Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1-/-

Published: October 17, 2018 doi: 10.3791/58110
Automatic Translation
*1,2, *2, *3, 1,2, 4, 2, 5, 6, 3, 1,2,4,6, 1,2
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3State Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 4Research Network of Immunity and Health (RNIH), Beijing Institutes of Life Science, Chinese Academy of Sciences, 5Laboratory Animal Center, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 6CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

ويرد وصف بروتوكول لتقييم استجابات محددة مستضد تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد Ifnar1-/- نموذج مورين لعدوى فيروس (زيكف) زكى. هذا الأسلوب هو محوري للتحقيق في آليات حماية الخلايا وإيمونوباثوجينيسيس من اللقاحات زيكف وهو أيضا قيمة لتقييم فعالية.

Abstract

يمكن حمل الفيروس Zika (زيكف) التهاب في إيمونوبريفيليجيد الأجهزة (مثلالدماغ والخصية)، مما يؤدي إلى متلازمة غيلان-باريه وإلحاق أضرار بالخصيتين. خلال عدوى مع زيكف، أظهرت الخلايا المناعية التسلل إلى داخل الأنسجة. ومع ذلك، الآليات الخلوية التي تقوم بتعريف الحماية و/أو إيمونوباثوجينيسيس من هذه الخلايا المناعية أثناء مرض زيكف لا تزال مجهولة إلى حد بعيد. هنا، يمكننا وصف أساليب تقييم الوظائف تي خلية خاصة بالفيروس في هذه الأجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة زيكف. وتشمل هذه الأساليب) العدوى زيكف ولقاحات التطعيم في الفئران-/- Ifnar1؛ ب) الأنسجة، الفلورة وفحوصات إيمونوهيستوتشيميستري للكشف عن الإصابة بالفيروسات والتهاب في المخ والخصيتين، والطحال؛ ج) إعداد تيترامير المستمدة من زيكف تي خلية [ابيتوبس]؛ د) الكشف عن خلايا تي زيكف على حدة في وحيدات المعزولة من المخ والخصيتين، والطحال. استخدام هذه النهج، فمن الممكن للكشف عن الخلايا T مستضد الخاصة التي تسللوا إلى أجهزة إيمونوبريفيليجيد وتقييم وظائف هذه الخلايا T خلال العدوى: حماية الحصانة المحتملة عن طريق إزالة الفيروسات و إيمونوباثوجينيسيس/أو إلى تفاقم الالتهاب. هذه النتائج قد يساعد أيضا على توضيح مساهمة خلايا تي الناجمة عن التطعيم ضد زيكف.

Introduction

زيكف هو مصفر المنقولة بالبعوض التي كانت معزولة أولاً في عام 1947 في أوغندا من المكاك الريسوسي حموية. في الآونة الأخيرة، أصبح زيكف حالة طوارئ صحة العامة، بسبب نشرها السريع في الأمريكتين وعلاقته غير متوقع لصغر الرأس ومتلازمة غيلان-باريه متلازمة1،،من23. من البيانات الوبائية، يشتبه في زيكف أن يكون سبب متلازمة غيلان-باريه في حوالي 1 في 4,000 إصابة البالغين4. وعلاوة على ذلك، وجود ارتباط بين زيكف والخصيتين العدوى/الضرر في طراز الماوس قد ثبت، مما يوحي بأن العدوى زيكف، تحت ظروف معينة، يمكن تجاوز حاجز الدم-الخصية ويؤدي في النهاية إلى العقم عند الذكور5 . هذه النتائج تسلط الضوء على أهمية فهم تماما تنظيم دورات تعريفية للاستجابات المناعية الواقية أو باثولوجي أثناء مرض زيكف.

الكثير مما يمكن تعلمه عن الاستجابات المناعية الخلوية زيكف. خلايا CD4+ و CD8+ تي خلية الردود قفيصه والمغلف، والبروتين نونستروكتورال 1 (NS1) قد لوحظت في إصابة زيكف القردة والبشر6،،من78. في الفئران، أشارت عدة دراسات إلى أن CD8+ تي الخلايا دوراً حمائياً في مراقبة النسخ المتماثل زيكف9،،من1011. الأهم من ذلك، أثبتت خورادو et al. أن عدوى زيكف يؤدي إلى انهيار حاجز الدم في الدماغ وارتشاح تسلل CD8+ خلايا المستجيب تي داخل الخصيتين Ifnar1--/-- الفئران. وعلاوة على ذلك، أنها أظهرت أن CD8+ تي الخلايا تحرض الشلل المرتبطة زيكف ويبدو أن تلعب دوراً في إيمونوباثولوجي الدماغ الولدان. في دراسة سابقة، أعد تيترامير294-302 ه زيكف، وأظهرت أن CD8 زيكف الخاصة+ تي خلايا موجودة في العقول والحبال الشوكي لفئران مصابة زيكف Ifnar1-/- ، التي قد يكون لها آثار هامة على التصميم وتطوير اللقاحات زيكف10.

في استجابة للحاجة الملحة للتطعيم الوقاية من الإصابة زيكف، عدة لقاحات في المراحل الإكلينيكية للتنمية، بما في ذلك اللقاحات واللقاحات المؤتلف متجهة البروتين المنقي فرعية للقاحات الحمض النووي الريبي. لقاح بلازميد الحمض النووي في مرحلة التجارب السريرية 112. تقييم سلامة وفعالية اللقاحات زيكف، لذلك، المهم. ميزة واحدة من اللقاحات هي قدرتها على الحصول على ردود تي خلية محددة، التي قد تكون هامة للحماية زيكف. يمكن الكشف عن إيممونوريكتيفيتي تي خلية الناجم عن لقاح زيكف إتش-vector-تعتمد باستخدام المشتقة من زيكف تي خلية المتصلة حانمه tetramers، في الفئران تحصينا، وعرضت glycoproteins م وه لحمل قوية محددة مستضد CD8+ تي خلية إيمونوريكتيفيتي13.

أثناء الإصابة بعدوى فيروس، الاعتراف المستضدات الببتيد المقدمة من الجزيئات (MHC) المعقدة هيستوكومباتيبيليتي الرئيسية لمستقبلات خلايا تي (تكر) إليه هامة لحماية المضيف14خلية توسطت T. وبناء على هذه النظرية، تيترامير التكنولوجيا هي أداة فريدة توضيح الأدوار التي تؤديها خلايا تي مستضد محددة في تنظيم الاستجابات المناعية15. ويصف هذا البروتوكول إنشاء Ifnar1-/- طراز الماوس للالتهابات زيكف، والكشف عن خلايا تي رد الفعل في الطحال والدماغ، والخصيتين للفئران باستخدام تكنولوجيا تيترامير. بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا تيترامير294-302 ه زيكف لاكتشاف وتقييم إيمونوريكتيفيتي تي خلية الناجم عن لقاح زيكف (AdC7-M/E) في الفئران المحصنين. هذه الدراسة توفر التوجيه للتحقيق في الردود تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد ويوفر مرجعاً للتطبيقات المحتملة في مخ الجنين أو المشيمة.

Protocol

التجارب على الحيوانات أقرها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة للمعهد الوطني لمكافحة الأمراض الفيروسية والوقاية، "منها الصين". جميع التجارب التي أجريت عقب "رعاية الحيوان المؤسسية" ووافقت عليها "اللجنة استخدام" بروتوكولات الحيوان.

1. الإصابة بالفيروس

  1. تبقى الكبار (6 إلى 8 من العمر الأسبوع) Ifnar1 الفئران-/- (50 في المائة من الذكور و 50 في المائة من الإناث) في معيار خالية من العوامل الممرضة (منتدى جنوب المحيط الهادئ) الشروط الخاصة، وتمكينهم من الوصول المنتظم للمواد الغذائية والمياه.
  2. تصيب الفئران-/- Ifnar1 زيكف عن طريق تطعيم الرجعية-المداري 100 ميليلتر من زيكف في مخزنة الفوسفات مالحة (PBS) مخزن مؤقت الذي يحتوي على 1 × 104 التركيز تشكيل وحدات (فوس) من الفيروس. وبالمثل، توفر الفئران التحكم حجم متساو من برنامج تلفزيوني.
    تنبيه: تصيب الفئران تحت ظروف ABSL2، وتنفيذ هذه الإجراءات مع الفئران المصابة بالفيروس في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
  3. مراقبة الوزن وعلامات سريرية (الهزات، ومارس متداخلة، الثنائية أطرافهم هند الرخو) من الفئران يوميا لمدة 15 يوما.

2-التحصين بلقاح زيكف

  1. استخدام الفئران Ifnar1-/- (50 في المائة من الذكور والإناث 50 في المائة) بين 6 و 8 أسابيع من العمر. تبقى الفئران في ظروف منتدى جنوب المحيط الهادئ القياسي 18 – 29 درجة مئوية ودورة ضوء/الظلام ح 12 مع إمكانية الوصول إلى الغذاء والماء.
  2. تحصين الفئران-/- Ifnar1 بلقاح زيكف: حقن 100 ميليلتر من AdC7-M/E [4 × 1010 (جزيئات الفيروس)] في برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت عن طريق حقن العضلي (الطريق الدردشة) باستخدام حقنه 1 مل بإبرة 23-ز.
  3. وبالمثل، حقن الفئران التحكم مع حجم متساوية من برنامج تلفزيوني.

3-عزل وحيدات من الطحال

ملاحظة: هو وصف عزلة وحيدات من الطحال كما ذكرنا سابقا16.

  1. تخدير التطعيم بعد د 7 الفئران المحصنين والمصابين زيكف، باستخدام 5% isoflurane أكسجين 100% كونسينتراتيونين (مع معدل تدفق من 1 لتر في الدقيقة). Euthanize الفئران بخلع عنق الرحم. بعد ذلك، تراجع فورا الماوس كامل إلى الإيثانول 75%.
    تنبيه: من هذه الخطوة، جميع الإجراءات التجريبية ينبغي أن يقوم أسيبتيكالي في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
  2. استخدام الإبر، إصلاح أطرافه الفئران (euthanized، تحصين المصابين سابقا) على لوحة الرغوة مع البطن مواجها لأعلى.
  3. قطع الجلد على طول خط الوسط البطن إلى الصدر مع مشرط معقم وقطع عضلات البطن مع المقص وفضح تجويف البطن وإزالة الكبد بلطف.
    ملاحظة: هو الجهاز الطويل، أحمر غامق إلى يسار المعدة الطحال.
  4. إزالة الطحال، شطفة x 3 في برنامج تلفزيوني إزالة أي الدم، ووضعه في 1.5 مل من المثلج روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط (ربمي). تبقى الطحال على الجليد.
  5. لإنشاء تعليق خلية واحدة من الطحال، وضع الأجهزة على مصفاة خلية عقيمة 40 ميكرون على رأس أنبوب 50 مل وإضافة 2 مل من المثلج ربمي المتوسطة التي تحتوي على 10% الجنيني البقري المصل (FBS). استخدام المكبس لحقنه 5 مللي، ميكانيكيا الهريس الأجهزة وإضافة المتوسطة حتى تم الجهاز تماما من الأرض من خلال الشبكة.
  6. نقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي أنه في 600 x غ لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية.
  7. ريسوسبيند الخلايا مع 5 مل من المخزن المؤقت تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) (NH4Cl, Na2يدتا، وكهكو3؛ انظر الجدول للمواد)، واحتضان رد فعل تحلل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 – 6 دقائق.
  8. إيقاف تحلل ربك مع 10 مل من المثلج ربمي/FBS المتوسطة والطرد المركزي الأنبوب في 600 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية.
  9. ريسوسبيند الخلايا مع 10 مل من كامل ربمي المتوسطة (ربمي مع 10% المجلد/المجلد FBS والبنسلين يو/مليلتر 100-ستربتوميسين). نقل 10 ميليلتر من تعليق خلية في أنبوب صغير ومزجها مع 10 ميليلتر من 0.4% wt/المجلد تريبان الأزرق، وحساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.

4-عزل وحيدات من المخ والخصيتين

  1. تخدير الفئران الذكور المصابين زيكف د 7 بعد التطعيم، استخدام الأكسجين 100% إيسوفلورانين 5% (مع معدل تدفق من 1 لتر في الدقيقة). Euthanize الفئران بخلع عنق الرحم. بعد ذلك، تراجع فورا الماوس كامل إلى الإيثانول 75%.
    تنبيه: من هذه الخطوة فصاعدا، جميع الإجراءات التجريبية يجب أن يتم أسيبتيكالي بالسلامة الأحيائية مجلس الوزراء. ويرد وصف عزلة وحيدات من المخ والخصيتين كما ذكرنا سابقا17.
  2. شل ماوس ذكور (euthanized، المصابة سابقا) في موقف المعرضة على قطع مجلس.
  3. تأمين فروة الرأس مع ملقط أسنان 1 × 2 على التوالي، واستخدام مقص آيريس جعل شق خط الوسط في فروة الرأس لفضح الجمجمة.
  4. المشبك الجانبان من المدارات مع الملقط حادة وإصلاح الدماغ. ضع طرف واحد حاد قزحية مقص إلى ماغنوم ثقبة وقطع أفقياً في الجمجمة. كرر هذه الخطوة للجانب الآخر.
  5. استخدام حادة قزحية مقص قص بعناية من تجويف نفسه، حتى خط الوسط، نحو الآنف. محاولة لإبقاء نهاية المقص سطحية قدر الإمكان لتجنب إصابة في الدماغ.
  6. رفع الدماغ بالملقط واستخدام حادة قزحية مقص تشريح ألياف الأعصاب القحفية بعناية. إزالة الدماغ بالملقط ووضعه في أنبوب 15 مل يحتوي على 5 مل من المثلج RPMI/10% FBS المتوسطة.
  7. الاستيلاء على جلد البطن بالملقط واستخدام مقص القزحية الحاد لجعل شق طولية من خلال جدار البطن وأهاب وفضح الجزء lowermost من البطن. دفع الخصيتين حتى الشق. بلطف سحب طبقة الدهون مع ملاقط وكشف الخصية كروي على كلا الجانبين.
  8. استخدام قزحية حادة المقص بعناية تشريح طبقة الدهون والبربخ. وضع الخصيتين في أنبوب 15 مل يحتوي على 5 مل من المثلج RPMI/10% FBS المتوسطة بالملقط.
  9. لإنشاء تعليق خلية واحدة من الدماغ أو الخصيتين، وضع الجهاز على مصفاة خلية عقيمة مع 100 ميكرون على رأس أنبوب 50 مل وإضافة 2 مل من المثلج RPMI/10% FBS المتوسطة. استخدام المكبس لحقنه 5 مللي، الهريس الجهاز وإضافة المتوسطة حتى تم الجهاز تماما من الأرض من خلال الشبكة.
  10. نقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي أنه في 600 x غ لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية.
  11. ريسوسبيند الخلايا مع 5 مل من 30% الكثافة المتوسطة التدرج، وثم إضافتها ببطء شديد إلى 2 مل من 70% الكثافة المتوسطة التدرج في أنبوب 15 مل.
  12. إيقاف تشغيل الفرامل والطرد المركزي هذه الأنابيب في 4 درجات مئوية في 800 x ز 30 دقيقة الحصول على اللمفاويات من الطبقة الوسطى.
  13. نقل في الطور البيني لأنبوب 15 مل طازجة وإضافة 10 مل من البرد RPMI/10% FBS المتوسطة والطرد المركزي الأنبوب في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية.
  14. ريسوسبيند الخلايا مع 10 مل من المثلج ربمي/FBS المتوسطة والطرد المركزي لهم في 600 x غ لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية.
  15. ريسوسبيند الخلايا مع 10 مل من إكمال ربمي المتوسطة وحساب عدد الخلايا كما هو الحال في الخطوة 3، 9.

5-إعداد تيترامير

  1. بناء والبلازميدات معربا عن المجالات خارج الخلية في 2D حب مع علامة موقع بيوتينيلاتيد على ج-المحطة المجال α3 وم2β باستخدام ناقلات pET28a مع ندى وزي موقع تقييد18.
  2. إكسبريس وإعداد الهيئات إدراج في 2D حب وبيتا2متر كما هو موضح سابقا20.
  3. ريناتوري وتنقية MHC/الببتيد معقدة 2D حب-E294-302.
    1. إعداد 200 مل حل ريفولدينج [100 ملم تريس-HCl (pH 8.0)، 400 مم ارجينين، 2 مم يدتا نا، 5 GSG، و 0.5 ملم جسج]. إضافة مثبطات البروتياز: 2 مل من فلوريد فينيلميثيلسولفونيل (بمسف، والأوراق المالية 100 ملم) و 100 ميليلتر من بيبستاتين (الأسهم 2 مغ/مل) و 100 ميليلتر من ليوبيبتين (الأسهم 2 مغ/مل). بارد المخزن المؤقت عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. إضافة ح-2Dب، β2م، والببتيد في حل ريفولدينج.
      1. حقن 500 ميليلتر بيتا2م حله في حل غوانيدين (الأسهم 30 ملغ/مل) باستخدام المحاقن. لهذا، استخدم إبرة ز 23 مع حقنه 5 مل وضخ م2β في الحل ريفولدينج قطره قطره. يبقى الحل ببطء واستمرار إثارة في 150 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية.
      2. بعد حل م2β في حل ريفولدينج، حل 2 مغ ببتيد294-302 ه في 200 ميليلتر من [دمس] وحقن بسرعة الحل ريفولدينج باستخدام ماصة. يحرك ببطء الحل عند 150 دورة في الدقيقة عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      3. حقن 1.5 مل ح-2Dب حله في حل غوانيدين. الاحتفاظ بالتناوب شريط إثارة 150 لفة في الدقيقة ريفولدينج في 2D حب في 4 درجات مئوية عن ح 8 – 10.
        ملاحظة: تم وضع الحل في مربع مغلقة في غرفة باردة.
    3. تركيز البروتين ريفولديد في غرفة الضغط مع غشاء كاتشين 10. تبادل المخزن المؤقت [20 مم تريس-HCl (pH8.0)، 50 مم كلوريد الصوديوم] للدائرة والتركيز عليه لوحدة تخزين نهائي من 30 – 50 مل.
    4. نقل الحل ريفولدينج إلى أنبوب الطرد مركزي، وأنها تدور في س 2,500 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    5. نقل المادة طافية بعناية إلى عامل تصفية الطرد مركزي كاتشين 10 وكذلك التركيز عليه لوحدة تخزين نهائي من 500 ميليلتر في س 2,500 ز لمدة 30 دقيقة.
    6. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وأنها تدور في س 12,000 ز عن 15 دقيقة تنقية البروتين مع S200 GL 10/300 جل اللوني filtration.
    7. جمع ذروة المعقد MHC والتركيز عليه لوحدة تخزين نهائي من 350 ميليلتر.
  4. لإنشاء وحدة تخزين رد فعل 500 ميليلتر بيوتينيليشن، إضافة الحكام بالترتيب التالي: 100 ميليلتر من الحل A [0.5M بيسين (pH 8.3)]، 100 ميليلتر حل ب (100 مم ATP، 100 مم مجواك، 200 µΜ البيوتين)، 100 ميليلتر إضافية د-البيوتين (500 µΜ البيوتين) ، 20 ميليلتر من البيرا إنزيم (60 ميكروغرام) و 0.5 ميليلتر من بيبستاتين (2 مغ/مل) 0.5 ميليلتر من ليوبيبتين (2 مغ/مل). احتضان أنبوب تفاعل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    تنبيه: لا تقم بإضافة أي أدتا إلى رد فعل بيوتينيلاتينج.
  5. تنقية MHC استخدام S200 10/300 GL هلام الترشيح العمود لإزالة أي البيوتين إضافية.
  6. تحديد كفاءة بيوتينيلاتينج مع مقايسة streptavidin-تحول18.
    1. تحضير ثلاث عينات، ألف، وباء وجيم، على الجليد لمدة 30 دقيقة. ثم تحليل النتائج بنسبة 10% الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. ألف عينة تتكون من 8 ميليلتر من جزيئات MHC بيوتينيلاتيد و 2 ميليلتر exchange المخزن المؤقت وعينه ب 8 ميليلتر من جزيئات MHC بيوتينيلاتيد 2 ميليلتر streptavidin (20 ملغ/مل)، وعينه ج 2 ميليلتر من ستريبتافيدين (20 ملغ/مل) وميليلتر 8 exchange المخزن المؤقت.
      تنبيه: لا تغلي العينة.
  7. وتشكل مولتيميرس جزيئات بيوتينيلاتيد MHC.
    1. إنتاج تيترامير بخلط بيوتينيلاتيد ه294-302 الببتيد-ح2دب المعقدة مع المسمى فيكوريثرين ستريبتافيدين بنسبة 1:5 لضمان ربط كامل من جميع جزيئات MHC بيوتينيلاتيد الخلد.
    2. حساب مقدار streptavidin-المرافق اللازمة تيتراميريزاتيون.
      1. تحديد جزيئات MHC/الببتيد المجمعات المحاسبية لتركيز البروتين والوزن المولى (مثال: 1.8 ملليغرام من مجموع البروتين = نمول 40).
      2. حساب جزيئات من ستريبتافيدين-المرافق اللازمة بتقسيم جزيئات MHC/الببتيد 5 (مثال: 40/5 = 8 نمول من المتقارن streptavidin).
      3. حساب كمية ستريبتافيدين المطلوبة (في ميكروغرام) اعتماداً على ستريبتافيدين-المتقارن (مثال: streptavidin-PE [ز 300,000/M] ← 8 نمول حاجة = ز 2,400).
    3. تقسيم العينات 10 ستريبتافيدين-فيكوريثرين. إضافة كل عينة إلى أنبوب يحتوي على بيوتينيلاتيد ه294-302 الببتيد-ح2دب المعقدة، في فاصل زمني قدرة 20 دقيقة. بعد تحميل النموذج الأخير، احتضان الأنبوب رد الفعل عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها في الظلام.
  8. تطبيق الكواشف مولتيميريزيد في أنبوب تدور 100 كاتشين والتركيز عليه بالطرد المركزي في 2,000 س ز عند 4 درجة مئوية لحجم < 100 ميليلتر.
  9. تمييع العينة في أنبوب تدور إلى 4 مل باستخدام برنامج تلفزيوني (pH 8.0) والتركيز عليه مرة أخرى إلى < 100 ميليلتر.
  10. كرر الخطوة exchange المخزن المؤقت في برنامج تلفزيوني (pH 8.0) 4 x.
  11. تملأ الحجم الإجمالي مرة أخرى إلى 500 ميليلتر باستخدام برنامج تلفزيوني (pH 8.0). تركيز العينة بتركيز حوالي 2 – 2.5 ملغم/مل في 2,000 س ز في 4 درجات مئوية. تخزين العينة في الظلام في 4 درجات مئوية.

6-التدفق الخلوي

  1. احتضان تعليق خلية (من الخطوة 3.9 و/أو خطوة 4.15) في 4 درجات مئوية مع ميليلتر 0.1 من الفاري المضادة مستقبلات Fc CD16/CD32 كاشف حظر كل 20 ميليلتر (تمييع عامل 1: 200) لمدة 10 دقائق، لمنع أي ربط غير محدد.
  2. الطرد المركزي أنبوب تيترامير في 20,000 x ز لمدة 15 دقيقة على الأقل في 4 درجات مئوية.
  3. إضافة 20 ميليلتر من تعليق خلية إلى خلايا6 96-بئر بلاتيكونتينينج 1 × 10 كل جيد.
  4. إعداد كمية كافية من المزيج تيترامير294-302 ه وصمة عار جميع الأنابيب التجريبية. إعداد فائض بنسبة 15% الحجم الإجمالي لهذا المزيج لحساب للأخطاء بيبيتينج. تمييع tetramers294-302 ه (2 ملغ/مل، 1 ميليلتر/اختبار) في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (برنامج تلفزيوني، 0.5% FBS) حيث أنه يتم إضافة 20 ميليلتر من مزيج تيترامير294-302 ه لكل اختبار.
  5. إضافة 20 ميليلتر من مزيج تيترامير294-302 ه إلى لوحة 96-جيدا. بنهاية هذه الخطوة، ينبغي أن تكون وحدة التخزين النهائي في كل بئر µL.Incubate 40 اللوحة في الظلام في غرفة درجة الحرارة لمدة 30 دقيقة.
  6. إضافة إلى تعليق خلية في 1 ميليلتر/اختبار الأجسام المضادة الأولية (فيتك مترافق أو APC مترافق مكافحة-CD3 (0.2 مغ/مل)، بيركب مترافق مكافحة-CD8 (0.2 مغ/مل))، واحتضان بعد ذلك، فإنه عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  7. تغسل الخلايا 2 x مع 2 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وأجهزة الطرد المركزي لهم في 600 x ز للحد الأدنى 5 نضح المادة طافية وريسوسبيند في الخلايا التي تحتوي على 200 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية بعناية.
  8. تخزين العينات مؤقتاً عند 4 درجة مئوية في الظلام حتى تحليل تدفق سيتوميتريك.
  9. استخدام استراتيجية النابضة التالية لتحليل تدفق سيتوميتريك.
    1. إنشاء بوابة على نوع شكل قطري متفاوت المسافات بالتآمر مبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل منطقة مبعثر (SSC) جانب.
    2. ثم، بوابة على CD3+ الخلايا بجانب مبعثر (SSC) مقابل CD3؛ المقبل، من بوابة على CD3+ CD8+ الخلايا؛ وأخيراً، المخطط التفصيلي CD8+ الخلايا تيترامير+ 19.

7-الأنسجة، الفلورة والمقايسة إيمونوهيستوتشيميستري

  1. فحص الأنسجة
    1. جمع أنسجة المخ والخصية المصابة زيكف Ifnar1--/-- الفئران د 7 بعد التلقيح وإصلاحها في 4% فورمالدهايد مخزنة المحايدة.
      تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    2. تضمين الأنسجة في البارافين.
    3. قسم الأنسجة في 5 ملم باستخدام فيبرتوم.
    4. وصمة عار الأنسجة والهيماتوكسيلين ويوزين (H & E).
  2. تحليل إيمونوهيستوتشيميستري
    1. ديبارافينيزي وترطيب ومستضد-استرجاع الأنسجة الأقسام، على أساس الإجراءات الموصوفة سابقا21.
    2. علاج أقسام الأنسجة مع 3 ٪ ح2س2 في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.6) لمدة 10 دقائق ومنعها مع 1% البقري ألبومين المصل (BSA) لمدة 10 دقائق.
    3. احتضان الفروع الأنسجة مع الأجسام المضادة CD3 الماوس لمكافحة الفئران (تمييع: 1/1,000) عن 8 ساعات في درجة حرارة الغرفة، واحتضانها لهم، ثم في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    4. شطف الأنسجة مع برنامج تلفزيوني، واحتضانها لهم، ثم مع 3 قطرات جسم بيوتينيلاتيد الثانوي (تمييع: 1/1,000) عن 2 ح في درجة حرارة الغرفة، تليها 3 قطرات من عبدين-البيوتين-البيروكسيديز (تمييع: 1/200) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    5. ربط، مع 3 قطرات 30، 30-ديامينوبينزيديني تيتراهيدروتشلوريدي (التخفيف: 1/1,000)، كما هو موضح سابقا22.
    6. كونتيرستين أقسام الأنسجة مع توضع ماير.
  3. والرزن الفلورة
    1. أيردري المقاطع الخصية المجمدة (6 مم) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. إصلاح لهم مع الأسيتون المثلج لمدة 10 دقائق.
    3. أغسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني ل 3 x ومنعها مع المخزن مؤقت حظر (1% جيش صرب البوسنة، 0.3% تريتون، 1 x PBS) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    4. احتضان الفروع الأنسجة بجسم الابتدائي (Z6) (20 ميكروغرام/مل) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    5. شطف الأنسجة مع برنامج تلفزيوني وتطبيق الجسم المضاد الثانوي (عامل التخفيف: 1/200) عن 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    6. أغسل أقسام الأنسجة مع برنامج تلفزيوني وكونتيرستاين لهم الأنوية باستخدام 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) (عامل التخفيف: 1/1,000)، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.

Representative Results

وأثر هذه الأساليب، قمنا بتطوير نموذج مورين لالتهابات زيكف. Ifnar1--/-- الفئران في 6-8 أسابيع من العمر أصيبوا بالوحدات المكونة لتركيز 1 × 104 (فو) زيكف بالحقن ريتروربيتال. الأعراض المرضية والعلامات (الشكل 1أ)، فضلا عن تغييرات الوزن (الشكل 1ب)، لوحظت في Ifnar1--/-- الفئران بعد عدوى زيكف. وأظهرت أدمغة مورين ذمة واضحة والاحتقان (الشكل 1ج). ومن ناحية أخرى، وتقلص الخصيتين تدريجيا (الشكل 1د). وعلاوة على ذلك، تم العثور على التغيرات الباثولوجية وتدمير الأنسجة في المخ والخصيتين (الشكل 2أ). أجرينا مقايسة الفلورة للكشف عن زيكف في المخ والخصيتين (الشكل 2ب). تم الكشف عن ارتفاع الأحمال الفيروسية في المخ والخصية قبل إيمونوستاينينج (الشكل 2ب). أظهر Immunohistochemistry تسلل قوي CD3+ تي الخلايا في الدماغ الفئران بعد الإصابة مع زيكف (الشكل 2-ج).

نحن على استعداد لكشف وتقييم الاستجابات الخاصة زيكف تي خلية، ماوس MHC--أنا ح-2Dبتيترامير294-302 -E. الببتيد ه294-302 يمكن أن تساعد ريناتوريب ح-2D بشكل صحيح وتسفر عن كمية عالية من MHC القابلة للذوبان-الأول (الشكل 3أ). في مقايسة التحول، يمكن ملاحظة كفاءة عالية في بيوتينيليشن (الشكل 3ب). في وقت لاحق، ثلاثة streptavidin الفلورية (آسيا والمحيط الهادئ، بي، و BV421)-معلم الرهن العقاري--أنا أنتجت تيتراميرس للكشف عن خلايا محددة زيكف تي (الشكل 3ج). كان تيترامير المسمى PE كفاءة أعلى للكشف عن CD8 محددة+ تي الخلية مقارنة آسيا والمحيط الهادئ والمسمى BV421 تيتراميرس، على الرغم من أن الاختلاف لم يكن معتدا به إحصائيا.

استخدام تيترامير294-302 ه، اكتشفنا لمفاوية T زيكف على حدة في طحال الفئران المصابة بالتدفق الخلوي في تلقيح ما بعد 7 د زيكف (3.49 ± 0.45 في المائة). أيضا، مشابهة للطريقة الموضحة في القسم 3 من هذا البروتوكول، مع 4 أسابيع بعد التحصين لقاح AdC7-M/E، لمفاوية T زيكف محددة، تم الكشف عن الطحال (6.89 ± 1.36%) (الشكل 4).

وعلاوة على ذلك، أننا نكتشف لمفاوية تسللت إلى أجهزة إيمونوبريفيليجيد، مثل المخ والخصيتين، بعد الإصابة زيكف. تم تعيين البوابات لتحديد ل CD3+CD8+ تي الخلايا في مجموع الخلايا الليمفاوية المخ والخصيتين. يمكن أن يتم الكشف عن نسبة عالية من الخلايا T تيترامير محددة294-302 ه في الدماغ (42.2 في المائة في CD3+CD8+ تي الخلايا) وفي الخصية (26.4 في المائة في CD3+CD8+ تي الخلايا) الخلايا الليمفاوية (الشكل 5).

Figure 1
الشكل 1 : وصف للعدوى زيكف في الفئران-/- Ifnar1- Ifnar1--/-- الفئران في 6-8 أسابيع من العمر أصيبوا بالوحدات المكونة للتركيز4 10 (فو) زيكف بالحقن ريتروربيتال، واستخدمت الفئران حقن مع برنامج تلفزيوني كعناصر تحكم غير مصاب. وتم رصد مورفولوجيا (A) وتغييرات الوزن (ب) للمصابين Ifnar1--/-- الفئران. وتبين الأسهم الحمراء Ifnar1--/-- الفئران عرض مع ميلوباراليسيس وموتور خزل سفلي بعد الإصابة. كانت تحصد العقول (ج) في 7 د بعد التطعيم والخصيتين (د) 0، 7، 14، والتلقيح بعد 30 يوما. تظهر الصور التمثيلية للمخ والخصيتين من الفئران مع مسطرة للإشارة إلى الأحجام. تمثل أشرطة الخطأ يعني ± sem. n = 10 الفئران كل مجموعة لكل تجربة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : الكشف عن زيكف والخلايا الليمفاوية في المخ والخصية في الفئران المصابة زيكف Ifnar1--/-- - (أ) هذا الفريق يظهر التغيرات التشريحية المرضية في الدماغ والخصيتين من الفئران المصابة زيكف مقارنة مع عناصر سلبية في د 7 بعد التطعيم. شريط المقياس = 25 ميكرومتر (اللوحة اليسرى) و 50 ميكرون (اللوحة اليمنى). وأجرى المقايسة (ب) الفلورة مع جسم Z6 مكافحة--زيكف (أخضر). وجمعت جميع عينات الأنسجة من الفئران المصابة زيكف في د 7 بعد التطعيم. كانت الملون الأنوية مع DAPI (أزرق). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ج) يظهر Immunohistochemistry تسلل قوي CD3+ تي الخلايا في الدماغ والخصية. شريط المقياس = 25 ميكرومتر (اللوحة اليسرى) و 50 ميكرون (اللوحة اليمنى). الأرجواني يشير إلى الهيماتوكسيلين، براون يمثل جسم CD3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : إعداد للرهن العقاري الخاصة زيكف--أنا تيتراميرس- (أ) ربط ه294-302 في 2D حب هو توضيح من في المختبر ريفولدينج. اللون الأزرق يشير إلى البروتين294-302 -E في 2D حب. اللون البرتقالي يمثل عنصر سلبي دون الببتيد. (ب) هذا الفريق يظهر الإنزيم التحول294-302 -E في 2D حب. (ج) موك يمثل عنصر تحكم برنامج تلفزيوني. ثلاثة ستريبتافيدين الفلورية (آسيا والمحيط الهادئ، بي، و BV421)-معلم الرهن العقاري--أنا استخدمت تيتراميرس للكشف عن خلايا محددة زيكف تي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : تدفق سيتوميتريك تحليل CD8 الخاصة بالفيروسات + خلايا تي في طحال الفئران المصابة زيكف وتحصين اللقاح. Ifnar1--/-- الفئران في 6-8 أسابيع عمر مصابون أما بالوحدات المكونة للتركيز4 10 (فو) من زيكف أو تلقي جرعة واحدة من 4 × 1010 الجسيمات الفيروسية AdC7-M/E أو برنامج تلفزيوني كعنصر سلبي. بعد 7 أيام بعد العدوى أو التحصين بعد 4 أسابيع، كانت تحصد سبلينوسيتيس الماوس وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. تظهر البيانات كما أجرى ± يعني التحليل الإحصائي التنمية المستدامة. استخدام ANOVA أحادي الاتجاه (لا يعتد: P > 0.05؛ *ف < 0.05؛ * *ف < 0.01؛ * * *ف < 0.001؛ * * *ف < 0.0001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 5
الشكل 5 : النابضة النتائج الاستراتيجية والممثل من CD8 الخاصة بفيروس+ تي الخلايا في المخ والخصيتين من الفئران المصابة زيكف. تظهر قطع تمثيلية لمفاوية تسلل في (أ) الدماغ و (ب) الخصية. يتم تعيين سلسلة بوابات لتحديد اللمفاوية مبعثر+ و CD3+ الأحداث. من هؤلاء، CD8+ الأحداث هي بوابة لتحليل خلايا تي حانمه على حدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Discussion

مكسبه تي خلية حانمه تلعب دوراً هاما في الخلوية الحصانة ضد العوامل الممرضة23. وهكذا، الكشف عن خلايا تي زيكف على حدة في أجهزة إيمونوبريفيليجيد منهجية حاسمة لفهم الاستجابات تي خلية مكافحة العدوى زيكف الطبيعية. وفي الوقت نفسه، الكشف عن استجابة خلايا T أداة ممتازة للتحقيق في مدى فعالية اللقاحات الفيروسية. وهنا نعرض بروتوكول شامل لتصور هذه التجارب، التي تشمل عزل الخلايا الليمفاوية من الطحال والدماغ، والخصيتين من الفئران المصابة زيكف، إعداد تيترامير294-302 حانمه ه إيمونودومينانت، الاعتراف CD8 الخاصة زيكف+ تي الخلايا في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة زيكف.

وأظهرت دراسة سابقة أنه يمكن الكشف عن زيكف العيش أو الحمض النووي الريبي في السائل المنوي المرضى الذكور، مما يشير إلى أن زيكف يمكن تجاوز حاجز الدم-الخصية وينسخ نفسه في الجهاز التناسلي24. سابقا، كما أظهرت أن زيكف يمكن أن يسبب تلف الخصيتين ويؤدي إلى العقم عند الذكور في الفئران25. يمكن أن تؤدي الإصابة زيكف إلى فريميا في القرود ريسوس، ويمكن الكشف عن الجيش الملكي النيبالي الفيروسية في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وكذلك في أجهزة الحشوي. وكشف إيمونوهيستوتشيميستري أن المستضدات الخاصة زيكف وعرضت في الجهاز العصبي المركزي و الأجهزة الطرفية متعددة26. أيضا، في نماذج مورين، يمكن حمل العدوى زيكف CD8 المضادة للفيروسات قوية+ استجابة خلايا T في الطحال والجهاز العصبي المركزي26.

مقارنة بالأعمال السابقة، تحدد هذه الدراسة أساليب منهجية للكشف عن CD8 الخاصة زيكف+ تي خلية الردود في المخ والخصيتين، ومواقع إيمونوبريفيليجيد. من المهم تقييم الأداء الوظيفي للخلايا التائية الخاصة بالفيروسات في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة زيكف. استخدام تيتراميرس للكشف عن CD8 الخاصة زيكف+ تي خلية الردود في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من شأنه أن يعزز فهمنا للالتهابات زيكف وعلى الاستجابات المناعية المضيف. استخدام تيترامير294-302 ه، يمكن عزل خلايا تي الخاصة بفيروس في المخ والخصية بالتدفق الخلوي، للتحقيق الخلوية آليات الحماية وإيمونوباثوجينيسيس أثناء مرض زيكف. وفي الوقت نفسه، أنه من المفيد للباحثين مواصلة التحقيق مهام CD8+ تي الخلايا للتحكم في زيكف، أو لتحسين إيمونوباثوجينيسيس في هذه الأجهزة أثناء الإصابة زيكف.

لتحليل CD8 مورين حدة مستضد+ تي خلية الردود في أجهزة إيمونوبريفيليجيد، أعد 2D حبتيترامير294-302 -E والكشف عن CD8+ تي الخلايا بالتدفق الخلوي. Tetramers أداة قوية للكشف عن خلايا محددة مستضد تي. هنا، تم إنشاء ثلاثة أنواع من ستريبتافيدين fluorochrome مترافق (آسيا والمحيط الهادئ، بي، و BV421). على الرغم من أن هناك لا توجد فروق معتد بها إحصائيا في آسيا والمحيط الهادئ-BV421-، و tetramers المسمى PE للكشف عن خلايا تي محددة مستضد، المسمى PE الرهن العقاري--أنا tetramers تسفر عن نتائج أفضل. ومن ثم، تم استخدام تيترامير المسمى PE طوال هذه الدراسة. من المثير للاهتمام، استناداً إلى تيترامير294-302 -E 2D ح PE المسمىب، اكتشفنا نسب عالية من خلايا تي حدة مستضد في المخ والخصيتين، مما يشير إلى قدرة الخلايا T الخاصة بالفيروس من الدم للهجرة أجهزة إيمونوبريفيليجيد.

ومع ذلك، توجد بعض القيود على البروتوكول. تيترامير294-302 -E 2D حبلأنه غير مفيد للبشرية تي خلية الكشف، كشف تيترامير مرهون بتقييد MHC. يزال يلزم فحص الببتيدات المقيدة-هلا إيمونودومينانت. إلى جانب ذلك، عدوى الرجعية-المداري فعال لعدوى زيكف ولكن قد لا تكون عملية ملائمة لبعض المحققين. وهكذا، وطرق أخرى للعدوى، بما في ذلك البريتوني، أو تحت الجلد، أو عن طريق الحقن الوريدي، يوصي أيضا.

في البروتوكول هو موضح هنا، هو خطوة حاسمة عزلة وحيدات من الدماغ والخصية. من المهم الحصول على الخلايا الليمفاوية عالية الجودة؛ وبالتالي، من المهم إيلاء الاهتمام إلى، على سبيل المثال، سرعة الطرد المركزي، قوة الأنسجة الطحن، وتشريح أنسجة المخ والخصية. وإلى جانب ذلك، لإعداد تيترامير, مثبطات البروتياز (بمسف، بيبستاتين، ليوبيبتين) مفيدة عند حماية بروتين من تتعرض للتدهور. ولذلك، فمن المنطقي لإضافة مثبط البروتياز إلى المخزن المؤقت ريفولدينج وتبادل المخزن المؤقت أثناء عملية إعداد تيترامير.

وفي الختام، فإننا نقدم أساليب الكشف عن استجابات تي خلية محددة مستضد في أجهزة إيمونوبريفيليجيد Ifnar1-/- نموذج الماوس لعدوى زيكف. يمكن تطبيق هذا المنهاج على نطاق واسع للتحقيق في آليات محصنة والناشئة من جديد الفيروسات التي يمكن تجاوز الحواجز بين الدم وأجهزة إيمونوبريفيليجيد. وعلاوة على ذلك، هذه الدراسة قد تمهد الطريق للتنمية المستقبلية للقاحات المرشحة وإيمونوثيرابيس.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بإعلان.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون غاري وونغ لتنقيح اللغة الإنجليزية. وأيده هذا العمل الوطني للبحوث الرئيسية وبرنامج التنمية في الصين (منحة 2017YFC1200202)، المشاريع الخاصة الرئيسية "بحوث الأمراض الصين المعدية" (منحة 2016ZX10004222-003). جورج ف. قاو محقق رئيسية رائدة في العلوم الطبيعية مؤسسة من الصين مبتكرة البحث الفريق الوطني (منحة 81621091).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Z6 our lab Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3 Santa Cruz sc-1127; RRID: AB_631128
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) ZSGB-BIO ZF-0308
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated CWBIO CW0115
FITC anti-mouse CD3 Biolegend 17A2
APC anti-mouse CD3 Biolegend 100236
PerCP anti-mouse CD8a Biolegend 100732
Percoll GE Healthcare P8370
PMSF Ameresco 0754-5G Toxic and corrosive reagent.
Handle with care
Streptadivin BD S4762-FZ Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and  stored at -20 °C
Pepstatin Sigma P4265-5MG 5 mg in 2.5 mL DMSO, aliquots stored at -20 ºC
Leupeptin Sigma L8511 5 mg in 2.5 mL dH2O, aliquots stored at - 20 ºC
Peptides Scilight-peptide Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C
RPMI 1640 Hyclone SH30809.01 Must be stored at 4 °C
DMSO MP 219605590 Store at room temperature.
APC-Streptadivin BD 554067 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
FITC-Streptadivin BD 554060 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
PE-Streptadivin BD 554061 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
BV421-Streptadivin BD 563259 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
PageRuler Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific  26614 Must be stored at 4 °C
Cell Strainers BF BF10-5040 Store at room temperature.
Amicon Ultra 100 kDa Millipore UFC510024 Store at room temperature.
Ultracentrifuge Thermo Fisher Scientific 
FACS Cantol Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Superdex 200 Increase 10/300 GL  GE healthcare 28990944
AKTA PURE GE healthcare
red blood cell lysis buffer Solarbio R1010 Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Hazin, A. N., et al. Computed Tomographic Findings in Microcephaly Associated with Zika Virus. The New England Journal of Medicine. 374 (22), 2193-2195 (2016).
  3. Zhang, Y., et al. Highly diversified Zika viruses imported to China, 2016. Protein & Cell. 7 (6), 461-464 (2016).
  4. Cauchemez, S., et al. Association between Zika virus and microcephaly in French Polynesia, 2013-15: a retrospective study. The Lancet. 387 (10033), 2125-2132 (2016).
  5. Turtle, L., et al. Human T cell responses to Japanese encephalitis virus in health and disease. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1331-1352 (2016).
  6. Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nature Communications. 7, 12204 (2016).
  7. Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nature Medicine. 22 (12), 1448-1455 (2016).
  8. Stettler, K., et al. cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
  9. Zhao, M., Zhang, H., Liu, K., Gao, G. F., Liu, W. J. Human T-cell immunity against the emerging and re-emerging viruses. Science China Life Sciences. 60 (12), 1307-1316 (2017).
  10. Huang, H., et al. CD8+ T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), 00900-00917 (2017).
  11. Elong Ngono, A., et al. Mapping and Role of the CD8+ T Cell Response During Primary Zika Virus Infection in Mice. Cell Host & Microbe. 21 (1), 35-46 (2017).
  12. Marques, E. T. A., Burke, D. S. Tradition and innovation in development of a Zika vaccine. The Lancet. 391 (10120), 516-517 (2017).
  13. Xu, K., et al. Recombinant Chimpanzee Adenovirus Vaccine AdC7-M/E Protects against Zika Virus Infection and Testis Damage. Journal of Virology. , 01722-01817 (2018).
  14. Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of human alloantigen-specific T cells from peripheral blood. Journal of Visualized Experiments. (93), e52257 (2014).
  15. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. Journal of Visualized Experiments. (68), e4420 (2012).
  16. Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen. Journal of Visualized Experiments. (105), e53256 (2015).
  17. Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. Journal of Visualized Experiments. (108), e53658 (2016).
  18. Altman, J. ohnD., et al. Phenotypic Analysis of Antigen-Specific T Lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  19. Li, H., Zhou, M., Han, J., Zhu, X., Dong, T., Gao, G. F., Tien, P. Generation of murine CTL by a hepatitis B virus-specific peptide and evaluation of the adjuvant effect of heat shock protein glycoprotein 96 and its terminal fragments. J Immunol. 174 (1), 195-204 (2005).
  20. Valkenburg, S. A., et al. Preemptive priming readily overcomes structure-based mechanisms of virus escape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5570-5575 (2013).
  21. Shang, T., et al. Toll-like receptor-initiated testicular innate immune responses in mouse Leydig cells. Endocrinology. 152 (7), 2827-2836 (2011).
  22. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), e52293 (2015).
  23. Zhou, M., et al. Screening and identification of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus-specific CTL epitopes. The Journal of Immunology. 177 (4), 2138-2145 (2006).
  24. Barzon, L., Lavezzo, E., Palu, G. Zika virus infection in semen: effect on human reproduction. The Lancet Infectious Diseases. 17 (11), 1107-1109 (2017).
  25. Ma, W., et al. Zika Virus Causes Testis Damage and Leads to Male Infertility in Mice. Cell. 167 (6), 1511-1524 (2016).
  26. Li, X. F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).

Tags

خلية تي محددة مستضد علم المناعة والعدوى، العدد 140، Zika الفيروس،، التطعيم، أجهزة إيمونوبريفيليجيد، تيترامير
تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1<sup>-/-</sup>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Zhang, H., Ma, W., Liu,… More

Zhang, Y., Zhang, H., Ma, W., Liu, K., Zhao, M., Zhao, Y., Lu, X., Zhang, F., Li, X., Gao, G. F., Liu, W. J. Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice. J. Vis. Exp. (140), e58110, doi:10.3791/58110 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter