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Expression des protéines de Fusion Fluorescent en Murine dérivés de la moelle osseuse des cellules dendritiques et Macrophages

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58081
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1
1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

Summary

Dans cet article, nous fournissons qu'un protocole détaillé pour l’expression des protéines de fusion fluorescent murin de moelle osseuse provenant des macrophages et les cellules dendritiques. La méthode est basée sur la transduction de la moelle osseuse progéniteurs avec constructions retroviral suivies de différenciation en macrophages et dendritiques des cellules in vitro.

Abstract

Les macrophages et les cellules dendritiques sont des cellules cruciales qui forment la première ligne de défense contre les agents pathogènes. Ils jouent également un rôle important dans le déclenchement d’une réponse immunitaire adaptative. Des travaux expérimentaux avec ces cellules sont plutôt difficile. Leur abondance dans les organes et les tissus est relativement faible. Ainsi, ils ne peuvent pas être isolés en grand nombre. Ils sont également difficiles à transfecter constructions d’ADNc. Dans le modèle murin, ces problèmes peuvent être partiellement résolus par in vitro la différenciation des progéniteurs de la moelle osseuse en présence de M-CSF pour les macrophages ou GM-CSF pour les cellules dendritiques. De cette façon, il est possible d’obtenir de grandes quantités de ces cellules de très peu d’animaux. En outre, les cellules souches de la moelle osseuse peuvent être transduites avec des vecteurs rétroviraux transportant des constructions de l’ARNC durant les premiers stades de la culture avant leur différenciation dans la moelle osseuse provenant de cellules dendritiques et macrophages. Ainsi, transduction rétrovirale, suivie par la différenciation in vitro peut être utilisée pour exprimer les diverses constructions de cDNA dans ces cellules. La capacité d’exprimer les protéines ectopiques considérablement élargit sa gamme d’expériences qui peuvent être effectuées sur ces cellules, y compris l’imagerie de cellules vivantes de protéines fluorescentes, des purifications en tandem pour les analyses de l’interactome, analyses de la structure-fonction, le contrôle des fonctions cellulaires avec biocapteurs et bien d’autres. Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé pour la transduction rétrovirale du murin de la moelle osseuse provenant de cellules dendritiques et macrophages avec vecteurs codant pour des protéines fluorescent-étiquetées. L’exemple de deux protéines d’adaptateur, OPAL1 et PSTPIP2, nous démontrons son application pratique en cytométrie en flux et en microscopie. Nous discuterons les avantages et les limites de cette approche.

Introduction

Cellules myéloïdes représentent un élément indispensable de nos mécanismes de défense contre les agents pathogènes. Ils sont capables d’éliminer rapidement les microbes, mais aussi les cellules mourantes. En outre, ils sont également impliqués dans la régulation de réparation et développement des tissus et dans le maintien de l’homéostasie du1,2,3. Toutes les cellules myéloïdes différencient des progéniteurs myéloïdes communs dans la moelle osseuse. Leur différenciation en plusieurs sous-ensembles distincts morphologiquement et fonctionnellement est largement contrôlée par les cytokines et leurs diverses combinaisons4. Les sous-ensembles de cellules myéloïdes plus intensivement étudiés incluent les granulocytes neutrophiles, les macrophages et les cellules dendritiques. Défauts dans l’une de ces populations mènent à des conséquences potentiellement mortelles et cause de graves dysfonctionnements du système immunitaire chez l’homme et la souris1,2,3,5, 6.

À la différence des granulocytes neutrophiles, les macrophages et les cellules dendritiques sont des cellules résidentes des tissus et leur abondance dans les organes du système immunitaire est relativement faible. Ainsi, l’isolation et la purification de cellules dendritiques primaires et les macrophages pour les expériences nécessitant un grand nombre de ces cellules est coûteux et souvent impossible. Pour résoudre ce problème, les protocoles ont été développés afin d’obtenir de grandes quantités de homogènes macrophages ou cellules dendritiques in vitro. Ces approches sont basées sur la différenciation des cellules de la moelle épinière murine en présence de cytokines : and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) pour les macrophages et le facteur stimulant les colonies de granulocytes et macrophages (GM-CSF) ou Flt3 ligand pour les cellules dendritiques7,8,9,10,11,12. Cellules générées par cette méthode sont couramment décrits dans la littérature, comme la moelle osseuse provenant des macrophages (BMDMs) et dérivés de la moelle osseuse des cellules dendritiques (BMDCs). Elles ont des propriétés physiologiques plus en commun avec le primaires macrophages ou cellules dendritiques qu’avec des lignées de cellules correspondantes. Un autre avantage majeur est la possibilité d’obtenir ces forment des cellules génétiquement modifiées souris13. Études de comparatif entre les cellules de type sauvage et cellules dérivées des souris génétiquement modifiées sont souvent essentiels pour découvrir nouvelles fonctions des gènes ou des protéines d’intérêt.

Analyse de localisation sous-cellulaire des protéines dans les cellules vivantes exige que l’accouplement d’un label fluorescent à la protéine d’intérêt in vivo. Ceci est plus souvent réalisé en exprimant construct génétiquement encodé fusion composé d’une protéine analysée couplée (souvent via un linker court) à une protéine fluorescente (e.g., green fluorescent protein (GFP))14,15 , 16. il est difficile de l’expression des protéines fluorescent étiquetées dans les cellules dendritiques ou les macrophages. Ces cellules sont généralement difficiles à transfecter de procédures standard de transfection et l’efficacité ont tendance à être très faible. En outre, la transfection est transitoire, il génère le stress cellulaire et atteints d’intensité de la fluorescence pourrait ne pas suffire pour microscopie17. Afin d’obtenir une fraction raisonnable de ces cellules avec un niveau suffisant d’expression du transgène, l’infection des cellules souches de la moelle osseuse avec retroviral vecteurs et leur différenciation ultérieure en BMDMs ou BMDCs est devenu un très efficace approche. Il a laissé pour l’analyse des protéines d’origine myéloïde dans leur environnement natif de cellulaire, aussi bien dans un état stable ou au cours de processus qui sont essentiels pour le système immunitaire comme la phagocytose, la formation des synapses immunologiques ou la migration. Nous décrivons ici un protocole qui permet l’expression stable des protéines fluorescent étiquetés d’intérêt dans les macrophages murins médullaire dérivé et les cellules dendritiques.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité d’experts sur le bien-être des animaux d’expérimentation de l’Institut de génétique moléculaire et de l’Académie des Sciences de la République tchèque.

1. préparation du réactif

  1. Préparer le tampon chlorure d’ammonium-potassium (ACK). Ajouter 4,145 de NH4Cl et 0,5 g de KHCO3 à 500 mL de ddH2O, puis ajouter 100 µL de 0,5 M d’acide tétraacétique (EDTA) et filtre-stériliser.
  2. Préparer la solution polyéthylènimine (PEI). Ajouter 0,1 g de PEI à 90 mL de ddH2O. Tout en agitant, ajouter goutte à goutte 1 M HCl jusqu'à ce que le pH est inférieur à 2.0. Remuer pendant 3 h jusqu'à ce que le PEI est dissoute et ensuite ajuster le pH à 7,2 avec 1 NaOH M. Réglez le volume à 100 mL avec FD2O et filtre-stériliser. Faire des portions de 1 à 2 mL et conserver à-20 ° C.
    NOTE : Après décongélation, PEI peut être stocké à 4 ° C pendant 2 semaines, mais il ne doit pas être ré-congelé.
  3. Préparer les surnageants de culture de cellules contenant du M-CSF ou GM-CSF. Ces surnageants peuvent être faites à l’avance et stockées à-80 ° C. Pour rendre ces surnageants, poussent les cellules productrices de cytokines (cellules J558 pour GM-CSF 18 ) ou des cellules CMG 14-12 pour le M-CSF 19dans une boîte de Pétri dans le milieu de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % sérum fœtal (SVF) de 10 cm à la confluence. Puis transférez toutes les cellules à 200 mL de médias à T150 flacon de culture de tissus et de la culture pour les journées supplémentaires de 4 à 5 % de CO237 ° C. Récupérer le surnageant et le filtre sur filtre de stérilisation 0,2 µm. Faire des aliquotes et stocker à-80 ° C.
  4. Préparation de 100 mL de milieu de culture cellulaire : DMEM supplémenté de 10 % inactivé FBS de chaleur et les surnageants de culture de cellules sécrétrices de GM-CSF (pour la différenciation BMDC) ou M-CSF (pour la différenciation BMDM) de cellules.
    Remarque : Le montant des cytokines dans les surnageants de ces peut varier et la concentration de travail doit être déterminée empiriquement. En général, 2 à 3 % de surnageant de lignées de cellules productrices de GM-CSF (la concentration de départ recommandée est de 2 %) ou 5 à 10 % de surnageant de CMG 14 – 12 cellules produisant M-CSF (la concentration de départ recommandée est de 10 %) est utilisée. Alternativement, purifiées commercialement disponible M-CSF à 10 ng/mL et GM-CSF à 20 ng/mL peuvent être utilisé avec résultats pratiquement identiques à la cytokine contenant les surnageants, i.e., sans aucun effet sur le taux de différenciation, efficacité de l’infection et la localisation sous-cellulaire des constructions EGFP-tag. Antibiotiques, y compris la pénicilline G (100 UI/mL), streptomycine (100 µg/mL) et gentamicine (40 µg/mL), peuvent être utilisés pour la culture cellulaire à n’importe quelle étape du protocole, sauf indication contraire.

2. production des rétrovirus

ATTENTION : Bien que les vecteurs rétroviraux sont relativement sûrs par rapport à d’autres types de vecteurs viraux, ils représentent toujours un risque de sécurité potentiel. Par conséquent, il est essentiel de travailler avec le plus grand soin et l’équipement de protection approprié et de respecter toutes les consignes de sécurité et les exigences légales pour travailler avec des particules virales.

  1. Une suspension monocellulaire de cellules emballage Platinum-Eco (Plat-E) dans une boîte de Pétri de 10 cm sur plaque et cultiver dans 15 mL de DMEM contenant 10 % FBS jusqu'à 50-60 % anastomosé (24h). Les cellules devraient croître en une monocouche et ne devraient pas constituer des touffes dans la culture.
  2. Pipette 20 µg d’antirétrovirale construction (p. ex.., la construction exprimant la protéine fluorescent étiquetée d’intérêt dans le vecteur pMSCV) et 10 µg de pCL-Eco Emballages vector20 dans 1 mL de DMEM (sans sérum et antibiotiques) et mélanger doucement.
  3. Dans un deuxième tube, ajouter 75 µL d’Î.-P.-É. dans 1 mL de DMEM (sans sérum et antibiotiques). Incuber 5 min à température ambiante (RT) puis mélanger le contenu de deux tubes et incuber pendant supplémentaire 10 min à température ambiante.
    Remarque : L’ajout de pCL-Eco est facultatif. Il est codant pour le récepteur viral ecotropic et peut augmenter le titre du virus.
  4. Replacez délicatement le support sur les cellules de Plat-E 8 ml de DMEMsupplemented frais avec 2 % FBS. Réchauffez le milieu à 37 ° C avant utilisation. N’utilisez pas d’antibiotiques au cours de la transfection, étant donné que les antibiotiques peuvent réduire l’efficacité de transfection.
  5. Soigneusement ajouter (en gouttes) le mélange préparé à l’étape 2.3 sur les cellules de Plat-E et incuber pendant 4 h à 37 ° C.
  6. Après l’incubation, change le milieu sur les cellules de Plat-E pour 10 mL de préchauffé DMEM contenant 10 % FBS et cultiver les cellules pendant 24 h à 37 ° C. Durant cette incubation, cellules Plat-E produira des virus dans les médias.
  7. Après 24h, recueillir le milieu contenant des particules rétrovirales de platine Eco de cellules à l’aide d’une pipette de 5 mL et transférez-le dans un tube à centrifuger 15 mL (= « surnageant 1 » contenant des particules rétrovirales ecotropic).
  8. Pour éviter toute contamination par des cellules de Plat-E dans les surnageants de virales, filer le virus prélevé à 1250 × g pendant 5 min à 4 ° C. Pour des résultats optimaux, le virus doit être utilisé immédiatement pour l’infection.
    NOTE : Conserver des portions de virus peuvent également être stockées à-80 ° C pour une utilisation ultérieure. Toutefois, il entraînera certaine réduction dans l’efficacité de la transduction. Éviter le gel/dégel répété du virus, car elle conduit à la dégradation de virus.
  9. Ajouter 10 mL de préchauffé DMEM avec 10 % de cellules de FBS à Plat-E et cultiver un autre 24 h à 37 ° C.
  10. Répétez les étapes 2,7. et 2.8. pour obtenir la « surnageant 2 ».

3. isolement de cellules de moelle épinière murin

  1. Sacrifier la souris à l’aide de dislocation cervicale ou autre moyen agréé. Vaporiser la souris avec l’éthanol à 70 %.
  2. Avec des ciseaux et pinces à épiler, retirez la peau ainsi qu’une partie des muscles postérieurs. Soigneusement déloger l’acetabulum de l’articulation de la hanche sans casser le fémur. Couper la patte dans l’articulation de la cheville. Vaporiser les os (fémur connecté au tibia) d’éthanol à 70 % et supprimer le reste des muscles à l’aide d’une serviette en papier.
  3. Placer les os dans un plat de Pétri de 5 cm contenant saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) avec 2 % SVF (PBS-FBS).  Si vous préparez plusieurs OS, garder la boîte de Pétri sur la glace jusqu'à ce que les traités.
  4. Pour assurer la stérilité de la culture, effectuer toutes les étapes suivantes dans une hotte de culture de tissus.
  5. Séparer le fémur du tibia sans casser les extrémités des os (flexion du genou conjointe et soigneusement coupé avec des ciseaux).
  6. Traiter les os un par un. Couper une partie infime des épiphyses (environ 1 à 2 mm) avec des ciseaux tout en maintenant l’os dans la pince à épiler.
  7. Utiliser une aiguille de 30 G et une 2 ou 5 mL seringue remplie de PBS-FBS afin d’éliminer les cellules de la moelle osseuse des deux extrémités de l’os dans un tube à centrifuger 15 mL. Déplacer l’aiguille à l’intérieur de l’os au cours de la chasse d’eau afin d’éliminer toutes les cellules. Si l’aiguille du colmatage, changez-le.
    Remarque : OS devrait tourner du rouge au blanc pendant le rinçage. Cela indique que la majorité des cellules ont été retirée de l’OS. Utiliser environ 2 – 3 mL de PBS-FBS / OS.
  8. Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
  9. Jeter le surnageant et lyser les globules rouges par resuspendant le culot dans 2,5 mL de tampon ACK pour 2 à 3 min à température ambiante. Lors de la lyse, filtrer les cellules de la moelle osseuse à travers un tamis de cellule de 100 μm dans un tube de centrifug frais 15 mL. Restaurer la tonicité en ajoutant 12 mL de PBS-FBS.
    Remarque : Ne dépassez pas 5 min de lyse hypotonique avec tampon ACK pour éviter la mort des cellules.
  10. Centrifuger immédiatement à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.

4. moelle osseuse la différenciation des cellules dans la moelle osseuse provenant des Macrophages

  1. Resuspendre le culot de cellules de moelle osseuse en DMEM additionné de 10 % FBS et antibiotiques (voir la remarque après étape 1.4. pour la concentration d’antibiotique) et compter les cellules non vides. Pour une différenciation BM dérivées des macrophages, plaque 5-10 x 106 des cellules de moelle osseuse dans une 10 cm sans tissue culture traitée (bactérienne) boîte de Pétri avec 10 mL de médias DMEM préalablement préparés avec du sérum et de M-CSF étape 1.4.
    Remarque : Le rendement des cellules de la moelle osseuse est environ 4 x 107 par semaine 6 – 8-vieille souris C57BL/6J.
  2. Incuber les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 3 jours à 5 % CO2, 37 ° C.
    Remarque : Durant les 2 premiers jours, les cellules ne regardent pas très vitales, comme un grand nombre de cellules apoptotiques est actuellement (cellules incapables de se différencier en cellules myéloïdes et cellules différenciées en phase terminale).
  3. Après 3 jours, la culture de cellules de moelle osseuse commence à regarder vital et sont forment des amas de cellules en division. Premières cellules adhérentes peuvent déjà être observées. À ce stade, compléter les cellules avec les médias de cytokine fraîches.
  4. Ajouter 10 mL de médias DMEM pré chauffées avec du sérum et de M-CSF (de l’étape 1.4) dans chaque boîte de Pétri de 10 cm et retournez-le dans l’incubateur de culture cellulaire. Il n’y a aucun besoin d’enlever les anciens médias au cours de cette étape.
    Remarque : les macrophages de la moelle osseuse sont entièrement différenciés après 5 à 7 jours de culture. Le meilleur moment pour la récolte est à jour est complètement recouverte de 6 – 8, où la majorité des cellules sont adhérents et la boîte de Pétri.
  5. Au jour 5, prendre la boîte de Pétri dans la hotte de culture cellulaire et incliner le plat jusqu'à ce que les médias presque atteint le bord du plat. Retirez soigneusement 15 mL des médias de la surface près du bord, et les cellules ont tendance à rester au milieu du plat. Ajouter le même volume de médias préchauffés avec M-CSF et remettez le plat dans l’incubateur.
    Remarque : Si le média est aspiré lentement et soigneusement, presque aucune cellule n’est perdus. Toutefois, il est également possible de centrifuger les médias aspirés et rajouter les cellules à la culture, pour s’assurer qu’aucun non adhérents (i.e., incomplètement différenciés) cellules sont perdues.
  6. Pour les expériences, uniquement des cellules adhérentes (macrophages) sont utilisés. Pour récolter les cellules, 6 ou 7 jours, enlever toutes les cellules flottantes et les médias. Laver le plat une fois avec du PBS préchauffé sans sérum.
  7. Ajouter 5 mL d’EDTA de 0,02 % dans du PBS et incuber pendant 3 à 5 min à 37 ° C dans l’incubateur de culture de tissus.
  8. À l’aide d’une pipette de 5 mL, enlever les cellules de la capsule par un flux de PBS-EDTA et les placer dans un tube à centrifuger 50 mL avec 25 mL de PBS. Si besoin, regrouper plusieurs plats.
  9. Centrifuger immédiatement à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
  10. Resuspendre le culot de macrophages en milieu DMEM et compter les cellules non vides. Vérifier l’expression des marqueurs de différenciation surface du macrophage (CD11b et F4/80) par cytométrie en flux.
  11. Pour les expériences nécessitant les cellules en suspension, par exemple., flow cytometry expériences, qPCR ou analyse par western blot, utiliser les macrophages directement. Des expériences avec des macrophages adhérentes, plaque les cellules de la plaque de culture de tissu selon le montage expérimental.
  12. Les cellules sont déjà entièrement différenciés. Gardez-les dans les médias appropriés pour l’expérience prévue ou dans les médias originales de croissance et de différenciation avec le M-CSF.
    Remarque : Pour travailler avec des macrophages adhérentes, transférez-les dans une nouvelle plaque au moins 6 h avant utilisation (idéalement une nuit) afin de permettre l’adhésion complète à la nouvelle surface. La petite fraction de flottement des cellules peut être retirée avant l’expérience.

5. moelle osseuse la différenciation des cellules dans la moelle osseuse provenant de cellules dendritiques

  1. Suivre le protocole pour BMDMs avec les ajustements spécifiques pour BMDCs étapes 5.2 à 5.4 décrites ci-dessous.
  2. Resuspendre le culot obtenu des cellules de moelle osseuse en DMEMsupplemented avec 10 % de BF et d’antibiotiques et de compter les cellules (en suivant étape 4.1 du protocole de macrophages). Pour la différenciation en cellules dendritiques, plaque 1 – 1.5 x 107 cellules de moelle osseuse dans une 10 cm non-culture de tissus traités Pétri (bactérienne) dans 10 mL de médias DMEM préalablement préparés avec du sérum et GM-CSF (de l’étape 1.4.).
  3. Suivez les mêmes étapes de culture comme protocole BMDM (étapes 4.3 – 4,5. Protocole de macrophages). Utiliser les médias DMEM avec du sérum et GM-CSF, au lieu de M-CSF. Étant donné que pour BMDCs le temps de culture est plus long (généralement 10 à 12 jours), ajouter 1 à 2 tétées supplémentaires dans les 3 jours d’intervalle (en enlevant le surnageant et ajout d’un nouveau média de culture tel que décrit dans l’étape 4.5.).
  4. Cette partie du protocole est pratiquement identique à la partie correspondante du protocole macrophage (étapes 4,6 – 4.12. Protocole de macrophages). Pour des expériences utilisent uniquement des cellules adhérentes. Jour 10-12, recueillir les cellules à l’aide d’EDTA, compter et leur plaque sur une nouvelle surface. Vérifier l’expression des marqueurs de surface de la différenciation des cellules dendritiques (CD11c +, CD11b + F4/80-) par cytométrie en flux.

6. la production de BMDMs et BMDCs exprimant EGFP-tag protéine d’intérêt

  1. Resuspendre le culot de cellules de moelle osseuse a obtenu en étape 3.10. en DMEM additionné de 10 % de BF et d’antibiotiques et de compter les cellules non vides. Pour l’infection, utiliser 2 – 5 x 106 cellules BM / puits d’une culture de tissu de 6 puits traités plaque.
  2. Plaque les cellules dans 1 mL de médias DMEM préparés par complétée, soit avec M-CSF pour la différenciation en BMDMs GM-CSF à la différenciation dans BMDCs. garder les cellules pendant 4 à 6 h dans un incubateur de culture tissulaire avec 5 % de CO2 à 37 ° C.
  3. Ajouter 2 mL de virus fraîchement prélevé (« surnageant 1 ») additionné de polybrene (12 µg/mL, la concentration finale 8 µg/mL après addition aux cellules).
    Remarque : L’aliquote congelé du surnageant contenant le virus peut également être utilisé, mais l’efficacité sera plus faible.
  4. Centrifuger la plaque à 1 250 g pendant 90 min à 30 ° C (avec lente accélération et de décélération). Puis, incuber pendant 4 h avec 5 % de CO2 à 37 ° C.
  5. Facultatif : Remplacer 2 mL de la culture médiatique avec frais cytokine respectif contenant moyenne (M-CSF ou GM-CSF) et de la culture avec 5 % de CO2 à 37 ° C. Le deuxième jour, prélever 2 mL de milieu de culture et répéter la procédure de toute infection (étape 6.3 – 6,4) avec 2 mL de virus fraîchement prélevés (« surnageant 2 »).
    Remarque : Cette étape peut augmenter l’efficacité de l’infection. Amélioration après que la deuxième infection est dépendante de la protéine cellulaire de type et de la cible et à notre expérience peut varier d’augmentation de 30 % en efficacité à aucune amélioration du tout.
  6. Recueillir les cellules non adhérentes, transférer dans un tube à centrifuger 15 mL et essorage à 500 g pendant 5 min (4 ° C). Jeter le surnageant.
  7. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de culture avec M-CSF ou GM-CSF, placer les cellules dans une boite de Petri traitée 10 cm sans culture tissulaire et de la culture à 37 ° C, 5 % de CO2. Nombre optimal de cellules pour un plat de 10 cm est 5-10 x 106 pour les dérivés de monocytes BM et 10 – 15 x 106 cellules dendritiques dérivées de BM.
    NOTE : Petits plats ou assiettes peuvent être utilisés, mais le nombre de cellules doit être ajusté en conséquence.
  8. Suivez le macrophage et protocole de culture et de la différenciation des cellules dendritiques décrit à l’étape 4 et 5.

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Representative Results

Protéines de signalisation adaptateur sont habituellement petites protéines sans aucune activité enzymatique. Ils possèdent différents domaines d’interaction ou les motifs et qui médient liaison à d’autres protéines impliqués dans la transduction des signaux, y compris les tyrosines kinases, phosphatases, ubiquitine ligases et autres21. Pour la démonstration des fonctionnalités de ce protocole, adaptateurs de cellules myéloïdes PSTPIP2 et OPAL1 ont été sélectionnés. PSTPIP2 est un bien caractérisé protéines impliquées dans la régulation de la réponse inflammatoire22. C’est une protéine cytoplasmique qui peut également être recrutée aux membranes cellulaires par l’intermédiaire de son domaine de F-bar. Deuxième protéine est un adaptateur transmembranaire OPAL1, devrait être associée aux membranes cellulaires. Sa fonction physiologique est encore inconnue. Toutefois, dans la leucémie aiguë lymphoblastique, expression de OPAL1 est associée avec le meilleur pronostic23.

constructions de cDNA codant pour PSTPIP2 ou OPAL1 fusionnées via un linker court (GSGGGS ou Myc-tag, respectivement) à EGFP à l’extrémité C-terminale ont été clonés dans le vecteur rétroviral pMSCV à l’aide de méthodes normalisées de clonage d’ADNc. Cette construction a été ensuite transfectée dans des cellules de Plat-E ainsi que l’emballage vectorielles pCL-Eco. Les surnageants résultantes contenant les rétrovirus ont été utilisés pour la transduction des cellules de moelle osseuse, suivie par la différenciation en BMDMs et BMDCs. L’efficacité de la transfection de Plat-E a été évaluée par cytométrie en flux après la collecte du deuxième surnageant contenant le virus. Efficacité de transfection moyenne a été de 62 % pour PSTPIP2-EGFP et 53 % pour OPAL1 et les résultats étaient très reproductible (Figure 1 a, B). Construction de OPAL1 semble être plus toxique pour les cellules de Plat-E (évaluées par l’apparition de cellules flottant/mourant en culture), conduisant à une réduction des pourcentages de cellules transfectées.

État de différenciation des macrophages de la moelle osseuse provenant des cellules dendritiques (transduites avec constructions rétrovirales PSTPIP2-EGFP et OPAL1-EGFP) a été mesurée par cytométrie. Macrophage mature population est définie par l’expression CD11b et F4/80, tandis que les cellules dendritiques expriment le marqueur de lignée CD11c. Plus de 90 % des cellules dans les deux types de culture étaient positifs pour les marqueurs respectifs (Figure 2 a, B). Enfin, nous avons déterminé que le niveau d’expression de la PSTPIP2-EGFP et OPAL1-EGFP construit dans BMDMs et BMDCs par une mesure de cytométrie de flux simple de fluorescence EGFP. Le pourcentage moyen des macrophages positifs EGFP est 71 % pour PSTPIP2-EGFP et 62 % pour OPAL1-EGFP (Figure 3 a). Dans le cas des cellules dendritiques, l’efficacité était inférieure, soit 32 % de PSTPIP2 et 9 % pour OPAL1 (Figure 3 b). Les résultats de plusieurs expériences démontrent la reproductibilité de cette méthode (Figure 3).

En général, nous ne déterminent pas la concentration de virus dans les surnageants que nous utilisons dans les infections. Nous préférons utiliser le virus surnageants frais, immédiatement après le prélèvement, tandis que la détermination du titre virus requiert trois jours supplémentaires. Par conséquent, les informations sur le titre de virus ne peuvent être obtenues posteriori. Toutefois, il peut toujours être utile quand on aborde les problèmes et les questions techniques. Pour évaluer la concentration de virus dans les surnageants de Plat E des cellules transfectées avec PSTPIP2-EGFP et OPAL1-EGFP construit, nous avons incubé NIH-3 t 3 cellules avec les surnageants en série dilués contenant le virus prélevés dans ces cellules transfectées de Plat-E et titre de virus a déterminé exactement comme décrit par Zjablovskaja et al. à l’article24de le JoVE publiées antérieurement. Dans trois expériences indépendantes, le titre virus varie de 1,1 × 106 à 4,4 x 106 TU/mL. Nous n’avons pas observé des différences substantielles entre PSTPIP1-EGFP et constructions OPAL1-EGFP et entre les surnageants du jour 1 et jour 2. Lorsque ces surnageants ont été utilisés pour des infections de cellule de moelle osseuse selon le protocole, nous décrivons dans cet article, la multiplicité d’infection (MOI) varie entre 1.1 et 4.4. Fait intéressant, dans cet intervalle, on n’a pas observé une quelconque corrélation entre MOI et l’infection de l’efficacité.

Dans la Figure 4, PSTPIP2-EGFP et OPAL1-EGFP exprimée en BMDMs et BMDCs ont été visualisées par microscopie confocale. Complètement différenciées les macrophages et les cellules dendritiques ont une forme caractéristique. Le changement dans la morphologie de cellules progénitrices arrondis petites à grandes cellules de formes irrégulières confirme la différenciation réussie. Dans les macrophages, PSTPIP2 était cytoplasmique avec une localisation partielle à la membrane plasmique. OPAL1 semble viser également partiellement à la membrane plasmique. Le reste a été susceptibles d’être associé aux membranes intracellulaires, tels que le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi. Toutefois, afin de confirmer cette localisation, marqueurs d’organite spécifique devra être utilisé. Dans les cellules dendritiques, la localisation de membrane a été moins apparente.

Figure 1
Figure 1 : efficacité de la transfection de cellules de Plat-E. Pour la transfection de cellules de Plat-E, deux constructions codant des PROTEINES adaptateur PSTPIP2 et OPAL1 fusionnés avec EGFP (PSTPIP2-EGFP et OPAL1-EGFP) ont été clonées dans le vecteur pMSCV. Transfection de PEI standard a été effectuée. L’efficacité de la transfection a été évaluée par cytométrie de flux des cellules Plat-E après la collecte du deuxième surnageant viral. (A). terrain de cytométrie en flux représentatif. (B). graphique montrant des résultats de quatre expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : évaluation de l’état de différenciation des BMDMs (A) et BMDCs (B). Expression à la surface des macrophages spécifiques et des marqueurs de lignée de cellules dendritiques a été mesurée par cytométrie au 8e jour de culture. Les cellules mortes ont été bloquées sur issu de leur côté et les propriétés de dispersion vers l’avant et de coloration avec Hoechst 33258. Les résultats sont représentatifs d’au moins 3 expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : évaluation de l’expression du PSTPIP2-EGFP et OPAL1-EGFP. Fluorescence EGFP dans BMDMs (A) et BMDCs (B) retrovirally transduite avec des constructions PSTPIP2-EGFP et OPAL1-EGFP a été mesurée par cytométrie au 8e jour de culture. (C) . Graphique montrant les résultats de plusieurs expériences indépendantes. BMDMs et BMDCs ont été bloquées comme dans la Figure 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : des images représentatives des macrophages et des cellules dendritiques exprimant PSTPIP2 ou OPAL1. BMDMs (A) et BMDCs (B) exprimer PSTPIP2 et OPAL1 ont été visualisées par microscopie confocale imagerie live. Fluorescence EGFP en vert apparaît sur le côté gauche de chaque panneau, image de champ lumineux sur la droite. Echelle = 10 µm. Les résultats sont représentatifs d’au moins trois expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’expression de la protéine d’intérêt dans les cellules cibles est une étape clé dans plusieurs types d’études biologiques. Différenciées des macrophages et les cellules dendritiques sont difficiles à transfecter par transfection standard et des techniques de transduction rétrovirale. Contournant la transfection des cellules différenciées avec retroviral transduction des ancêtres de moelle, suivie de différenciation lorsqu’ils portent déjà la construction désirée, est une étape cruciale permettant l’expression d’ADNc ectopiques dans ces types de cellules. On trouvera un exemple d’utilisation réussie de cette méthode dans notre récente publication25. Ici, nous fournissons un protocole rentable pour atteindre l’expression stable de la construction de choix dans la moelle osseuse des cellules dendritiques et macrophages en utilisant cette approche. La procédure que nous présentons est relativement peu coûteux et simple, encore fournir de très bons résultats. Réactifs utilisés dans le présent protocole permettent son utilisation en routine même sous un budget relativement restrictive. Le protocole de transfection de Plat-E emploie PEI comme un réactif de transfection. Par rapport à d’autres agents de transfection chimique, PEI est d’un très faible coût, tandis que son efficacité est similaire à la plupart des autres employés couramment composés. Cependant, PEI peut être remplacé par plusieurs différents réactifs de transfection disponibles dans le commerce dans cette étape sans perte d’efficacité. Comme un principe directeur, protocoles de transfection connus pour fonctionner avec les cellules HEK293 couramment utilisés généralement effectuent trop bien avec les cellules de Plat-E. Une autre mesure rentable est l’utilisation de cytokines contenant des surnageants au lieu de cytokines recombinantes purifiée. L’utilisation de ces surnageants nécessite une optimisation. Toutefois, lorsque le protocole standard pour leur préparation est établi et suivi, la variabilité entre les lots individuels de ces surnageants devient très faible, ne nécessitant habituellement aucuns changements dans les concentrations entre les lots individuels de travail. Les efficacités de différenciation BMDM et BMDC avec ces surnageants sont, selon notre expérience, identique aux cytokines purifiée.

En plus de la transduction des antirétrovirale, les autres méthodes bien établies de la transfection de cellules de mammifères existent, y compris de la transfection chimique (généralement via les lipides cationiques ou polymères cationiques, formant des complexes avec l’ADN), électroporation et l’utilisation de d’autres types de vecteurs viraux, principalement les systèmes viraux et des gènes26,27,28,29,30. Bien que les gains d’efficience et des titres très élevés peuvent être obtenus avec livraison génique à base d’adénovirus, la préparation des plasmides correspondants et particules virales sont plus difficiles et plus de temps que dans le cas de systèmes rétroviraux29. En outre, adénovirus provoque une réponse inflammatoire dans les cellules dendritiques et macrophages29,31,32 et pour des performances optimales dans des cellules hématopoïétiques murins souris souche transportant transgéniques récepteur de l’adénovirus est requis33. En revanche, la génération de Particules Lentivirales portant le gène d’intérêt est un processus relativement simple, pratiquement identique à celle utilisée pour les rétrovirus. Contrairement aux ecotropic vecteurs rétroviraux utilisés dans le présent protocole, lentivirus sont capables d’infecter des cellules non-proliférantes de multiples espèces, y compris les humains,34. Cela peut être un avantage important dans des conditions expérimentales spécifiques. Toutefois, cette fonctionnalité compromet considérablement la sécurité de ces vecteurs. À notre avis, pour la livraison de gène de BMDMs et BMDCs, rétrovirus offrent le meilleur équilibre entre efficacité, sécurité et facilité d’utilisation. Des constructions d’ADN rétrovirales peuvent être facilement établies à l’aide de simples techniques de clonage moléculaire standards. Virus est produit par les lignées de cellules directement dans le surnageant de culture d’emballage et une purification supplémentaire virus n’est habituellement pas nécessaire. Rétrovirus ecotropic aussi ne pas facilement infecter des cellules humaines, qui rend leur utilisation relativement sûre. Cependant, il y a aussi quelques inconvénients généraux associés à l’utilisation de vecteurs rétroviraux. Le principal facteur limitant, c’est que ces virus infectent seulement35les cellules prolifèrent. Cette fonction n’affecte pas significativement le protocole décrit ici, mais elle limite l’éventail des applications où les vecteurs rétroviraux peuvent être utilisés. La taille du gène d’intérêt qui peut être cloné dans ces vecteurs est également limitée, et le titre de la particule virale diminue avec l’augmentation de taille des inserts. Avec des vecteurs de la pMSCV, nous généralement commencer à voir les effets de taille des inserts à kbp autour de 3. Avec nouvelles augmentations de taille des inserts, l’efficacité de l’infection diminue progressivement.

La transfection chimique et électroporation sont plus faciles à utiliser, plus sûres et moins de temps que n’importe lequel des procédures fondées sur les virus26,27,28,30. Toutefois, en BMDMs et BMDCs, qu’ils peuvent susciter des réponses aux acides nucléiques étrangers31 et ils génèrent plus de cellulaire au stress. En outre, augmentent de certains réactifs chimiques de transfection cellulaire auto-fluorescence peut gêner l’écoulement cytometry ou analyse de microscopie. En raison de la nature transitoire de l’expression, ils utilisable uniquement avec matures différenciées BMDMs ou BMDCs. En revanche, les séquences introduites avec des vecteurs rétroviraux sont définitivement intégrés dans le génome des cellules cibles et permettant une expression stable de longue durée compatibles avec l’échelle de temps de la différenciation des protocoles34, 35. Cependant, cette fonctionnalité augmente également le risque de mutagenèse insertionnelle. En raison de la nature relativement aléatoire de l’intégration de vecteur, ses effets sur grandes populations de cellules sont limitées. Toutefois, ils peuvent être visibles au niveau des cellules individuelles. Des problèmes peuvent surgir lorsqu’une construction a exprimé le vecteur rétroviral affecte des cellules dendritiques ou différenciation de macrophage, entraînant un échec pour générer distingue BMDMs ou BMDCs les progéniteurs infectés. Dans une certaine mesure, cela peut être surmonté en ajustant l’infection pour atteindre des niveaux d’expression faible (e.g., en réduisant le titre virus) ou par l’utilisation d’un système d’expression inductible. L’utilisation de EGFP fondue à la protéine d’intérêt ou comme reporter également permet le tri des cellules avec le niveau d’expression correspondant aux limitations et aux buts de l’expérience. Enfin, il faut aussi mentionner les problèmes communs à toutes les méthodes de transfection/transduction. Il s’agit principalement des artefacts de surexpression, telle que la protéine mauvais repliement, localisée et toxicité36. Toxicité de la protéine pourrait être la raison pourquoi OPAL1 fut assez difficile à exprimer. Cet exemple illustre bien que la nature de la protéine exprimée peut affecter considérablement l’efficacité de cette méthode. Cependant, malgré cela, nous avons pu obtenir des quantités suffisantes de OPAL1-EGFP exprimant des cellules pour l’analyse de la microscopie avec cette méthode, de démontrer son utilité même lorsqu’il s’agit des cibles difficiles. En outre, il serait possible d’augmenter les pourcentages de cellules transduits en FACS Trier si nécessaire par une application particulière. L’efficacité faible infection peut également être partiellement surmontée en augmentant la concentration de particules virales à l’aide de diverses méthodes ou des kits prêts à l’emploi. Dans nos mains, ultrafiltration du surnageant viral sur les filtres centrifuges avec un poids moléculaire couper hors de 100 kDa a prouvé pour fournir le meilleur équilibre entre efficacité et effort requis.

La moelle osseuse provenant des macrophages et les cellules dendritiques sont des outils largement utilisés en immunologie phagocyte. Ils sont plus physiologiquement pertinents que les lignées de cellules disponibles. Ils peuvent être générés dans un nombre relativement élevé et, en même temps, n’ont pas la caractéristique hétérogénéité et l’instabilité génétique de lignées cellulaires. Un autre avantage est qu’ils peuvent être générés de souris génétiquement modifiées pour étudier les effets de la modification génétique sur une population de cellules relativement abondant et homogène. Ceci est particulièrement utile dans des études biochimiques, où des quantités relativement importantes de cellules sont généralement requises. La capacité à transmettre ces cellules avec des constructions de cDNA ouvre des possibilités supplémentaires de recherche basée sur la reconstitution ou la complémentation des défauts génétiques dans ces cellules et l’analyse de la structure-fonction.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par Science de tchèque Foundation (GACR) (numéro de projet : 16-07425S), par Charles Université Grant Agence (GAUK) (numéro du projet 923116) et par un financement institutionnel de l’Institut de génétique moléculaire de l’Académie des Sciences de la République tchèque République (RVO 68378050).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 For media suplementation
KHCO3 Lachema, Brno, Czech Republic N/A
NH4Cl Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) A9434
Penicillin BB Pharma AS, Prague, Czech Republic N/A PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic N/A
Polyethylenimine, linear, MW 25,000 Polyscience, Warrington, PA, USA 23966
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
PBS Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic N/A
APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 BioLegend (San Diego, CA, USA) 101212 flow cytometry analysis
PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 BioLegend (San Diego, CA, USA) 123110 flow cytometry analysis
APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 BioLegend (San Diego, CA, USA) 117310 flow cytometry analysis
M-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-02
GM-CSF PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) 315-03
Hoechst 33258 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA H1398 flow cytometry analysis use at 1-2 µg/mL

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References

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Kralova, J., Glatzova, D., Borna, S., Brdicka, T. Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages. J. Vis. Exp. (140), e58081, doi:10.3791/58081 (2018).

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