصل لتوصيل النسخ العكسي للخلايا الجذعية نخاع العظام موريني المشتقة والضامة مع ناقلات الترميز لمعلم فلوريسسينتلي البروتينات. على سبيل المثال من اثنين من البروتينات محول، OPAL1 و PSTPIP2، علينا أن نظهر تطبيقه العملي في التدفق الخلوي والفحص المجهري. نحن أيضا مناقشة مزايا وقيود من هذا النهج.

Introduction

وتمثل الخلايا النقوي جزءا لا يتجزأ من آليات الدفاع لدينا ضد مسببات الأمراض. فقادرة على سرعة القضاء على الميكروبات، فضلا عن خلايا الموت. وباﻹضافة إلى ذلك، كما أنها تشارك في تنظيم التنمية الأنسجة وإصلاح والحفاظ على التوازن1،،من23. كافة الخلايا النقوي تفرق من فروعه النقوي الشائعة في نخاع العظام. على التمايز إلى عدة مجموعات فرعية متميزة وظيفيا وشكليا إلى حد كبير تسيطر عليها السيتوكينات وعلى تركيبات مختلفة4. وتشمل المجموعات الأكثر كثافة درس الخلية النقوي المحببة بالعدلات والضامة والخلايا الجذعية. عيوب في أي من هؤلاء السكان يؤدي إلى عواقب تهدد الحياة وسبب الخلل الشديد في الجهاز المناعي لدى البشر والفئران1،2،،من35، 6.

خلافا بالعدلات المحببة، الخلايا الجذعية والضامة خلايا الأنسجة المقيمين وعلى وفرة في أجهزة المناعة منخفضة نسبيا. نتيجة لذلك إلى العزلة وتنقية الخلايا الجذعية الأولية والضامة للتجارب التي تتطلب عددا كبيرا من هذه الخلايا مكلفة وغالباً ما يكون من المستحيل. لحل هذه المشكلة، وضعت بروتوكولات للحصول على كميات كبيرة من الضامة متجانسة أو الخلايا الجذعية في المختبر. تستند هذه النهج على التفريق بين خلايا نخاع العظام موريني حضور السيتوكينات: بلعم محفزة لمستعمرة عامل (م-CSF) الضامة وعامل تحفيز مستعمرة بلعم المحببات (GM-CSF) أو يجند Flt3 ل الخلايا الجذعية7،،من89،10،،من1112. ويرد عادة الخلايا التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الأسلوب في الأدب نخاع العظام المستمدة الضامة (بمدمس)، ونخاع العظام المستمدة من الخلايا الجذعية (بمدكس). لديهم المزيد من الخصائص الفسيولوجية مشتركة مع الابتدائي الضامة أو الخلايا الجذعية من خطوط الخلايا المناظرة. ميزة رئيسية أخرى إمكانية الحصول على هذه شكل خلايا وراثيا تعديل الفئران13. الدراسات المقارنة بين البرية من نوع الخلايا والخلايا المشتقة من الفئران المعدلة وراثيا غالباً ما تكون حاسمة بالنسبة لوظائف الرواية الكشف عن الجينات أو البروتينات للفائدة.

تحليل التعريب سوبسيلولار للبروتينات في الخلايا الحية يتطلب اقتران تسمية الفلورسنت للبروتين من الفائدة في فيفو. الأكثر شيوعاً ويتحقق ذلك بالإعراب عن بناء الانصهار وراثيا المرمزة تتألف من البروتين تم تحليلها الاقتران (غالباً عن طريق رابط قصيرة) إلى بروتين فلوري (مثلاً.، أخضر نيون البروتين (بروتينات فلورية خضراء))14،15 , 16-التعبير عن كلمات فلوريسسينتلي البروتينات في الخلايا الجذعية أو الضامة التحدي. هذه الخلايا عموما من الصعب ترانسفيكت بالإجراءات القياسية تعداء وأوجه الكفاءة التي تميل إلى أن تكون منخفضة جداً. وعلاوة على ذلك، تعداء عابر وأنه يولد الإجهاد الخلوية وكثافة المحققة من الأسفار قد لا تكون كافية للفحص المجهري17. من أجل الحصول على جزء معقول من هذه الخلايا مع مستوى كاف من التعبير التحوير، وعدوى الخلايا السلف نخاع العظام مع النسخ العكسي أصبحت هذه التفرقة اللاحقة إلى بمدمس أو بمدكس ومتجهات فعالة جداً النهج. وقد أتاح تحليل البروتينات النقوي المنشأ في بيئتها الخلوية الأصلية، سواء في حالة مستقرة أو أثناء العمليات التي تعتبر حاسمة بالنسبة للاستجابة المناعية مثل البلعمه، وتشكيل المشبك المناعية أو الهجرة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول يسمح لتعبير مستقر من البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة الاهتمام بنخاع العظام موريني المستمدة الضامة، والخلايا الجذعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا "لجنة الخبراء" المعنية "رعاية الحيوانات التجريبية" لمعهد علم الوراثة الجزيئي، وأكاديمية العلوم للجمهورية التشيكية.

1-كاشف إعداد

  1. إعداد المخزن المؤقت الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK). إضافة غ 4.145 NH4Cl و 0.5 غ كهكو3 إلى 500 مل من ddH2س، ثم إضافة 100 ميليلتر من 0.5 م الإيثيلين حمض (يدتا) وتعقيم عامل التصفية.
  2. إعداد حل بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد). إضافة 0.1 غرام بي إلى 90 مل ddH2o. بينما التحريك، إضافة 1 M HCl dropwise حتى يصبح الرقم الهيدروجيني أقل من 2.0. يقلب لمدة تصل إلى 3 ساعات حتى يذوب بي ثم قم بضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.2 مع 1 م هيدروكسيد الصوديوم. ضبط حجم الصوت إلى 100 مل مع ddH2س وتعقيم عامل التصفية. قم 1 – 2 مل مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: بعد ذوبان الجليد، بي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لتصل إلى 2 أسابيع لكن يجب عدم إعادة تجميد.
  3. إعداد supernatants ثقافة الخلية التي تحتوي على السائل النخاعي M أو GM-CSF. هذه سوبيرناتانتس يمكن إجراؤها مسبقاً والمخزنة في-80 درجة مئوية. لجعل هذه سوبيرناتانتس، ينمو إنتاج سيتوكين الخلايا (خلايا J558 GM-CSF 18 ) أو خلايا CMG 14-12 للخدمات القطرية م 19في 10 سم طبق بيتري في متوسطة النسر معدلة في دولبيكو (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) لالتقاء. ثم نقل كافة الخلايا إلى 200 مل من وسائل الإعلام في قارورة T150 زراعة الأنسجة والثقافة 4 أيام إضافية عند 5% CO237 درجة مئوية. جمع المادة طافية وتصفية على 0.2 ميكرون التعقيم التصفية. جعل مختبرين وتخزين هذه في-80 درجة مئوية.
  4. تحضير 100 مل من خلايا الثقافة المتوسطة: دميم وتستكمل مع 10% الحرارة FBS المعطل وخلية supernatants ثقافة من خلايا إفراز GM-CSF (للتفريق بمدك) أو M-CSF (للتمايز بمدم).
    ملاحظة: يمكن أن تختلف كمية السيتوكينات في هذه سوبيرناتانتس وتركيز العمل قد يتحدد تجريبيا. نموذجياً، يتم استخدام المادة طافية 2 – 3% من خطوط الخلايا التي تنتج GM-CSF (تركيز انطلاق الموصى به 2 ٪) أو المادة طافية 5-10% من CMG 14 – 12 الخلايا المنتجة م-CSF (تركيز انطلاق الموصى به هو 10%). وبدلاً من ذلك، تنقية تجارياً م الخدمات القطرية المتاحة في 10 نانوغرام/مل و GM-CSF في 20 نانوغرام/مل يمكن استخدامها مع نتائج متطابقة تقريبا إلى سيتوكين التي تحتوي على سوبيرناتانتس، أي.، دون أي تأثير على معدل التمايز، كفاءة الإصابة والتعريب سوبسيلولار من بنيات معلم اجفب. المضادات الحيوية، بما في ذلك البنسلين ز (100 وحدة/مل)، ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل) ومن الجنتاميسين (40 ميكروغرام/مل)، يمكن استخدامها لزراعة الخلايا في أي خطوة للبروتوكول ما لم يذكر خلاف ذلك.

2-إنتاج لفي

تنبيه: رغم أن الناقلة للفيروس آمنة نسبيا بالمقارنة مع أنواع أخرى من النواقل الفيروسية، أنها لا تزال تشكل خطرا محتملاً في سلامة. ولذلك، من الأهمية بمكان للعمل بأقصى قدر من العناية ومعدات الوقاية المناسبة، والتقيد بجميع أنظمة السلامة والمتطلبات القانونية للعمل مع الجزيئات الفيروسية.

  1. لوحة تعليق خلية مفردة للبلاتين--منظمة التعاون الاقتصادي (بلات-E) تغليف الخلايا في 10 سم طبق بيتري وزراعتها في 15 مل دميم التي تحتوي على 10% FBS حتى 50-60 ٪ روافد (24 ساعة). ينبغي أن ينمو في أحادي الطبقة الخلايا ولا ينبغي أن يشكل كتل في الثقافة.
  2. ماصة 20 ميكروغرام من بناء النسخ العكسي (مثلاً.، في بناء التعبير عن البروتين فلوريسسينتلي المعلمة الاهتمام بناقل بمسكف) و 10 ميكروغرام للتعبئة والتغليف الإيكولوجي pCL ناقلات20 إلى 1 مل دميم (بدون المصل والمضادات الحيوية) وتخلط برفق.
  3. لأنبوب ثان، بإضافة 75 ميليلتر من جزيرة الأمير إدوارد في 1 مل دميم (بدون المصل والمضادات الحيوية). احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) ثم تخلط محتويات كلا أنابيب معا واحتضانها لإضافية 10 دقيقة في الرايت
    ملاحظة: إضافة pCL-الإيكولوجية اختياري. هو ترميز لمستقبلات الفيروسية اكوتروبيك وقد تزيد من عيار الفيروس.
  4. بعناية استبدال المتوسطة في الخلايا بلات-E مع 8 مل دميمسوبليمينتيد الطازجة مع 2% FBS. قبل الحارة المتوسط إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. عدم استخدام المضادات الحيوية خلال تعداء، نظراً للمضادات الحيوية قد يقلل من كفاءة تعداء.
  5. بعناية إضافة (في قطرات) المخلوط إعدادها في الخطوة 2.3 في الخلايا بلات-E، واحتضانها ح 4 في 37 درجة مئوية.
  6. بعد الاحتضان، تبادل المتوسطة في الخلايا بلات-ه لمل 10 من دميم المعالجون مسبقاً التي تتضمن 10% FBS، وزراعة الخلايا ل 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. خلال هذه الحضانة، ستنتج خلايا ه بلات الفيروس في وسائل الإعلام.
  7. بعد 24 ساعة، جمع المتوسطة التي تحتوي على جزيئات الفيروسات التراجعية من الخلايا "البلاتين الإيكولوجية" باستخدام ماصة 5 مل ونقلها إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل (= "1 طافية" التي تحتوي على جزيئات الفيروس اكوتروبيك).
  8. لتجنب التلوث بالخلايا بلات-ه في supernatants الفيروسية، تدور الفيروس التي تم جمعها في 1250 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. للحصول على أفضل النتائج، يجب استخدام الفيروس فورا للعدوى.
    ملاحظة: مختبرين للفيروسات يمكن أيضا تخزين في-80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. ومع ذلك، فإنه سيؤدي إلى في الحد من بعض في كفاءة توصيل. تجنب تكرار تجميد/ذوبان الجليد للفيروس، نظراً لأنه يؤدي إلى تدهور الفيروس.
  9. أضف 10 مل دميم المعالجون مسبقاً مع 10% FBS إلى ه بلات الخلايا وزراعتها لآخر 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  10. كرر الخطوات من 2.7. و 2.8. للحصول على "طافية 2".

3-عزل خلايا نخاع العظام مورين

  1. التضحية بخلع عنق الرحم أو أي أسلوب من أساليب المعتمدة باستخدام الماوس. رذاذ الماوس مع الإيثانول 70%.
  2. استخدام الملقط، والمقص، إزالة الجلد، فضلا عن جزء من عضلات من الخلفيتين. عناية إزاحة لحق من الورك دون كسر عظم الفخذ. قص مخلب في الكاحل. رش العظام (عظم الفخذ متصلة بالساق) مع الإيثانول 70% وإزالة بقية العضلات باستخدام منشفة ورقية.
  3. ضع العظام في طبق بتري 5 سم تحتوي على الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) بنسبة 2% FBS (برنامج تلفزيوني-FBS).  إذا إعداد المزيد من العظام، والحفاظ على طبق بيتري على الجليد حتى تتم معالجتها.
  4. لتأمين زراعة العقم، تنفيذ كافة الخطوات التالية في غطاء زراعة الأنسجة.
  5. فصل في عظم الفخذ من الساق دون كسر نهايات العظام في الركبة المشتركة وقطع بعناية مع المقص (منحنى).
  6. عملية العظام واحداً تلو الآخر. قطع جزء صغير جداً من ابيفيسيس (حوالي 1 – 2 مم) مع مقص أثناء الضغط العظام في ملاقط.
  7. استخدام إبرة ز 30 و 2 أو 5 مل حقنه مليئة ببرنامج تلفزيوني-FBS لمسح خلايا نخاع العظام من كلا طرفي العظام في أنبوب الطرد مركزي 15 مل. حرك الإبرة داخل العظام أثناء التنظيف من أجل إزالة كافة الخلايا. إذا كان يحصل انسداد الإبرة، تغييره.
    ملاحظة: العظام ينبغي أن تتحول من اللون الأحمر إلى الأبيض أثناء التنظيف. يشير هذا إلى أنه قد تم إزالة معظم الخلايا من العظام. استخدام حوالي 2 – 3 مل من برنامج تلفزيوني-FBS في العظام.
  8. الطرد المركزي الخلايا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  9. تجاهل المادة طافية وخلايا الدم الحمراء التي ريسوسبيندينج بيليه في 2.5 مل من المخزن المؤقت ACK لمدة 2 – 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. خلال تحلل، تصفية خلايا النخاع العظمى من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب سينتريفوج طازجة 15 مل. استعادة تونيسيتي عن طريق إضافة 12 مل من برنامج تلفزيوني-FBS.
    ملاحظة: لا تتجاوز 5 دقائق لتحلل ناقص التوتر مع المخزن المؤقت ACK لتجنب موت الخلية.
  10. الطرد المركزي فورا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.

4-نخاع العظام الخلية التمايز في نخاع العظام المستمدة الضامة

  1. ريسوسبيند بيليه خلايا نخاع العظام في دميم وتستكمل مع 10% FBS والمضادات الحيوية (راجع الملاحظة بعد "الخطوة 1، 4". لتركيز المضادات الحيوية) وحساب الخلايا. لوحة للتمايز إلى BM المستمدة الضامة، 5 – 10 × 106 خلايا نخاع العظام في 10 سم غير-الأنسجة ثقافة تعامل طبق بتري (البكتيرية) مع 10 مل الإعلام دميم معدّة سلفا بمصل الدم والسائل النخاعي م من "الخطوة 1، 4".
    ملاحظة: هو عائد خلايا نخاع العظام حوالي 4 × 107 في الأسبوع 6-8-القديمة C57BL/6J الماوس.
  2. احتضان الخلايا في خلية ثقافة حاضنة لمدة 3 أيام في 5% CO2، 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: خلال أول يومين، خلايا لا تبدو حيوية جداً، ما عدد كبير من الخلايا أبوبتوتيك (خلايا غير قادر على التفريق في النقوي الخلايا والخلايا المتمايزة لا شفاء منه).
  3. بعد 3 أيام، ثقافة خلية نخاع العظم يبدأ البحث الحيوية ويتم تشكيل مجموعات من تقسيم الخلايا. يمكن فعلا ملاحظة الخلايا ملتصقة الأولى. عند هذه النقطة، الملحق الخلايا مع وسائل الإعلام سيتوكين الطازجة.
  4. أضف 10 مل من وسائط الإعلام دميم المعالجون مسبقاً مع M-CSF (من الخطوة 1، 4) والمصل في كل 10 سم طبق بيتري وإعادته في حاضنة الثقافة الخلية. ليست هناك حاجة إزالة الوسائط القديمة أثناء هذه الخطوة.
    ملاحظة: تختلف الضامة نخاع العظام بالكامل بعد 5 – 7 أيام في الثقافة. أفضل وقت للحصاد في يوم 6-8، حيث تكون أغلبية الخلايا ملتصقة وطبق بيتري مغطى تماما.
  5. في يوم 5، تأخذ طبق بيتري في خلية ثقافة غطاء محرك السيارة وانحدر الطبق حتى وسائل الإعلام تقريبا تصل إلى حافة الطبق. تأخذ بعناية بها 15 مل من وسائط الإعلام من على سطح الأرض قرب الحافة، والخلايا تميل إلى البقاء في منتصف الطبق. إضافة نفس الحجم من وسائل الإعلام قبل دافئة مع الخدمات القطرية م ووضع الطبق مرة أخرى إلى الحاضنة.
    ملاحظة: إذا كانت وسائل الإعلام ويستنشق ببطء وبعناية، تضيع تقريبا أي من الخلايا. ومع ذلك، من الممكن أيضا الطرد المركزي وسائط الإعلام يستنشق وإضافة الخلايا إلى الثقافة، لضمان أن لا يوجد غير ملتصقة (أي.، متمايزة) الخلايا يتم فقدان.
  6. للتجارب، وتستخدم الخلايا ملتصقة فقط (الضامة). لحصاد الخلايا، في يوم 6 أو 7، قم بإزالة جميع خلايا العائمة ووسائل الإعلام. أغسل الطبق مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً دون المصل.
  7. إضافة 5 مل يدتا 0.02 في المائة في برنامج تلفزيوني، واحتضان لمدة 3-5 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة استنبات الأنسجة.
  8. استخدام ماصة 5 مل، إزالة الخلايا من الطبق بتيار PBS-يدتا ووضعها في أنبوب الطرد مركزي 50 مل مع 25 مل من برنامج تلفزيوني. إذا لزم الأمر، تجمع الأطباق أكثر معا.
  9. الطرد المركزي فورا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  10. ريسوسبيند بيليه بلعم في وسائط الإعلام دميم وحساب الخلايا. التحقق من التعبير عن علامات التمايز السطحية بلعم (CD11b و F4/80) عن طريق التدفق الخلوي.
  11. للتجارب التي تتطلب الخلايا في التعليق، على سبيل المثال-، التدفق الخلوي التجارب، أو قبكر، أو تحليل لطخة غربية، واستخدم الضامة صورة مباشرة. لإجراء التجارب مع الضامة ملتصقة، لوحة الخلايا الموجودة في لوحة زراعة الأنسجة وفقا للإعداد التجريبية.
  12. تختلف الخلايا بالفعل تماما. الاحتفاظ بها في وسائل الإعلام مناسب للتجربة المقصودة أو في وسائط النمو والتمايز الأصلية مع M-CSF.
    ملاحظة: للعامل مع الضامة ملتصقة، تحويلها إلى جديدة لوحة على الأقل 6 ح قبل الاستخدام (ومن الناحية المثالية بين عشية وضحاها) للسماح بانضمام كامل إلى السطح الجديد. يمكن إزالة جزء صغير من العائمة الخلايا قبل التجربة.

5-نخاع العظام الخلية التمايز في نخاع العظام المستمدة من الخلايا الجذعية

  1. يتبع البروتوكول بمدمس مع إجراء تعديلات محددة بمدكس هو موضح أدناه في خطوات 5.2 – 5.4.
  2. ريسوسبيند بيليه التي تم الحصول عليها من خلايا نخاع العظام في دميمسوبليمينتيد مع 10% FBS والمضادات الحيوية، وحساب عدد الخلايا (بالتالي "الخطوة 4-1" من البروتوكول بلعم). تعامل بلايت 1 – 1.5 × 10 خلايا النخاع العظمى7 في 10 سم غير-زراعة الأنسجة للتمايز في الخلايا الجذعية، طبق بتري (الجرثومية) في 10 مل الإعلام دميم المعدة مسبقاً مع المصل و GM-CSF (من "الخطوة 1، 4".).
  3. اتبع نفس الخطوات كما هو الحال في البروتوكول بمدم زراعة (خطوات 4.3 – 4.5. بلعم البروتوكول). استخدام الوسائط دميم مع GM-CSF بدلاً من م-CSF والمصل. إذ لم يعد بمدكس الوقت زراعة (عادة 10 – 12 يوما)، بإضافة الوجبات الإضافية 1 – 2 في فترات اليوم 3 (بإزالة المادة طافية وإضافة وسائط زراعة جديدة كما هو موضح في الخطوة 4، 5)..
  4. هذا الجزء من البروتوكول هو تقريبا نفس الجزء المقابل من البروتوكول بلعم (خطوات 4.6 – 4.12. بلعم البروتوكول). لتجارب استخدام الخلايا ملتصقة فقط. في يوم 10-12، جمع الخلايا باستخدام يدتا، عد ولوحة لهم على سطح جديد. تحقق من التعبير عن علامات التمايز السطحية للخلايا الجذعية (CD11c +، CD11b + F4/80-) بالتدفق الخلوي.

6-إنتاج بمدمس وبمدكس التعبير عن البروتين معلم اجفب للفائدة

  1. ريسوسبيند بيليه خلايا النخاع العظمى التي تم الحصول عليها في "الخطوة 3، 10". في دميم تستكمل مع 10% FBS والمضادات الحيوية وحساب الخلايا. للعدوى، استخدم 2 – 5 × 106 خلايا BM الواحدة من ثقافة الأنسجة 6-جيدا جيدا تعامل لوحة.
  2. لوحة الخلايا الموجودة في 1 مل من وسائط الإعلام دميم استعداد كل أيضا، تستكمل مع M-CSF للتمايز في بمدمس أو GM-CSF للتمايز في بمدكس. إبقاء الخلايا ح 4 – 6 في حاضنة استنبات الأنسجة مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 2 مل فيروس حديثا جمعها ("1") طافية وتستكمل مع بوليبريني (12 ميكروغرام/مل، وتركيز النهائي 8 ميكروغرام/مل بعد، بالإضافة إلى الخلايا).
    ملاحظة: قاسمة المجمدة من المادة طافية المحتوية على الفيروس يمكن أن تستخدم أيضا، ولكن سيكون أقل فعالية.
  4. الطرد المركزي اللوحة في 1,250 س ز لمدة 90 دقيقة في 30 درجة مئوية (مع تسارع بطيئة وتباطؤ). ثم احتضانها ح 4 مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية.
  5. اختياري: استبدال 2 مل وسائط الثقافة مع الطازجة سيتوكين كل منها تحتوي على المتوسط (م-قوات الأمن المركزي أو GM-CSF) والثقافة مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية. اليوم الثاني، إزالة 2 مل وسائط الثقافة وكرر الإجراء الإصابة بأكملها (الخطوة 6.3 – 6.4) مع 2 مل فيروس حديثا جمعها ("طافية 2").
    ملاحظة: هذه الخطوة قد تزيد الإصابة بفعالية. تحسن بعد الإصابة الثانية تعتمد على البروتين الهدف ونوع الخلية وفي تجربتنا يمكن أن تختلف من زيادة بنسبة 30% في كفاءة إلى أي تحسن على الإطلاق.
  6. جمع الخلايا غير ملتصقة، نقل إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل، وتدور في ز x 500 لمدة 5 دقائق (4 درجات مئوية). تجاهل المادة طافية.
  7. ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل وسائط الثقافة مع الخدمات القطرية م أو GM-CSF، ووضع الخلايا في طبق بتري معالجة غير زراعة الأنسجة 10 سم والثقافة في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. هو العدد الأمثل من الخلايا لطبق 10 سم 5 – 10 × 106 ل BM المستمدة الضامة و 10 – 15 × 106 للخلايا الجذعية المشتقة من بي أم.
    ملاحظة: يمكن استخدام أطباق أصغر أو لوحات، ولكن يجب أن تكون تبعاً لأرقام الخلية.
  8. اتبع في بلعم والخلايا الجذعية زراعة والتمايز البروتوكول هو موضح في الخطوة 4 و 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مما يشير إلى محول البروتينات هي البروتينات الصغيرة عادة دون أي النشاط الأنزيمي. أنها تمتلك مختلف مجالات التفاعل أو زخارف، والتوسط الملزم للبروتينات الأخرى المتورطة في توصيل الإشارة، بما في ذلك تيروسين مؤنزم، فوسفاتاسيس، ليجاسيس أوبيكويتين وغيرها21. واختيرت للتدليل على وظيفة هذا البروتوكول خلية النقوي محولات PSTPIP2 و OPAL1. PSTPIP2 بروتين كذلك تتسم مشاركة في تنظيم الاستجابة الالتهابية22. هو بروتين هيولى الذي يمكن أيضا تعيين للأغشية الخلوية عبر المجال الخاص به و بار. البروتين الثاني محول ترانسميمبراني OPAL1، ومن المتوقع أن تكون مقترنة بالأغشية الخلوية. مازال غير معروف وظيفتها الفسيولوجية. ومع ذلك، في سرطان الدم الليمفاوي الحاد، يرتبط التعبير عن OPAL1 مع أفضل تنبؤ23.

بنيات كدنا الترميز تنصهر PSTPIP2 أو OPAL1 عن طريق رابط قصيرة (جسججس أو حركة، العلامة، على التوالي) إلى اجفب في ج-المحطة قد تم استنساخ إلى ناقل للفيروسات الرجعية بمسكف استخدام الأساليب القياسية لاستنساخ كدنا. ثم تم transfected هذا البناء إلى خلايا بلات-ه جنبا إلى جنب مع التغليف ناقلات pCL-منظمة التعاون الاقتصادي. واستخدمت supernatants الناتجة التي تحتوي على الفيروسات القهقرية لتوصيل خلايا نخاع العظام، متبوعاً التمايز إلى بمدمس وبمدكس. تم تقييم فعالية تعداء ه بلات بالتدفق الخلوي بعد جمع المادة المحتوية على الفيروس الثاني طافية. تعداء متوسط الكفاءة كان 62% ل PSTPIP2-اجفب و 53% ل OPAL1 والنتائج تم استنساخه بدرجة عالية (الشكل 1 أ، ب). OPAL1 بناء على ما يبدو أكثر سمية للخلايا بلات-E (يقيم بمظهر الخلايا العائمة/الموت في الثقافة)، أسفر عن تخفيض في النسبة المئوية للخلايا ترانسفيكتيد.

تم تقييم حالة التمايز نخاع العظام المستمدة الضامة والخلايا الجذعية (ترانسدوسيد مع الثوابت النسخ العكسي PSTPIP2-اجفب و OPAL1-اجفب) بالتدفق الخلوي. السكان بلعم ناضجة يحددها التعبير CD11b و F4/80، في حين أعرب عن الخلايا الجذعية علامة النسب CD11c. وكانت أكثر من 90% خلايا في كلا النوعين من الثقافة الإيجابية لتلك علامات كل منهما (الشكل 2 أ، ب). وأخيراً، عقدنا العزم بنيات مستوى التعبير PSTPIP2-اجفب و OPAL1-اجفب في بمدمس وبمدكس بقياس الخلوي تدفق بسيط من الأسفار اجفب. وكانت نسبة الضامة إيجابية اجفب يعني 71% ل PSTPIP2-اجفب و 62 في المائة بالنسبة OPAL1-اجفب (الشكل 3A). في حالة الخلايا الجذعية، بالكفاءة أقل، 32% ل PSTPIP2 و 9% ل OPAL1 (الشكل 3B). وتبين نتائج التجارب متعددة إمكانية تكرار نتائج هذا الأسلوب (الشكل 3).

نحن عادة لا تحدد تركيز الفيروس في supernatants التي نستخدمها في الالتهابات. نحن نفضل استخدام الطازجة supernatants الفيروس، فورا بعد جمع، بينما يتطلب تحديد عيار الفيروس ثلاثة أيام إضافية. كنتيجة لذلك، المعلومات المتعلقة بعيار الفيروس يمكن فقط الحصول على رجعي. ومع ذلك، لا يزال يمكن مفيدة عند معالجة القضايا والمشاكل التقنية. لتقييم تركيز الفيروس في supernatants من "ه بلات" transfected الخلايا مع PSTPIP2-اجفب ويبني OPAL1-اجفب، ونحن المحتضنة الخلايا 3T3 المعاهد الوطنية للصحة مع المخفف متسلسل supernatants المحتوية على الفيروسات التي تم جمعها من هذه الخلايا بلات-ه ترانسفيكتيد و تحديد عيار الفيروس بالضبط كما هو موضح ب زجابلوفسكاجا وآخرون في جوف نشرت سابقا المادة24. في ثلاث تجارب مستقلة، عيار الفيروس تتراوح بين 1.1 x 106 إلى 4، 4 × 106 تي يو/مليلتر. ونحن لم تلاحظ أي اختلافات جوهرية بين PSTPIP1-اجفب وبني OPAL1-اجفب وبين سوبيرناتانتس من يوم 1 ويوم 2. عندما تستخدم هذه سوبيرناتانتس لالتهابات خلية نخاع العظم ووفقا للبروتوكول نحن تصف في هذه المقالة، تعدد العدوى (وزارة الداخلية) تتراوح بين 1.1 إلى 4.4. من المثير للاهتمام، ضمن هذا النطاق، نحن لم يلاحظ أي ارتباط بين الكفاءة الداخلية والعدوى.

في الشكل 4، كانت تصور PSTPIP2-اجفب و OPAL1-اجفب في بمدمس وبمدكس وأعرب عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل]. الضامة متمايزة تماما، والخلايا الجذعية بشكل مميز. ويؤكد التغيير في التشكل من خلايا صغيرة مدورة السلف إلى الخلايا الكبيرة من الأشكال غير النظامية التمايز ناجحة. في الضامة، PSTPIP2 كان هيولى مع ترجمة جزئية في غشاء البلازما. OPAL1 فيما يبدو إلى أن تستهدف أيضا جزئيا غشاء البلازما. بقية ارتبط يرجح أن الأغشية داخل الخلايا، مثل هيولى ومجمع غولجي. ومع ذلك، لتأكيد هذه الترجمة، سيكون علامات عضية محددة لاستخدامها. في الخلايا الجذعية، وإضفاء الطابع المحلي على غشاء كان أقل وضوحاً.

Figure 1
رقم 1: كفاءة تعداء الخلايا بلات-ﻫ. تعداء الخلايا بلات-ه، قد تم استنساخ اثنين بنيات تنصهر فيها ترميز البروتينات محول PSTPIP2 و OPAL1 مع اجفب (PSTPIP2-اجفب و OPAL1-اجفب) إلى ناقل بمسكف. وأجرى تعداء بي القياسية. تم تقييم فعالية تعداء بالتدفق الخلوي للخلايا بلات-ه بعد جمع المادة طافية الفيروسية الثانية. (أ)-الممثل التدفق الخلوي المؤامرة. (ب)-رسم بياني يبين نتائج أربع تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تقييم لحالة التمايز بمدمس (A) وبمدكس (ب)- التعبير السطحي بلعم محددة وعلامات النسب الخلية الجذعية تم قياسه بواسطة التدفق الخلوي في اليوم الثامن من الزراعة. كانت بوابات الخلايا الميتة خارجاً على أساس الجانب وخصائص المبعثر إلى الأمام وتلطيخ مع هويشت 33258. النتائج هي الممثل لتجارب مستقلة على الأقل 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: تقييم للتعبير عن PSTPIP2-اجفب و OPAL1-اجفب- الأسفار اجفب في بمدمس (أ) و (ب) بمدكس ريتروفيرالي ترانسدوسيد مع PSTPIP2-اجفب و OPAL1-اجفب بنيات تم قياسه بواسطة التدفق الخلوي في اليوم الثامن من الزراعة. (ج) . رسم بياني يظهر نتائج تجارب مستقلة متعددة. كانت بوابات بمدمس وبمدكس كما في الشكل 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: صور الممثل الضامة، والخلايا الجذعية، وإذ تعرب عن PSTPIP2 أو OPAL1- وقد تصور بمدمس (A) وبمدكس (ب) وإذ تعرب عن PSTPIP2 و OPAL1 بحية مجهرية [كنفوكل] التصوير. ويرد الأسفار اجفب باللون الأخضر على الجانب الأيسر لكل فريق، مشرق حقل الصورة على اليمين. شريط المقياس = 10 ميكرون. النتائج ممثل على الأقل ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التعبير عن بروتين فائدة في الخلايا الهدف خطوة رئيسية في العديد من أنواع الدراسات البيولوجية. الضامة متمايزة والخلايا الجذعية من الصعب أن ترانسفيكت من تعداء القياسية وتقنيات توصيل النسخ العكسي. تجاوز تعداء هذه الخلايا المتمايزة بتوصيل النسخ العكسي من فروعه نخاع العظام، تليها التمايز عندما يقومون بالفعل في بناء المنشود، خطوة حاسمة تسمح التعبير عن كدناس حمل خارج الرحم في هذه أنواع الخلايا. يمكن الاطلاع على مثال للنجاح في استخدام هذا الأسلوب في أعمالنا المنشور مؤخرا25. هنا، نحن نقدم بروتوكول فعالة من حيث التكلفة لتحقيق التعبير مستقرة بناء الاختيار في الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم والضامة باستخدام هذا النهج. الإجراء الذي نقدم نسبيا غير مكلفة وبسيطة، وبعد تحقيق نتائج جيدة جداً. الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول يسمح للاستخدام الروتيني حتى في إطار ميزانية مقيدة نسبيا. يستخدم بروتوكول تعداء بلات-ه بي ككاشف تعداء. بالمقارنة مع غيرها من العوامل الكيميائية تعداء، بي بتكلفة منخفضة جداً، بينما كفاءتها مشابه لأغلبية أخرى تستخدم على نطاق واسع المركبات. ومع ذلك، يمكن الاستعاضة عن بي العديد من الكواشف المتوفرة تجارياً تعداء مختلفة في هذه الخطوة دون أي خسائر في الكفاءة. كمبدأ توجيهي، تنفيذ البروتوكولات تعداء معروفة للعمل مع استخداماً HEK293 الخلايا عادة جيدا مع خلايا ه بلات، أيضا. تدبير آخر للفعالية من حيث التكلفة هو الاستفادة سوبيرناتانتس المحتوية على سيتوكين بدلاً من السيتوكينات المؤتلف المنقي. يتطلب استخدام هذه سوبيرناتانتس بعض التحسين. بيد عندما أنشأ بروتوكول قياسي لإعدادها واتباعها، يصبح التفاوت بين مجموعات فردية من هذه سوبيرناتانتس منخفضة جداً، وعادة ما تتطلب أية تغييرات في العمل تركيزات بين فرادى الكثير. كفاءات التمايز بمدم وبمدك بهذه سوبيرناتانتس في تجربتنا، مطابقة لتنقية السيتوكينات.

بالإضافة إلى توصيل النسخ العكسي، توجد أساليب أخرى راسخة من تعداء الخلايا الثديية، بما في ذلك تعداء الكيميائية (عادة باستخدام الدهون الموجبة أو البوليمرات الموجبة تشكيل المجمعات مع الحمض النووي)، انهانسر واستخدام أنواع أخرى من ناقلات الفيروسية، وأساساً أنظمة أدينوفيرال ولينتيفيرال26،27،28،،من2930. على الرغم من أن التتر عالية جداً والكفاءة يمكن أن يتحقق مع الجين إتش-على أساس التسليم، إعداد والبلازميدات المقابلة والجسيمات الفيروسية أكثر صعوبة واستهلاكا للوقت مما في حالة نظم النسخ العكسي29. وباﻹضافة إلى ذلك، يتسبب إتش استجابة التهاب في الخلايا الجذعية والضامة29،،من3132 والأداء الأمثل في الخلايا المكونة للدم مورين الماوس تحمل سلالة معدلة وراثيا مستقبلات إتش هو المطلوب33. من ناحية أخرى، توليد جسيمات لينتيفيرال تحمل الجينات التي تهم عملية بسيطة نسبيا، وتكاد تكون مطابقة لتلك المستخدمة للفيروسات القهقرية. وعلى النقيض من نواقل النسخ العكسي اكوتروبيك المستخدمة في هذا البروتوكول، lentiviruses قادرة على إصابة الخلايا غير تكاثر الأنواع المتعددة، بما في ذلك البشر34. وهذا قد يكون ميزة هامة في ظروف تجريبية محددة. ومع ذلك، يهدد هذه الميزة أيضا إلى حد كبير سلامة هذه العوامل الناقلة للمرض. وفي رأينا، لإيصال الجينات إلى بمدمس وبمدكس، توفر الجزيئي أفضل توازن الكفاءة والأمان وسهولة الاستخدام. يمكن إعداد بنيات الحمض النووي للفيروس بسهولة باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي قياسية بسيطة. الفيروس هو إنتاج التغليف خطوط الخلايا مباشرة إلى ثقافة طافية وتنقية الفيروسات أخرى ليست ضرورية عادة. الفيروسات القهقرية اكوتروبيك أيضا عدم سهولة تصيب الخلايا البشرية، مما يجعل استخدامها آمنة نسبيا. ومع ذلك، هناك أيضا بعض المساوئ العامة المرتبطة باستخدام نواقل فيروسات النسخ العكسي. العامل الرئيسي الذي يحد من أن تصيب هذه الفيروسات فقط تكاثر الخلايا35. هذه الميزة لا يؤثر كثيرا على البروتوكول هو موضح هنا، بل أنه يحد من نطاق التطبيقات التي يمكن أن تستخدم فيها ناقلات للفيروسات الرجعية. حجم جين الفائدة التي يمكن استنساخ في هذه الناقلة أيضا محدودة وعيار الجسيمات الفيروسية يتناقص مع تزايد حجم إدراج. مع ناقلات بمسكف، وعادة ما تبدأ رؤية آثار إدراج حجم kbp حوالي 3. مع مزيد من الزيادات في حجم إدراج، انخفاض كفاءة الإصابة تدريجيا.

تعداء الكيميائية وانهانسر أسهل استخداماً وأكثر أمنا وأقل استهلاكاً للوقت من أي من الإجراءات المستندة إلى الفيروس26،27،،من2830. ومع ذلك، في بمدمس وبمدكس، أنها يمكن أن تحفز الاستجابات للأحماض النووية الأجنبية31 وأنها تولد الإجهاد أكثر الخلوية. وبالإضافة إلى ذلك، بعض الكواشف الكيميائية تعداء زيادة خلية السيارات-الأسفار التي قد تتداخل مع التدفق الخلوي أو يحلل الفحص المجهري. نظراً لطبيعة عابرة للتعبير، يمكن استخدامها فقط مع بمدمس المتباينة ناضجة أو بمدكس. وفي المقابل، تتكامل بشكل دائم في جينوم الخلايا الهدف تسلسل عرض مع نواقل فيروسات النسخ العكسي وتسمح لتعبير مستقر دائم متوافقة مع مقياس الوقت للتمييز بين بروتوكولات34، 35-ومع ذلك، هذه الميزة يزيد أيضا من خطر الطفرات إينسيرشونال. نظراً لطبيعة التكامل ناقلات عشوائية نسبيا، تقتصر آثارها على إعداد كبيرة من السكان من الخلايا. ومع ذلك، قد تكون مرئية على مستوى الخلايا الفردية. قد تنشأ مشاكل إضافية عند بناء أعرب من ناقل للفيروس يؤثر على الخلايا الجذعية أو التمايز بلعم، مما تسبب في تعطل لتوليد متباينة بمدمس أو بمدكس من فروعه المصابة. إلى حد ما، وهذا قد يمكن التغلب عليها بتعديل شروط العدوى تحقيق مستويات منخفضة من التعبير (على سبيل المثال-، بخفض عيار الفيروس) أو من خلال استخدام نظام تعبير إيندوسيبلي. يسمح استخدام اجفب تنصهر للبروتين من الفائدة أو كمراسل أيضا لفرز الخلايا مع مستوى التعبير المطابق لأهداف التجربة والقيود. وأخيراً، ينبغي أن نذكر أيضا المشاكل المشتركة بين جميع تعداء/نقل الإجراءات. وتشمل هذه التحف overexpression أساسا، مثل البروتين ميسفولدينج، ميسلوكاليزيشن وسمية36. يمكن أن تكون سمية البروتين والسبب لماذا كان من الصعب نسبيا للتعبير عن OPAL1. على سبيل المثال يبين بوضوح أن طبيعة البروتين المعرب عنها يمكن أن تؤثر تأثيراً كبيرا على فعالية هذا الأسلوب. ومع ذلك، وبالرغم من ذلك، كنا قادرين على الحصول على كميات كافية من OPAL1-اجفب التعبير عن خلايا للتحليل المجهري مع هذا الأسلوب، مما يدل على فائدته حتى عند التعامل مع أهداف صعبة. وباﻹضافة إلى ذلك، سيكون من الممكن زيادة النسب المئوية للخلايا ترانسدوسيد بنظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز إذا لزم الأمر بتطبيق معين. يمكن أيضا التغلب على الإصابة بانخفاض الكفاءة جزئيا عن طريق زيادة تركيز الجسيمات الفيروسية باستخدام مختلف أساليب أو أدوات جاهزة للاستخدام. في أيدينا، ثبت أولترافيلتراتيون من المادة الفيروسية طافية على مرشحات الطرد المركزي مع وزن الجزيئي قص الخروج من 100 كاتشين لتوفير أفضل توازن بين الكفاءة والجهد المطلوب.

نخاع العظام المستمدة الضامة، والخلايا الجذعية هي الأدوات المستخدمة على نطاق واسع في علم المناعة بلعمية. وذات الصلة أكثر فسيولوجيا من خطوط الخلايا المتوفرة. يمكن أن تتولد في أرقام عالية نسبيا، وفي الوقت نفسه، تفتقر إلى خاصية عدم التجانس وعدم الاستقرار الوراثي من خطوط الخلايا. هناك ميزة أخرى أن أنهم يمكن أن تتولد من الفئران المعدلة وراثيا دراسة آثار التعديل الوراثي على سكان خلية وفيرة نسبيا ومتجانسة. هذا مفيدة بشكل خاص في دراسات الكيمياء الحيوية، التي تتطلب عادة كميات كبيرة نسبيا من الخلايا. القدرة على ترانسدوسي هذه الخلايا مع ثوابت كدنا يفتح إمكانيات إضافية للبحوث على أساس إعادة تشكيل أو التكامل من العيوب الوراثية في هذه الخلايا وتحليل هيكل-وظيفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل بالتشيكية العلم مؤسسة (جاكر) (المشروع رقم 16-07425S)، تشارلز الجامعة منحة الوكالة (جاك) (رقم المشروع 923116) وعن طريق التمويل المؤسسي من معهد الوراثة الجزيئية، أكاديمية العلوم التشيكية الجمهورية (رفو 68378050).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 For media suplementation
KHCO3 Lachema, Brno, Czech Republic N/A
NH4Cl Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) A9434
Penicillin BB Pharma AS, Prague, Czech Republic N/A PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic N/A
Polyethylenimine, linear, MW 25,000 Polyscience, Warrington, PA, USA 23966
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
PBS Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic N/A
APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 BioLegend (San Diego, CA, USA) 101212 flow cytometry analysis
PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 BioLegend (San Diego, CA, USA) 123110 flow cytometry analysis
APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 BioLegend (San Diego, CA, USA) 117310 flow cytometry analysis
M-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-02
GM-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-03
Hoechst 33258 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA H1398 flow cytometry analysis use at 1-2 µg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
  2. Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
  4. Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
  5. Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
  6. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  7. Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
  8. Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
  9. Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot5080 (2008).
  11. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  12. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  13. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
  14. Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
  15. Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
  16. Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
  17. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
  18. Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
  19. Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
  20. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  21. Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
  22. Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
  23. Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
  24. Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
  25. Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
  26. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960 (2014).
  27. Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766 (2011).
  28. Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
  29. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  30. Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
  31. Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
  32. Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
  33. Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
  34. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
  35. McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
  36. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).

Tags

البيولوجيا، 140 قضية، الخلايا الجذعية، الضامة، والخلايا النقوي، التمايز، وخلايا نخاع العظام مورين، السيتوكينات، M-CSF، GM-CSF، العدوى الفيروسية، البروتين بروتينات فلورية خضراء معلم
تعبير البروتينات الفلورية الانصهار في مورين الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم والضامة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kralova, J., Glatzova, D., Borna,… More

Kralova, J., Glatzova, D., Borna, S., Brdicka, T. Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages. J. Vis. Exp. (140), e58081, doi:10.3791/58081 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter