Summary
In questo articolo, forniamo che un protocollo dettagliato per l'espressione di proteine di fusione fluorescenti nel midollo osseo murino derivate macrofagi e cellule dendritiche. Il metodo si basa sulla trasduzione del midollo osseo progenitrici con retrovirali seguite da differenziazione in macrofagi e dendritiche cellule in vitro.
Abstract
I macrofagi e le cellule dendritiche sono cellule cruciali che formano la prima linea di difesa contro agenti patogeni. Inoltre svolgono i ruoli importanti nell'inizio della risposta immunitaria adattativa. Lavoro sperimentale con queste cellule è piuttosto impegnativo. Loro abbondanza in organi e tessuti è relativamente basso. Di conseguenza, essi non possono essere isolati in gran numero. Essi sono anche difficili a transfect con costrutti di cDNA. Nel modello murino, questi problemi possono essere superati parzialmente da differenziazione in vitro da progenitori di midollo osseo in presenza di M-CSF per i macrofagi o GM-CSF per le cellule dendritiche. In questo modo, è possibile ottenere grandi quantità di queste cellule da pochissimi animali. Inoltre, progenitors del midollo osseo può essere trasdotte con i vettori retrovirali che trasportano cDNA costrutti durante le prime fasi di coltivazione prima della loro differenziazione in macrofagi e cellule dendritiche di derivazione midollare. Così, trasduzione retrovirale seguita da differenziazione in vitro può essere utilizzato per esprimere vari costrutti di cDNA in queste cellule. La capacità di esprimere proteine ectopici sostanzialmente amplia la gamma di esperimenti che possono essere eseguite su queste cellule, compreso formazione immagine di cellule vive di proteine fluorescenti, purificazioni di tandem per Interactoma analisi, analisi struttura-funzione, monitoraggio delle funzioni cellulari con biosensori e molti altri. In questo articolo, descriviamo un protocollo dettagliato per la trasduzione retrovirale di macrofagi e cellule dendritiche del midollo osseo murino derivato con vettori codificanti per proteine fluorescente-etichettate. L'esempio di due proteine adattatrici, OPAL1 e PSTPIP2, dimostriamo la sua applicazione pratica in microscopia e citometria a flusso. Abbiamo anche discutere i vantaggi e le limitazioni di questo approccio.
Introduction
Le cellule mieloidi rappresentano una parte indispensabile dei nostri meccanismi di difesa contro gli agenti patogeni. Essi sono in grado di eliminare rapidamente i microbi, come pure le cellule morte. Inoltre, sono anche coinvolti nella regolazione della riparazione e sviluppo del tessuto e nel mantenimento della omeostasi1,2,3. Tutte le cellule mieloidi differenziano dal comune dei progenitori mieloidi nel midollo osseo. Loro differenziazione in molti funzionalmente e morfologicamente distinti sottoinsiemi è in larga misura controllata da citochine e loro varie combinazioni4. I sottoinsiemi delle cellule mieloidi più intensamente studiati comprendono granulociti neutrofili, macrofagi e cellule dendritiche. Difetti in una qualsiasi di queste popolazioni portare a conseguenze potenzialmente life-threatening e causa gravi disfunzioni del sistema immunitario negli esseri umani e topi1,2,3,5, 6.
A differenza dei granulociti neutrofili, macrofagi e cellule dendritiche sono cellule residenti del tessuto e loro abbondanza negli organi immuni è relativamente basso. Di conseguenza, l'isolamento e la purificazione delle cellule dendritiche primarie e macrofagi per esperimenti che richiedono un gran numero di queste cellule è costoso e spesso impossibile. Per risolvere questo problema, sono stati sviluppati protocolli per ottenere grandi quantità di omogenei macrofagi o cellule dendritiche in vitro. Questi approcci sono basati sulla differenziazione delle cellule del midollo osseo murino in presenza di citochine: fattore distimolazione del macrofago (M-CSF) per i macrofagi e fattore distimolazione del granulocyte-macrofago (GM-CSF) o Flt3 ligand per cellule dendritiche7,8,9,10,11,12. Le cellule generate da questo metodo sono comunemente descritti nella letteratura come derivato del midollo osseo macrofagi (BMDMs) e del midollo osseo derivato le cellule dendritiche (BMDCs). Essi hanno proprietà fisiologiche più in comune con primari macrofagi o cellule dendritiche rispetto con le corrispondenti linee cellulari. Un altro grande vantaggio è la possibilità di ottenere questi formano le cellule geneticamente modificate topi13. Studi di comparativo tra cellule wild-type e cellule derivate da topi geneticamente modificati sono spesso fondamentali per scoprire nuove funzioni dei geni o proteine di interesse.
Analisi della localizzazione subcellulare delle proteine in cellule viventi richiedono l'accoppiamento di un'etichetta fluorescente per la proteina di interesse in vivo. Questo è più comunemente ottenuto esprimendo il costrutto codificato geneticamente fusione composto da una proteina analizzata accoppiata (spesso tramite un linker breve) ad una proteina fluorescente (ad es., verde proteina fluorescente (GFP))14,15 , 16. l'espressione di proteine in cellule dendritiche o i macrofagi fluorescente è impegnativo. Queste cellule sono generalmente difficili a transfect dalle procedure standard di transfezione e le efficienze tendono ad essere molto bassa. Inoltre, la transfezione è transitoria, che genera stress cellulare e raggiunto intensità di fluorescenza potrebbe non essere sufficiente per microscopia17. Al fine di ottenere una frazione ragionevole di queste cellule con un sufficiente livello di espressione del transgene, l'infezione delle cellule progenitrici del midollo osseo con retrovirali vettori e loro successiva differenziazione in BMDMs o BMDCs è diventato un molto efficiente approccio. Ha permesso per l'analisi delle proteine di origine mieloide in ambiente nativo di cellulari, sia in uno stato stabile o durante i processi che sono critici per la risposta immunitaria quali la fagocitosi, la formazione della sinapsi immunologica o la migrazione. Qui, descriviamo un protocollo che permette l'espressione stabile di fluorescente proteine di interesse nel midollo osseo murino derivato macrofagi e cellule dendritiche.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di esperti sul benessere degli animali sperimentali dell'Istituto di genetica molecolare e dall'Accademia delle scienze della Repubblica Ceca.
1. preparazione dei reagenti
- Preparare il tampone ammonio-cloruro-potassio (ACK). Aggiungere 4,145 g di NH4Cl e 0,5 g di KHCO3 a 500 mL di ddH2O, poi aggiungere 100 µ l di 0,5 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e filtro-sterilizzare.
- Preparare la soluzione di polyethylenimine (PEI). Aggiungere 0,1 g di PEI a 90 mL di ddH2O. Continuando a mescolare, aggiungere 1 M HCl goccia a goccia fino a quando il pH è inferiore a 2.0. Mescolare per fino a 3 h fino a PEI è dissolto e poi regolare il pH a 7,2 con NaOH M 1. Regolare il volume a 100 mL con ddH2O e filtro-sterilizzare. Rendere le aliquote di 1 – 2 mL e conservare a-20 ° C.
Nota: Dopo lo scongelamento, PEI può essere conservato a 4 ° C fino a 2 settimane ma non devono essere ricongelati. - Preparare i surnatanti delle cellule contenenti M-CSF o GM-CSF. Questi surnatanti possono essere fatta in anticipo e conservati a-80 ° C. Per rendere questi surnatanti, crescere le cellule producenti citochina (J558 celle per GM-CSF 18 ) o CMG 14-12 per M-CSF 19in un 10cm di Petri in mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) alla confluenza. Quindi trasferire tutte le celle a 200 mL di media nel matraccio di cultura del tessuto di T150 e cultura per ulteriori 4 giorni su 5% CO237 ° C. Raccogliere il surnatante e il filtro nel filtro di sterilizzazione 0,2 µm. Rendere le aliquote e memorizzare questi a-80 ° C.
- Preparare 100 mL di terreno di coltura delle cellule: DMEM supplementato con 10% FBS inattivato di calore e cella surnatanti dalle cellule che secernono GM-CSF (per differenziazione BMDC) o M-CSF (per differenziazione BMDM).
Nota: La quantità di citochine in questi surnatanti può variare e la concentrazione di lavoro deve essere determinata empiricamente. In genere, viene utilizzato 2 – 3% surnatante da linee cellulari produzione di GM-CSF (la concentrazione iniziale consigliata è 2%) o 5 – 10% surnatante da CMG 14 – 12 cellule producendo M-CSF (la concentrazione iniziale consigliata è del 10%). In alternativa, purificato commercialmente disponibile M-CSF a 10 ng/mL e GM-CSF a 20 ng/mL può essere utilizzato con risultati praticamente identiche alla citochina-contenente surnatanti, vale a dire., senza alcun effetto sul tasso di differenziazione, l'efficienza di infezione e localizzazione subcellulare di costrutti con tag EGFP. Antibiotici, compresa la penicillina G (100 UI/mL), streptomicina (100 µ g/mL) e gentamicina (40 µ g/mL), può essere utilizzati per la coltura cellulare in qualsiasi fase del protocollo, salvo indicazione contraria.
2. produzione di Retrovirus
Attenzione: Anche se i vettori retrovirali sono relativamente sicuri rispetto ad altri tipi di vettori virali, pongono ancora un potenziale rischio di sicurezza. Pertanto, è fondamentale per lavorare con la massima cura e adeguati dispositivi di protezione e a rispettare tutte le norme di sicurezza e requisiti legali per l'utilizzo di particelle virali.
- Piastra di una sospensione unicellulare di platino-Eco (Plat-E) cellule di imballaggio in un 10cm di Petri e coltivare in 15 mL di DMEM contenente 10% FBS fino a 50-60% confluenti (24 h). Le cellule devono crescere in un monostrato e non dovrebbero formare grumi nella cultura.
- Pipettare 20 µ g di costrutto retrovirale (ad es., il costrutto che esprimono la proteina fluorescente contrassegnata di interesse nel vettore pMSCV) e 10 µ g di pCL-Eco imballaggi vector20 in 1 mL di DMEM (senza siero e antibiotici) e mescolare delicatamente.
- Un secondo tubo, aggiungere 75 µ l di PEI in 1 mL di DMEM (senza siero e antibiotici). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (TA) e poi mescolare il contenuto di entrambi i tubi e incubare per altri 10 min a TA.
Nota: Aggiunta di pCL-Eco è facoltativa. Si è la codifica per il recettore virale ecotropic e può aumentare il titolo del virus. - Sostituire con attenzione il mezzo sulle cellule di Plat-E con 8 mL di DMEMsupplemented fresco con 2% FBS. Pre-riscaldare il mezzo a 37 ° C prima dell'uso. Non usare antibiotici durante la transfezione, dato che gli antibiotici possono ridurre l'efficienza di trasfezione.
- Con attenzione aggiungere (in gocce) la miscela preparata in Step 2.3 sulle cellule Plat-E e incubare per 4 h a 37 ° C.
- Dopo l'incubazione, scambiare il mezzo sulle cellule di Plat-E per 10 mL di pre-riscaldato DMEM contenente 10% FBS e coltivare le cellule per 24 h a 37 ° C. Durante questa incubazione, Plat-E celle produrrà virus nei mezzi.
- Dopo 24 h, raccogliere il supporto contenente particelle retrovirali da cellule di platino Eco utilizzando una pipetta 5ml e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 15 mL (= "surnatante 1" contenente particelle retrovirali ecotropic).
- Per evitare la contaminazione da cellule di Plat-E nel sovranatante virale, girare il virus raccolto a 1250 × g per 5 min a 4 ° C. Per ottenere risultati ottimali, il virus deve essere utilizzato immediatamente per l'infezione.
Nota: Le aliquote di virus possono anche essere conservate a-80 ° C per un uso successivo. Tuttavia, risulta in certa riduzione nell'efficienza di trasduzione. Evitare congelamento/scongelamento ripetitivo del virus, poiché conduce alla degradazione di virus. - Aggiungere 10 mL di pre-riscaldato DMEM con 10% FBS a Plat-E cellule e coltivare per altre 24 ore a 37 ° C.
- Ripetere i passaggi da 2,7. e 2,8. ottenere "surnatante 2".
3. isolamento delle cellule del midollo osseo murino
- Sacrificare il mouse tramite dislocazione cervicale o altro metodo approvato. Spruzzare il mouse con etanolo al 70%.
- Utilizzando forbici e pinzette, rimuovere la pelle così come parte dei muscoli da zampe posteriori. Sloggiare attentamente l'acetabolo dall'anca senza rompere il femore. Tagliare la zampa nell'articolazione della caviglia. Spruzzare le ossa (femore collegato alla tibia) con etanolo al 70% e rimuovere il resto dei muscoli utilizzando un tovagliolo di carta.
- Mettere le ossa in una capsula Petri 5cm contenente soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS) 2% FBS (PBS-FBS). Se preparando più ossa, tenere la capsula di Petri su ghiaccio fino all'elaborazione.
- Per garantire la sterilità di coltivazione, è necessario eseguire tutti i passaggi seguenti in una cappa di coltura del tessuto.
- Separare il femore dalla tibia senza rompere l'estremità dell'osso (curvatura del ginocchio congiunta e accuratamente tagliati con le forbici).
- Elaborare le ossa uno per uno. Tagliare una piccola parte dei epiphyses (circa 1 – 2 mm) con le forbici mentre si tiene l'osso a pinzette.
- Utilizzare un ago 30 G e un 2 o 5 mL siringa riempita con PBS-FBS per svuotare le cellule del midollo osseo da entrambe le estremità dell'osso in una provetta da centrifuga da 15 mL. Spostare l'ago all'interno dell'osso durante il lavaggio per rimuovere tutte le cellule. Se si ostruisce l'ago, cambiarlo.
Nota: Le ossa dovrebbero girare dal rosso al bianco durante il lavaggio. Questo indica che la maggior parte delle cellule sono stati rimossi dall'osso. Utilizzare circa 2 – 3 mL di PBS-FBS per osso. - Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
- Scartare il surnatante e lisare cellule rosse del sangue di risospendere il pellet in 2,5 mL di tampone ACK per 2 – 3 min a temperatura ambiente. Durante la lisi, filtrare le cellule del midollo osseo attraverso un colino di cella di 100 μm in un tubo di centrifughe fresche 15 mL. Ripristinare la tonicità aggiungendo 12 mL di PBS-FBS.
Nota: Non superare i 5 min di Lisi ipotonica con buffer ACK per evitare la morte cellulare. - Centrifugare immediatamente a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
4. differenziazione delle cellule del midollo osseo nel midollo osseo derivato macrofagi
- Risospendere il pellet di cellule del midollo osseo in DMEM completati con 10% FBS e antibiotici (vedere la nota dopo passo 1.4. per la concentrazione di antibiotica) e contare le celle. Per differenziazione in BM derivate macrofagi, piastra 5 – 10 x 106 di cellule del midollo osseo in un 10cm non-coltura del tessuto trattato Petri (batterica) con 10 mL di pre-preparati media DMEM con siero e M-CSF da passo 1.4.
Nota: La resa di cellule del midollo osseo è circa 4 x 107 per 6 – 8 settimana-vecchio mouse C57BL/6J. - Incubare le cellule in incubatrice della coltura cellulare per 3 giorni su 5% CO2, 37 ° C.
Nota: Durante i primi 2 giorni, le cellule non sembrano molto vitale, come un gran numero di cellule apoptotiche è presente (cellule in grado di differenziarsi in cellule mieloidi e cellule terminalmente differenziate). - Dopo 3 giorni, la coltura delle cellule del midollo osseo comincia a guardare vitale e si formano grappoli di divisione delle cellule. Le cellule aderenti prime possono già essere osservate. A questo punto, integrare le cellule con citochina fresca media.
- Aggiungere 10 mL di pre-riscaldati media DMEM con siero e M-CSF (da passo 1.4) in ogni 10 cm di Petri e restituirlo nell'incubatrice di coltura cellulare. Non c'è nessuna necessità di rimuovere i vecchi media durante questo passaggio.
Nota: i macrofagi del midollo osseo sono completamente differenziati dopo 5 – 7 giorni nella cultura. Il momento migliore per la raccolta è a giorno 6 – 8, dove la maggior parte delle cellule sono aderenti e la capsula di Petri è completamente coperto. - Giorno 5, tener di Petri il cofano di cultura delle cellule e inclinare il piatto fino a quando il supporto è quasi raggiungere il bordo del piatto. Rimuovere con attenzione, 15 mL di media dalla superficie vicino al bordo, e le cellule tendono a rimanere al centro del piatto. Aggiungere lo stesso volume di supporti pre-riscaldati con M-CSF e inserire nuovamente il piatto dell'incubatrice.
Nota: Se il supporto è aspirato lentamente e con attenzione, quasi nessuna cellula vengono persa. Tuttavia, è anche possibile Centrifugare i media aspirati e aggiungere le celle torna alla cultura, per non garantire che nessun non-aderenti (cioè. non completamente differenziate) cellule vengono perse. - Per gli esperimenti, sono utilizzate solo cellule aderenti (macrofagi). Per raccogliere le cellule, il giorno 6 o 7, rimuovere tutti i supporti e cellule galleggiante. Lavare il piatto una volta con PBS preriscaldata senza siero.
- Aggiungere 5 mL di EDTA 0.02% in PBS e incubare per 3 – 5 min a 37 ° C nell'incubatore di coltura del tessuto.
- Utilizzando una pipetta 5ml, rimuovere le cellule dal piatto di un flusso di PBS-EDTA e metterli in una provetta da centrifuga 50 mL con 25 mL di PBS. Se necessario, mettere insieme più piatti.
- Centrifugare immediatamente a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
- Risospendere il pellet di macrofago in media DMEM e contare le celle. Verificare l'espressione di marcatori di superficie differenziazione dei macrofagi (CD11b e F4/80) tramite flusso cytometry.
- Per gli esperimenti che richiedono le cellule in sospensione, ad es., flusso cytometry esperimenti, qPCR o analisi western blot, utilizzare direttamente i macrofagi. Per gli esperimenti con i macrofagi aderenti, piastra le cellule nella piastra di coltura del tessuto secondo la messa a punto sperimentale.
- Le cellule sono già completamente differenziate. Tenerli nei mezzi adatti per l'esperimento previsto o nel supporto di crescita e differenziazione originale con M-CSF.
Nota: Per lavorare con i macrofagi aderenti, trasferirli in una nuova piastra di almeno 6 ore prima dell'uso (idealmente durante la notte) per consentire la piena adesione alla superficie di nuova. La piccola frazione di cellule di galleggiamento può essere rimosso prima di esperimento.
5. midollo osseo differenziazione delle cellule nel midollo osseo derivato le cellule dendritiche
- Seguire il protocollo per BMDMs con regolazioni specifiche per BMDCs descritto sotto ai punti 5.2-5.4.
- Risospendere il pellet ottenuto delle cellule del midollo osseo in DMEMsupplemented con 10% FBS e antibiotici e contare le celle (dal seguente passaggio 4.1 del protocollo dei macrofagi). Per la differenziazione in cellule dendritiche, piastra 1 – 1,5 x 107 cellule di midollo osseo in un 10cm non-coltura del tessuto trattato (batterica) di Petri in 10 mL di pre-preparati media DMEM con siero e GM-CSF (da passo 1.4.).
- La stessa procedura di coltivazione come protocollo BMDM (passi 4.3 – 4.5. del protocollo dei macrofagi). Utilizzare supporti di DMEM con siero e GM-CSF invece di M-CSF. Poiché per BMDCs il tempo di coltivazione è più lungo (in genere 10-12 giorni), aggiungere le alimentazioni supplementari di 1 – 2 a intervalli di 3 giorni (da rimuovere il supernatante e l'aggiunta di un nuovo media di coltivazione come descritto in passaggio 4.5.).
- Questa parte del protocollo è praticamente la stessa come la corrispondente parte del protocollo del macrofago (passi 4.6 – 4,12. del protocollo dei macrofagi). Per gli esperimenti di utilizzare solo le cellule aderenti. Il giorno 10-12, raccogliere le cellule con EDTA, contare e impiattatelo su una nuova superficie. Verificare l'espressione di marcatori di superficie differenziazione delle cellule dendritiche (CD11c +, CD11b +, F4/80-) mediante citometria a flusso.
6. produzione di BMDMs e BMDCs che esprimono la proteina EGFP-tag di interesse
- Risospendere il pellet di cellule del midollo osseo ottenuto nel passo 3.10. in DMEM completati con 10% FBS e antibiotici e contare le celle. Per l'infezione, utilizzare 2 – 5 x 106 delle cellule BM per pozzetto di una cultura di tessuto 6 pozzetti trattati piastra.
- Piastra le cellule in 1 mL di preparato media DMEM al bene, completate con M-CSF per differenziazione in BMDMs o con GM-CSF per la differenziazione nel BMDCs. mantenere le cellule per 4 – 6 h in un'incubatrice di coltura del tessuto con 5% CO2 a 37 ° C.
- Aggiungere 2 mL di virus appena raccolti ("surnatante 1") completati con polybrene (12 µ g/mL, concentrazione finale 8 µ g/mL dopo aggiunta alle cellule).
Nota: Aliquota congelata del surnatante contenenti virus può anche essere utilizzato, ma l'efficacia sarà inferiore. - Centrifugare la piastra a 1.250 x g per 90 min a 30 ° C (con lenta accelerazione e decelerazione). Quindi, incubare per 4 h con 5% CO2 a 37 ° C.
- Opzionale: Sostituire 2 mL di terreno di coltura fresco contenente media rispettiva citochina (M-CSF o GM-CSF) e la cultura con 5% CO2 a 37 ° C. Il secondo giorno, rimuovere 2 mL di terreno di coltura e ripetere la procedura intera infezione (passo 6.3-6.4) con 2 mL di virus appena raccolti ("surnatante 2").
Nota: Questo passaggio potrebbe aumentare l'efficacia di infezione. Miglioramento dopo la seconda infezione dipende la proteina di destinazione e del tipo di cellula e nella nostra esperienza può variare da aumento del 30% in termini di efficienza a nessun miglioramento a tutti. - Raccogliere le cellule non-aderenti, trasferire in una provetta da centrifuga da 15 mL e girare a 500 x g per 5 min (4 ° C). Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di coltura con M-CSF o GM-CSF, posizionare le cellule in un non-tessuto cultura trattata Petri 10cm e coltura a 37 ° C, 5% CO2. Numero ottimale di cellule per un piatto di 10 cm è di 5 – 10 x 106 per macrofagi derivati da BM e 10 – 15 x 106 per BM-derivato delle cellule dendritiche.
Nota: Più piccoli piatti o piastre possono essere utilizzati, ma i numeri delle cellule devono essere regolati di conseguenza. - Segui il macrofago e protocollo di coltivazione e la differenziazione delle cellule dendritiche descritto nel passaggio 4 e 5.
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Representative Results
Proteine adattatrici segnalazione sono solitamente piccole proteine senza alcuna attività enzimatica. Essi possiedono vari domini di interazione o motivi, che mediano il grippaggio ad altre proteine coinvolte nella trasduzione del segnale, tra cui tirosin chinasi, fosfatasi, ubiquitin-ligasi e altri21. Per la dimostrazione delle funzionalità del presente protocollo sono stati selezionati adattatori delle cellule mieloidi, PSTPIP2 e OPAL1. PSTPIP2 è una proteina ben caratterizzata coinvolta nella regolazione della risposta infiammatoria22. È una proteina citoplasmatica che possa anche essere reclutata delle membrane cellulari tramite il dominio di F-bar. Seconda proteina è un adattatore del transmembrane OPAL1, dovuto essere associato con le membrane cellulari. La sua funzione fisiologica è ancora sconosciuta. Tuttavia, nella leucemia linfoblastica acuta, espressione di OPAL1 è associata con migliore prognosi23.
costrutti di cDNA codificanti per PSTPIP2 o OPAL1 fuso tramite un linker breve (iosnfigo tuno o Myc-tag, rispettivamente) per EGFP al C-terminale sono stati clonati nel vettore retrovirale pMSCV usando i metodi standard di clonazione del cDNA. Questo costrutto è stato quindi transfected nelle cellule di Plat-E insieme l'imballaggio vettore pCL-Eco. I surnatanti risultanti contenente retrovirus sono stati utilizzati per la trasduzione di cellule del midollo osseo, seguito dalla differenziazione in BMDMs e BMDCs. L'efficacia di transfezione Plat-E è stata valutata tramite flusso cytometry dopo la raccolta del supernatante contenente virus secondo. Efficienza di trasfezione media era 62% per PSTPIP2-EGFP e 53% per OPAL1 e i risultati sono stati altamente riproducibili (Figura 1A, B). OPAL1 costrutto sembrava essere più tossico per le cellule Plat-E (valutate dall'apparizione di galleggiamento/morire cellule in coltura), conseguente riduzione nella percentuale di cellule trasfettate.
Lo stato di differenziazione di derivazione midollare macrofagi e cellule dendritiche (trasformate con PSTPIP2-EGFP e OPAL1-EGFP retrovirali) è stato valutato da citometria a flusso. Macrofago maturo popolazione è definita dall'espressione di CD11b e F4/80, mentre le cellule dendritiche esprimono il marcatore di lignaggio CD11c. Oltre il 90% delle cellule in entrambi i tipi di cultura erano positivi per i loro rispettivi marcatori (Figura 2A, B). Infine, abbiamo determinato che il livello di espressione di PSTPIP2-EGFP e OPAL1-EGFP costruisce in BMDMs e BMDCs con una misura di citometria a flusso semplice della fluorescenza di EGFP. La percentuale media dei macrofagi EGFP-positivo era 71% per PSTPIP2-EGFP e 62% per OPAL1-EGFP (Figura 3A). In caso di cellule dendritiche, l'efficienza è stata inferiore, 32% per PSTPIP2 e 9% per OPAL1 (Figura 3B). I risultati di esperimenti multipli dimostrano la riproducibilità di questo metodo (Figura 3).
Non siamo in genere a determinare la concentrazione di virus nei surnatanti che usiamo nelle infezioni. Preferiamo usare il virus surnatanti fresco, immediatamente dopo la raccolta, mentre la determinazione del titolo di virus richiede tre giorni supplementari. Di conseguenza, le informazioni sul titolo del virus possono essere ottenute soltanto ex-post. Tuttavia, può ancora essere utile quando si affrontano problemi e questioni tecniche. Di valutare la concentrazione di virus in surnatanti da Plat E le cellule transfected con PSTPIP2-EGFP e OPAL1-EGFP costruisce, abbiamo incubato le cellule NIH 3T3 con diluiti serialmente contenenti virus surnatanti raccolti da queste cellule trasfettate Plat-E e determinato titolo del virus esattamente come descritto da Zjablovskaja et al. , precedentemente pubblicati JoVE articolo24. In tre esperimenti indipendenti, il titolo del virus ha variato da 1.1 x 106 a 4.4 x 106 TU/mL. Non abbiamo osservato le differenze sostanziali tra PSTPIP1-EGFP e costrutti OPAL1-EGFP e tra i surnatanti dal giorno 1 e giorno 2. Quando questi surnatanti sono stati usati per le infezioni delle cellule del midollo osseo secondo il protocollo che stiamo descrivendo in questo articolo, la molteplicità di infezione (MOI) hanno variato da 1.1 a 4.4. È interessante notare che, all'interno di questa gamma, non abbiamo osservato alcuna correlazione tra l'efficienza MOI e infezione.
Nella Figura 4, PSTPIP2-EGFP e OPAL1-EGFP espressa in BMDMs e BMDCs sono state visualizzate mediante microscopia confocale. Completamente differenziati macrofagi e cellule dendritiche hanno una caratteristica forma. Il cambiamento nella morfologia da cellule progenitrici arrotondato piccolo per le grandi cellule di forma irregolare conferma la differenziazione di successo. Nei macrofagi, PSTPIP2 era citoplasmatica con localizzazione parziale alla membrana del plasma. OPAL1 è sembrato essere anche parzialmente mirati alla membrana plasmatica. Il resto è stato probabilmente associato con le membrane intracellulari, quali il complesso di Golgi e reticolo endoplasmatico. Tuttavia, per confermare questa localizzazione, marcatori specifici organello avrebbe dovuto essere usato. In cellule dendritiche, la localizzazione in membrana era meno evidente.
Figura 1: l'efficienza di trasfezione cellulare Plat-E. Per la transfezione delle cellule di Plat-E, due costrutti codifica proteine adattatrici PSTPIP2 e OPAL1 fusa con EGFP (PSTPIP2-EGFP e OPAL1-EGFP) sono stati clonati nel vettore pMSCV. Transfezione di PEI standard è stata effettuata. L'efficacia di transfezione è stata valutata da citometria a flusso delle cellule Plat-E dopo la raccolta del surnatante virale secondo. (A). trama di citometria a flusso rappresentativo. (B). grafico che mostra i risultati dei quattro esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: valutazione dello stato di differenziazione di BMDMs (A) e BMDCs (B). Espressione di superficie di specifici dei macrofagi e cellule dendritiche lignaggio marcatori è stata misurata da citometria a flusso al giorno 8 di coltivazione. Le cellule morte erano gated fuori basato sul loro lato e proprietà di forward scatter e colorazione con Hoechst 33258. I risultati sono rappresentativi di almeno 3 esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: valutazione dell'espressione di PSTPIP2-EGFP e OPAL1-EGFP. Fluorescenza EGFP in BMDMs (A) e BMDCs (B) retrovirally trasformata con costrutti PSTPIP2-EGFP e OPAL1-EGFP è stata misurata da citometria a flusso al giorno 8 di coltivazione. (C) . Grafico che mostra i risultati di esperimenti indipendenti multipli. BMDMs e BMDCs erano gated come in Figura 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: immagini rappresentative dei macrofagi e cellule dendritiche che esprimono PSTPIP2 o OPAL1. BMDMs (A) e BMDCs (B) esprimendo la PSTPIP2 e OPAL1 sono state visualizzate mediante microscopia confocale imaging dal vivo. Fluorescenza di EGFP in verde viene visualizzato sul lato sinistro di ogni pannello, brillante campo immagine sulla destra. Barra della scala = 10 µm. I risultati sono rappresentativi di almeno tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'espressione della proteina di interesse in cellule bersaglio è un passo fondamentale in molti tipi di studi biologici. Differenziate di macrofagi e cellule dendritiche sono difficili a transfect mediante transfezione standard e tecniche di trasduzione retrovirale. Bypassando la transfezione di queste cellule differenziate con retrovirali trasduzione di cellule progenitrici del midollo osseo, seguito da differenziazione quando portano già il costrutto desiderato, è un passo fondamentale che permette l'espressione dei cDNAs ectopico in questi tipi di cellule. Un esempio di riuscito uso di questo metodo può essere trovato nel nostro recente pubblicazione25. Qui, forniamo un protocollo conveniente per raggiungere espressione stabile del costrutto di scelta nelle cellule dendritiche derivate da midollo osseo e nei macrofagi utilizzando questo approccio. La procedura che vi presentiamo è relativamente poco costoso e semplice, ancora fornire risultati molto buoni. I reagenti utilizzati nel presente protocollo consentono per il relativo uso sistematico anche nell'ambito di un bilancio relativamente restrittivo. Il protocollo per la transfezione di Plat-E impiega PEI come reagente di transfezione. Rispetto ad altri agenti chimici transfezione, PEI è di un costo molto basso, mentre la sua efficienza è simile alla maggior parte di altri ampiamente usati composti. Tuttavia, PEI può essere sostituito con molti diversi reagenti di transfezione commercialmente disponibili in questo passaggio senza alcuna perdita di efficienza. Come principio guida, protocolli di transfezione noti funzionino con cellule HEK293 comunemente utilizzate in genere eseguono bene con Plat-E celle, troppo. Un'altra misura ed efficace è l'utilizzo di citochina-contenente i surnatanti invece di citochine ricombinanti purificati. L'uso di questi surnatanti richiede qualche ottimizzazione. Tuttavia, quando il protocollo standard per la loro preparazione è stabilito e seguito, la variabilità tra i singoli lotti di questi surnatanti diventa molto bassa, non richiedenti solitamente nessun cambiamento nella concentrazione tra singoli lotti di lavoro. Le efficienze di differenziazione BMDM e BMDC con questi surnatanti sono, nella nostra esperienza, identica alle citochine purificate.
Oltre alla trasduzione retrovirale, esistono altri metodi consolidati di transfezione di cellule di mammifero, compreso transfezione chimica (in genere utilizzando lipidi cationici o polimeri cationici, formando complessi con il DNA), elettroporazione e l'uso di altri tipi di vettori virali, principalmente sistemi adenoviral e lentivirali26,27,28,29,30. Anche se efficienze e titoli molto alti possono essere realizzate con consegna dell'adenovirus-basato del gene, la preparazione di plasmidi corrispondente e le particelle virali sono più difficile e richiede più tempo nel caso di sistemi retrovirali29. Inoltre, l'adenovirus suscita la risposta infiammatoria in cellule dendritiche e macrofagi29,31,32 e per prestazioni ottimali in cellule ematopoietiche murine del mouse ceppo che trasportano transgenici recettore dell'adenovirus è richiesto33. D'altra parte, la generazione di particelle lentivirali che trasporta il gene di interesse è un processo relativamente semplice, praticamente identico a quello utilizzato per retrovirus. In contrasto con i vettori retrovirali di ecotropic utilizzati nel presente protocollo, sono in grado di infettare le cellule non proliferanti di più specie, compreso gli esseri umani34lentivirus. Questo può essere un vantaggio importante in determinate condizioni sperimentali. Tuttavia, questa caratteristica compromette notevolmente la sicurezza di questi vettori. A nostro parere, per la consegna del gene di BMDMs e BMDCs, retrovirus assicurano il miglior equilibrio tra efficienza, sicurezza e facilità d'uso. DNA retrovirali possono essere facilmente preparati utilizzando semplici tecniche di clonazione molecolare standard. Virus è prodotto da imballaggio le linee cellulari direttamente al surnatante della cultura e ulteriore purificazione di virus di solito non è necessaria. Ecotropic retrovirus anche non facilmente infettare cellule umane, che rende il loro uso relativamente sicuro. Tuttavia, esistono anche alcuni svantaggi generali connessi con l'uso di vettori retrovirali. Il principale fattore limitante è che questi virus infettano solo proliferare cellule35. Questa funzionalità non influisce in modo significativo il protocollo descritto qui, ma limita la gamma di applicazioni dove possono essere utilizzati vettori retrovirali. La dimensione del gene di interesse che può essere clonata in questi vettori è anche limitata e il titolo di particella virale diminuisce all'aumentare della dimensione dell'inserto. Con vettori pMSCV, solitamente iniziamo vedendo gli effetti della dimensione dell'inserto a circa 3 kbp. Con ulteriori aumenti nella dimensione dell'inserto, l'efficienza di infezione diminuisce gradualmente.
La transfezione chimica ed elettroporazione sono più facile da usare, sicuro e richiede meno tempo rispetto a qualsiasi delle procedure basate su virus26,27,28,30. Tuttavia, in BMDMs e BMDCs, possono stimolare le risposte di esteri acidi nucleici31 e generano stress più cellulare. Inoltre, alcuni reagenti di transfezione chimica aumentano auto-fluorescenza cellulare che potrebbe interferire con citometria a flusso o microscopia analizza. A causa della natura transitoria di espressione, può essere utilizzati solo con maturo differenziato BMDMs o BMDCs. Al contrario, le sequenze introdotte con vettori retrovirali sono permanentemente integrate nel genoma delle cellule bersaglio e consentono un'espressione stabile di lunga durata compatibile con la scala di tempo delle differenziazione protocolli34, 35. Tuttavia, questa funzione aumenta anche il rischio di mutagenesi inserzionale. A causa della natura relativamente casuale dell'integrazione vettoriale, suoi effetti su ampie popolazioni di cellule sono limitati. Tuttavia, può essere visibile a livello di singole celle. Ulteriori problemi possono sorgere quando un costrutto espresso dal vettore retrovirale colpisce cellule dendritiche o differenziazione dei macrofagi, con conseguente guasto per generare differenziata BMDMs o BMDCs da progenitori infetti. In una certa misura, questo può essere superato regolando le condizioni di infezione per raggiungere livelli di espressione bassa (ad es., riducendo il titolo del virus) o attraverso l'uso di un sistema di espressione inducibile. L'uso di EGFP fuso alla proteina di interesse o come reporter anche consente l'ordinamento delle cellule con livello di espressione corrispondente ai limiti e obiettivi di esperimento. Infine, citiamo anche problemi comuni a tutte le procedure di transfezione/trasduzione. Questi includono principalmente la sovraespressione manufatti, quali proteina misfolding, mislocalization e tossicità36. Tossicità della proteina potrebbe essere il motivo per cui OPAL1 era relativamente difficile da esprimere. L'esempio illustra chiaramente che la natura della proteina espressa sostanzialmente può influenzare l'efficacia di questo metodo. Tuttavia, nonostante questo, siamo stati in grado di ottenere una quantità sufficiente di OPAL1-EGFP che esprimono le cellule per l'analisi di microscopia con questo metodo, dimostrando la sua utilità anche quando si tratta di obiettivi difficili. Inoltre, sarebbe possibile aumentare le percentuali di cellule trasdotte con FACS ordinamento se richiesto da una particolare applicazione. L'efficienza di infezione basso può anche essere parzialmente superato aumentando la concentrazione di particelle virali utilizzando vari metodi o kit pronti per l'uso. Nelle nostre mani, ultrafiltrazione del surnatante virale il filtro centrifugo con un peso molecolare tagliare fuori di 100 kDa ha dimostrato di fornire il miglior equilibrio tra efficienza e sforzo richiesto.
Midollo osseo derivato i macrofagi e le cellule dendritiche sono strumenti ampiamente utilizzati nel campo dell'immunologia del fagocita. Essi sono più fisiologicamente rilevanti rispetto a linee cellulari disponibili. Essi possono essere generati nei numeri relativamente alti e, allo stesso tempo, manca la caratteristica eterogeneità e instabilità genetica delle varietà di cellula. Un altro vantaggio è che possono essere generate da topi geneticamente modificati per studiare gli effetti di modificazione genetica di una popolazione di cellule relativamente abbondante e omogeneo. Ciò è particolarmente utile in studi biochimici, dove sono in genere necessari relativamente grandi quantità di cellule. La capacità di queste cellule con costrutti di cDNA di trasdurre apre ulteriori possibilità di ricerca basato sulla ricostituzione o complementazione di difetti genetici in queste cellule e analisi struttura-funzione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da Ceca Science Foundation (GACR) (progetto numero 16-07425S), di Charles University Grant Agency (GAUK) (progetto numero 923116) e di finanziamento istituzionale da Istituto di genetica molecolare, Accademia delle scienze della Repubblica Ceca Repubblica (RVO 68378050).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/mL |
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