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Immunology and Infection

संक्रमित Ifnar1 के Immunoprivileged अंगों में Zika वायरस-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन-चूहों/

Published: October 17, 2018 doi: 10.3791/58110
Automatic Translation
*1,2, *2, *3, 1,2, 4, 2, 5, 6, 3, 1,2,4,6, 1,2
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3State Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 4Research Network of Immunity and Health (RNIH), Beijing Institutes of Life Science, Chinese Academy of Sciences, 5Laboratory Animal Center, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 6CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Zika वायरस (ZIKV) संक्रमण के लिए Ifnar1-/- murine मॉडल के immunoprivileged अंगों में antigen-विशिष्ट T-कक्ष प्रत्युत्तरों का मूल्यांकन करने के लिए कोई प्रोटोकॉल वर्णन किया गया है । इस विधि सुरक्षा और ZIKV टीकों के immunopathogenesis के सेलुलर तंत्र की जांच के लिए निर्णायक है और उनके प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए भी मूल्यवान है ।

Abstract

Zika वायरस (ZIKV) immunoprivileged अंगों में सूजन पैदा कर सकते हैं (जैसे, मस्तिष्क और वृषण), Guillain-Barré सिंड्रोम के लिए अग्रणी है और परीक्षण को नुकसान पहुँचाए. ZIKV के साथ एक संक्रमण के दौरान, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ऊतकों में घुसपैठ करने के लिए दिखाया गया है । हालांकि, सेलुलर तंत्र है कि सुरक्षा और/या एक ZIKV संक्रमण के दौरान इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं के immunopathogenesis परिभाषित अभी भी मोटे तौर पर अज्ञात हैं । साथ ही, हम ZIKV-संक्रमित चूहों के इन immunoprivileged अंगों में वायरस-विशिष्ट टी-सेल कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के तरीकों का वर्णन करते हैं. इन पद्धतियों में शामिल हैं) एक ZIKV संक्रमण और वैक्सीन टीका में Ifnar1-/ ख) histopathology, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और immunohistochemistry परख वायरस के संक्रमण और मस्तिष्क में सूजन का पता लगाने के लिए, testes, और तिल्ली; c) ZIKV-व्युत्पन्न टी-सेल epitopes के एक tetramer की तैयारी; घ) मस्तिष्क से पृथक monocytes में ZIKV-विशिष्ट टी कोशिकाओं का पता लगाने, परीक्षण, और तिल्ली. इन तरीकों का उपयोग करना, यह संभव है antigen-विशिष्ट टी कोशिकाओं है कि immunoprivileged अंगों में घुसपैठ की है और संक्रमण के दौरान इन टी कोशिकाओं के कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए का पता लगाने के लिए: वायरस की मंजूरी के माध्यम से संभावित प्रतिरक्षा संरक्षण और /या immunopathogenesis सूजन को गहरा करने के लिए । इन निष्कर्षों को भी ZIKV के खिलाफ प्रतिरक्षण द्वारा प्रेरित टी कोशिकाओं के योगदान को स्पष्ट करने में मदद कर सकते हैं ।

Introduction

ZIKV एक मच्छर जनित flavivirus है कि पहले १९४७ में युगांडा में एक ज्वर रीसस समूल से पृथक किया गया है । हाल ही में, ZIKV एक सार्वजनिक स्वास्थ्य आपातकाल बन गया है, अमेरिका में अपनी तेजी से प्रसार और microcephaly और Guillain के लिए अपनी अप्रत्याशित कड़ी के कारण-Barré सिंड्रोम1,2,3। महामारी विज्ञान के आंकड़ों से, ZIKV लगभग ४,००० संक्रमित वयस्कों4प्रति में Guillain-Barré सिंड्रोम का कारण होना संदिग्ध हो गया है । इसके अलावा, ZIKV के बीच एक संबंध है और परीक्षण के संक्रमण/माउस मॉडल में नुकसान का प्रदर्शन किया गया है, सुझाव है कि ZIKV संक्रमण, कुछ परिस्थितियों में, रक्त वृषण बाधा बाईपास और अंततः पुरुष बांझपन 5 के लिए नेतृत्व कर सकते है . इन निष्कर्षों को पूरी तरह से एक ZIKV संक्रमण के दौरान सुरक्षात्मक या रोग प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की प्रेरण को समझने के महत्व पर प्रकाश डाला ।

बहुत ZIKV को सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के बारे में सीखा जा रहा है । CD4+ और सीडी 8+ टी-सेल प्रतिक्रियाओं को कैप्सिड, लिफाफे, और गैर संरचनात्मक प्रोटीन 1 (NS1) में मनाया गया है ZIKV-संक्रमित बंदरों और मनुष्यों6,7,8। चूहों में, कई अध्ययनों से संकेत दिया है कि सीडी 8+ टी कोशिकाओं ZIKV प्रतिकृति9,10,11को नियंत्रित करने में एक सुरक्षात्मक भूमिका निभाते हैं । महत्वपूर्ण बात, Jurado एट अल. प्रदर्शन किया है कि रक्त मस्तिष्क बाधा के टूटने में एक ZIKV संक्रमण के परिणाम और Ifnar1 के परीक्षण के भीतर सीडी 8+ प्रभाव टी कोशिकाओं के perivascular घुसपैठ-/ इसके अलावा, वे सीडी 8+ टी कोशिकाओं ZIKV-जुड़े पक्षाघात भड़काने और नवजात मस्तिष्क immunopathology में एक भूमिका निभाने के लिए दिखाई देते हैं कि पता चला. पिछले एक अध्ययन में, हम ZIKV-E294-302 tetramer तैयार किया और पता चला कि ZIKV-विशिष्ट सीडी 8+ टी कोशिकाओं के दिमाग और रीढ़ की हड्डी में मौजूद ZIKV-संक्रमित Ifnar1-/- चूहों, जो डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हो सकता है और ZIKV टीके का विकास10.

ZIKV संक्रमण को रोकने के लिए टीकाकरण के लिए तत्काल जरूरत के जवाब में, कई टीके आरएनए टीके, रिकॉमबिनेंट वेक्टर आधारित टीके, और शुद्ध प्रोटीन उपइकाई टीके सहित विकास के लिए नैदानिक चरणों में हैं । प्लाज्मिड डीएनए वैक्सीन चरण 1 नैदानिक परीक्षण12में है । ZIKV टीकों की सुरक्षा और प्रभावकारिता का मूल्यांकन, इसलिए महत्वपूर्ण है । टीके का एक लाभ उनके लिए विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं, जो ZIKV के खिलाफ संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है बटोरने की क्षमता है । ZIKV-व्युत्पन्न टी सेल epitope से संबंधित tetramers का उपयोग करके, एक एडीनोवायरस-वेक्टर आधारित ZIKV वैक्सीन द्वारा प्रेरित टी सेल immunoreactivity प्रतिरक्षित चूहों में पता लगाया जा सकता है, और दोनों एम और ई नच मजबूत प्रतिजन-विशिष्ट सीडी 8 प्रेरित करने के लिए दिखाए गए थे+ टी सेल immunoreactivity13.

एक वायरस के संक्रमण के दौरान, प्रमुख histocompatibility (MHC) अणुओं द्वारा प्रस्तुत पेप्टाइड एंटीजन की पहचान टी सेल रिसेप्टर (TCR) के लिए एक महत्वपूर्ण टी सेल की मध्यस्थता के लिए मेजबान14की रक्षा प्रणाली है. इस सिद्धांत के आधार पर, tetramer प्रौद्योगिकी एक अनूठा उपकरण को स्पष्ट भूमिकाओं कि प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने में खेलने के लिए है15। यह प्रोटोकॉल ZIKV संक्रमण के लिए Ifnar1-/- माउस मॉडल की स्थापना का वर्णन करता है, और तिल्ली, मस्तिष्क, और tetramer प्रौद्योगिकी का उपयोग करके चूहों के परीक्षण में प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं का पता लगाने । इसके अतिरिक्त, हम AdC7 चूहों में एक ZIKV वैक्सीन (प्रतिरक्षित-एम/ई) द्वारा प्रेरित टी सेल immunoreactivity का पता लगाने और मूल्यांकन करने के लिए ZIKV-E294-302 tetramer का इस्तेमाल किया । यह अध्ययन immunoprivileged अंगों में टी सेल प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए मार्गदर्शन प्रदान करता है और अपरा या भ्रूण मस्तिष्क में संभावित अनुप्रयोगों के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है ।

Protocol

पशु प्रयोगों के संस्थागत पशु देखभाल और राष्ट्रीय वायरल रोग नियंत्रण और रोकथाम, चीन सीडीसी के लिए संस्थान की उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । सभी प्रयोगों संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति को मंजूरी दे दी पशु प्रोटोकॉल के बाद प्रदर्शन किया गया ।

1. वायरस का संक्रमण

  1. वयस्क (6 से 8 सप्ताह पुराने) Ifnar1-/- (५०% पुरुष और ५०% महिला) मानक विशेष रोगज़नक़-मुक्त (SPF) शर्तों में चूहे, और उंहें भोजन और पानी के लिए नियमित रूप से उपयोग की अनुमति रखें ।
  2. ZIKV के साथ Ifnar1-/ चूहों को संक्रमित एक फास्फेट-बफर खारा में ZIKV के १०० µ एल के एक रेट्रो कक्षीय टीका के माध्यम से (पंजाब) बफर 1 एक्स 104 फोकस बनाने इकाइयों (FFUs) वायरस के. इसी प्रकार, पंजाबियों के बराबर मात्रा में नियंत्रण चूहे प्रदान करते हैं ।
    चेतावनी: ABSL2 शर्तों के तहत चूहों को संक्रमित और वायरस संक्रमित चूहों के साथ इन प्रक्रियाओं को सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन.
  3. 15 दिनों के लिए दैनिक चूहों के वजन और नैदानिक लक्षण (कंपन, चौंका देने वाला मार्च, द्विपक्षीय झूलता हुआ हिंद अंग) की निगरानी ।

2. ZIKV वैक्सीन के साथ प्रतिरक्षण

  1. 6 से 8 सप्ताह की आयु के बीच Ifnar1-/- (५०% पुरुष और ५०% महिला) चूहों का उपयोग करें । चूहों को 18 – 29 ° c के मानक SPF दशाओं में रखें और भोजन और पानी के उपयोग के साथ एक 12 ज लाइट/
  2. छुटकारा the Ifnar1-/- चूहों ZIKV टीका के साथ: १०० µ एल के AdC7-M/E [4 x 1010 (वायरस कणों)] एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के माध्यम से पंजाबियों बफर में (आइएमएस मार्ग) एक 23-जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर.
  3. इसी तरह, पंजाबियों की एक बराबर मात्रा के साथ नियंत्रण चूहों इंजेक्षन ।

3. तिल्ली से Monocytes का अलगाव

नोट: monocytes की तिल्ली से अलगाव पहले16उल्लेख के रूप में वर्णित है.

  1. Anesthetize प्रतिरक्षित और ZIKV-संक्रमित चूहों 7 डी पोस्ट-टीका, एक 5% isoflurane concentrationin १००% ऑक्सीजन का उपयोग कर (एक प्रवाह की दर के साथ 1 L/ चूहों को ग्रीवा विस्थापन करके Euthanize. तो, तुरंत ७५% इथेनॉल में पूरे माउस डुबकी ।
    चेतावनी: इस कदम से आगे, सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं aseptically एक सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
  2. सुई का प्रयोग, के अंगों को ठीक (euthanized, पहले संक्रमित/प्रतिरक्षित) चूहों फोम प्लेट पर पेट का सामना करना पड़ के साथ.
  3. एक बाँझ स्केलपेल के साथ छाती के लिए पेट midline के साथ त्वचा में कटौती, कैंची के साथ पेट की मांसपेशियों में कटौती, उदर गुहा का पर्दाफाश, और धीरे जिगर को दूर.
    नोट: लंबे, काले पेट के बाईं ओर लाल अंग तिल्ली है ।
  4. तिल्ली निकालें, यह पंजाब में 3x कुल्ला किसी भी रक्त को हटाने के लिए, और यह बर्फ के १.५ मिलीलीटर में जगह-कोल्ड रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट मीडियम (RPMI) । तिल्ली को बर्फ पर रखें ।
  5. तिल्ली से एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए, अंग (ओं) एक बाँझ ४० µm पर एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर जाल सेल छलनी जगह और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त आइस-कोल्ड RPMI मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें । एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के गोताख़ोर का प्रयोग, यांत्रिक रूप से अंग मैश (ओं) और जब तक अंग जाल के माध्यम से पूरी तरह से जमीन गया है मध्यम जोड़ें ।
  6. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ६०० x g पर यह केंद्रापसारक । supernatant निकालें ।
  7. एक लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis बफर (एनएच4सीएल, Na2EDTA, और KHCO3के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को पुनर्निलंबित, सामग्री की मेजदेखें) और 5 के लिए कमरे के तापमान पर lysis प्रतिक्रिया मशीन-6 मिनट ।
  8. के साथ आरबीसी lysis बंद करो 10 बर्फ की मिलीलीटर-शीत RPMI/FBS मध्यम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ६०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक । supernatant निकालें ।
  9. कोशिकाओं को पूरा RPMI मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ resuspend (RPMI के साथ 10% vol/vol FBS and १०० U/एमएल पेनिसिलिन-streptomycin) । एक छोटे से ट्यूब के लिए सेल निलंबन के 10 µ एल स्थानांतरण, यह ०.४% wt के 10 µ एल के साथ मिश्रण/vol trypan ब्लू, और एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की संख्या गिनती.

4. मस्तिष्क और परीक्षण से Monocytes का अलगाव

  1. Anesthetize ZIKV-संक्रमित पुरुष चूहों 7 डी पोस्ट-टीका, 5% isofluranein १००% ऑक्सीजन का उपयोग कर (एक प्रवाह दर के साथ 1 L/ चूहों को ग्रीवा विस्थापन करके Euthanize. तो, तुरंत ७५% इथेनॉल में पूरे माउस डुबकी ।
    चेतावनी: इस कदम के बाद से, सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं aseptically एक सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन किया जाना चाहिए । मस्तिष्क और परीक्षण से monocytes के अलगाव के रूप में वर्णित है पहले17उल्लेख किया है ।
  2. एक काटने बोर्ड पर प्रवण स्थिति में एक (euthanized, पहले से संक्रमित) पुरुष माउस स्थिर ।
  3. एक सीधे 1 एक्स 2 दांत संदंश के साथ खोपड़ी सुरक्षित, और खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए खोपड़ी पर एक midline चीरा बनाने के लिए आइरिस कैंची का उपयोग करें ।
  4. तेज चिमटी के साथ कक्षाओं के दोनों किनारों दबाना और मस्तिष्क को ठीक । फोरमेन मैग्नम में तेज आईरिस कैंची के एक टिप प्लेस और खोपड़ी में बाद में कटौती । दूसरी ओर के लिए इस चरण को दोहराएँ ।
  5. एक ही गुहा, ऊपर midline, नाक की ओर से ध्यान से कटौती करने के लिए तेज आईरिस कैंची का प्रयोग करें । मस्तिष्क के घायल होने से बचने के लिए संभव के रूप में कैंची के रूप में सतही के अंत रखने की कोशिश करें ।
  6. संदंश के साथ मस्तिष्क लिफ्ट और कपाल तंत्रिका तंतुओं को ध्यान से काटना के लिए तेज आईरिस कैंची का उपयोग करें । संदंश के साथ मस्तिष्क निकालें और यह एक 15 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा RPMI के 5 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में जगह/10% FBS मध्यम ।
  7. संदंश के साथ पेट की त्वचा को पकड़ो और झिल्ली और पेट की दीवार के माध्यम से एक अनुदैर्ध्य चीरा बनाने के लिए और पेट के lowermost भाग का पर्दाफाश करने के लिए तेज आईरिस कैंची का उपयोग करें । चीरा करने के लिए परीक्षण पुश. धीरे से चिमटी के साथ वसा परत खींचो और दोनों पक्षों पर एक गोलाकार वृषण बेनकाब ।
  8. फैट लेयर और अधिवृषण को सावधानीपूर्वक काटना करने के लिए शार्प आइरिस कैंची का प्रयोग करें । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में परीक्षण प्लेस बर्फ के 5 मिलीलीटर-शीत RPMI/10% FBS माध्यम संदंश के साथ ।
  9. मस्तिष्क या testes से एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए, एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर एक १०० µm मेष के साथ एक बाँझ सेल छलनी पर अंग जगह और 2 बर्फ के RPMI/10% FBS मध्यम जोड़ें । एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के गोताख़ोर का उपयोग करना, अंग मैश और मध्यम जोड़ जब तक अंग जाल के माध्यम से पूरी तरह से जमीन गया है ।
  10. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ६०० x g पर यह केंद्रापसारक । supernatant निकालें ।
  11. 30% घनत्व ढाल मध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं resuspend और, तो, उंहें बहुत धीरे से जोड़ने के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ७०% घनत्व ढाल मध्यम के 2 मिलीलीटर ।
  12. ब्रेक बंद स्विच और 4 ° c पर ट्यूबों 30 मिनट के लिए ८०० x g पर मध्यम परत से लिम्फोसाइटों प्राप्त करते हैं ।
  13. एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए एक चरण स्थानांतरण, ठंड RPMI के 10 मिलीलीटर जोड़ें/10% FBS मध्यम, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक । supernatant निकालें ।
  14. 10 मिलीलीटर बर्फ ठंडा RPMI/FBS मध्यम के साथ कोशिकाओं resuspend और उंहें ६०० x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक । supernatant निकालें ।
  15. पूर्ण RPMI मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं resuspend और चरण ३.९ में के रूप में कोशिकाओं की संख्या गिनती ।

५. Tetramer तयारी

  1. निर्माण plasmids ज के extracellular डोमेन-2dबी के सी पर एक biotinylated साइट टैग के साथ व्यक्त α3 डोमेन और β2एम pET28a सदिश का उपयोग करके एक NdeI और XohI प्रतिबंध साइट के साथ18।
  2. एक्सप्रेस और एच 2dबी और β2एम के शामिल होने के निकायों के रूप में पहले20वर्णित तैयार करते हैं ।
  3. MHC/पेप्टाइड परिसर एच-2dबी-ई294-302।
    1. एक refold समाधान के २०० मिलीलीटर तैयार करें [१०० mm Tris-HCl (pH ८.०), ४०० mm L-arginine, 2 mm EDTA-Na, 5 mm GSG, और ०.५ mm GSSG] । जोड़ने के लिए संकोची अवरोधकों: phenylmethylsulphonyl फ्लोराइड की 2 मिलीलीटर (PMSF, स्टॉक १०० मिमी), १०० µ एल के pepstatin (शेयर 2 मिलीग्राम/एमएल), और १०० µ एल के leupeptin (स्टॉक 2 मिलीग्राम/एमएल) । 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर ठंडा ।
    2. एच 2dबी, β2m जोड़ें, और पुनः प्रकट समाधान के लिए पेप्टाइड ।
      1. एक सिरिंज का उपयोग कर एक guanidine समाधान (30 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक) के β2m के ५०० µ एल इंजेक्षन । इस के लिए, एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के साथ एक 23 जी सुई का उपयोग करें और ड्रॉप द्वारा फिर से प्रकट समाधान ड्रॉप में β2m इंजेक्षन. समाधान लगातार रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर १५० आरपीएम पर धीरे-धीरे क्रियाशीलता ।
      2. β2m के बाद समाधान में भंग किया गया है, DMSO के २०० µ l में 2 मिलीग्राम ई294-302 पेप्टाइड को हल करने और जल्दी से एक पिपेट का उपयोग कर समाधान में सुई. धीरे 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १५० rpm पर समाधान हलचल ।
      3. एक guanidine समाधान में भंग एच 2dबी की १.५ मिलीलीटर सुई । हलचल बार एच के लिए १५० rpm पर घूर्णन-2dबी के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 8-10 एच ।
        नोट: समाधान एक बंद बॉक्स में एक ठंडे कमरे में रखा गया था ।
    3. एक 10 केडीए झिल्ली के साथ एक दबाव चैंबर में फिर से प्रकाशित प्रोटीन ध्यान केंद्रित । एक्सचेंज बफर [20 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच 8.0), ५० mm NaCl] चैंबर के लिए और यह 30-50 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए ध्यान केंद्रित ।
    4. स्थानांतरण एक केंद्रापसारक ट्यूब के लिए समाधान का खुलासा और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर २,५०० x g पर स्पिन ।
    5. ध्यान से एक 10 केडीए केंद्रापसारक फिल्टर करने के लिए supernatant हस्तांतरण और आगे यह 30 मिनट के लिए २,५०० एक्स जी में ५०० µ एल के एक अंतिम मात्रा के लिए ध्यान केंद्रित ।
    6. एक ताजा ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण और 15 मिनट के लिए १२,००० x g पर स्पिन । S200 10/300 जीएल जेल filtration क्रोमैटोग्राफी के साथ प्रोटीन को शुद्ध करें ।
    7. MHC जटिल चोटी लीजिए और यह ३५० µ एल के एक अंतिम मात्रा के लिए ध्यान केंद्रित
  4. biotinylation के लिए एक ५००-µ l प्रतिक्रिया मात्रा उत्पन्न करने के लिए, रीजेंट्स में निंनलिखित क्रम में जोड़ें: १०० समाधान के µ l a [0.5 m bicine (pH ८.३)], १०० µ l of समाधान B (१०० mM एटीपी, १०० mm MgOAc, २०० µ μ बायोटिन), १०० µ l of extra d-बायोटिन (५०० µ μ बायोटिन) , 20 µ l के बिरा एंजाइम (६० µ g), ०.५ µ l के pepstatin (2 mg/एमएल), और ०.५ µ l के leupeptin (2 mg/ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्रतिक्रिया ट्यूब गर्मी ।
    चेतावनी: biotinylating प्रतिक्रिया करने के लिए किसी भी EDTA जोड़ नहीं है ।
  5. किसी भी अतिरिक्त बायोटिन को हटाने के लिए एक S200 10/300 जीएल जेल निस्पंदन कॉलम का उपयोग कर MHC शुद्ध ।
  6. एक streptavidin-पाली परख18के साथ biotinylating दक्षता का निर्धारण ।
    1. 30 मिनट के लिए बर्फ पर तीन नमूने, ए, बी, और सी, तैयार । फिर, एक 10% एसडीएस द्वारा परिणामों का विश्लेषण-पृष्ठ । नमूना एक biotinylated MHC अणुओं के 8 µ एल और विनिमय बफर के 2 µ एल के होते हैं, biotinylated MHC अणुओं के 8 µ l का नमूना बी और streptavidin के 2 µ l (20 मिलीग्राम/एमएल), और µ के 2 streptavidin एल के नमूना सी (20 मिलीग्राम/एमएल) और 8 µ एल एक्सचेंज बफर ।
      चेतावनी: नमूना उबाल नहीं है ।
  7. biotinylated MHC अणुओं के रूप multimers ।
    1. 1:5 के एक तिल के अनुपात में phycoerythrin-लेबल streptavidin के साथ biotinylated E294-302 पेप्टाइड-एच2डीबी जटिल मिश्रण द्वारा tetramer उत्पादन सभी biotinylated MHC अणुओं की एक पूरी बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए ।
    2. tetramerization के लिए आवश्यक streptavidin-संयुग्मी की मात्रा की गणना करें ।
      1. प्रोटीन एकाग्रता और दाढ़ वजन के लिए MHC/पेप्टाइड परिसरों लेखांकन के तिल का निर्धारण (उदाहरण: कुल प्रोटीन की १.८ मिलीग्राम = ४० nmol).
      2. streptavidin के तिल की गणना-MHC के तिल को विभाजित करके आवश्यक संयुग्मी/पेप्टाइड द्वारा 5 (उदाहरण: 40/5 = 8 nmol of streptavidin-संयुग्मी).
      3. streptavidin-संयुग्मी (उदाहरण: streptavidin-PE [३००,००० g/M] → 8 nmol = २,४०० g) के आधार पर (µ g) में आवश्यक streptavidin की मात्रा की गणना करें ।
    3. streptavidin-phycoerythrin को 10 नमूनों में बांट लें । एक biotinylated E294-302 पेप्टाइड-एच2डीबी परिसर, 20 मिनट के अंतराल पर युक्त ट्यूब के लिए प्रत्येक नमूने जोड़ें । पिछले नमूना लोड करने के बाद, अंधेरे में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया ट्यूब गर्मी ।
  8. एक १०० केडीए स्पिन ट्यूब में multimerized रिएजेंट लागू करें और यह 4 ° c पर २,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा एक मात्रा के लिए ध्यान केंद्रित < 100 µ l
  9. 4 मिलीलीटर (पीएच ८.०) का उपयोग करके स्पिन ट्यूब में नमूने को पतला करें और इसे फिर से < 100 µ l पर केंद्रित करें ।
  10. पंजाब में बफर एक्सचेंज कदम दोहराएं (पीएच ८.०) 4x ।
  11. कुल मात्रा को फिर से भरने के लिए ५०० µ एल पंजाबियों (पीएच ८.०) का उपयोग कर । 2 की अनुमानित एकाग्रता के लिए नमूना ध्यान केंद्रित-2.5 मिलीग्राम/एमएल पर २,००० एक्स जी में 4 डिग्री सेल्सियस । 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में नमूना स्टोर.

6. फ्लो Cytometry

  1. (कदम ३.९ और/CD32 एफसी के ०.१ µ एल के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर) सेल निलंबन (से मशीन) एंटी-murine CD16 के लिए 20 µ l (कमजोर पड़ने वाला पहलू 1:200) के लिए 10 मिनट के लिए, किसी भी विशिष्ट बाध्यकारी को रोकने के लिए प्रति एजेंट अवरुद्ध ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस से कम 15 मिनट के लिए २०,००० x g पर tetramer ट्यूब केंद्रापसारक ।
  3. एक ९६-अच्छी तरह से platecontaining 1 एक्स 106 कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 20 µ एल जोड़ें ।
  4. सभी प्रयोगात्मक ट्यूबों दाग करने के लिए ई294-302 tetramer मिश्रण का एक पर्याप्त मात्रा में तैयार करें । pipetting त्रुटियों के लिए खाते के लिए इस मिश्रण की कुल मात्रा का 15% की एक अतिरिक्त तैयार करें । पतला ई294-302 tetramers (2 मिलीग्राम/एमएल, 1 µ एल परीक्षण) FACS बफर में (पंजाब, ०.५% FBS) इतना है कि ई294-302 µ मिश्रण के 20 tetramer एल प्रत्येक परीक्षण के लिए जोड़ा जाता है ।
  5. ई294-302 tetramer मिश्रण के 20 µ एल जोड़ने के लिए ९६ अच्छी तरह से थाली । इस कदम के अंत तक, एक अच्छी तरह से अंतिम मात्रा में ४० µ l. 30 मिनट के लिए अस्थायी कमरे में अंधेरे में थाली मशीन होना चाहिए.
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें (FITC-संयुग्मित या APC-संयुग्मित विरोधी CD3 (०.२ मिलीग्राम/PerCP-संयुग्मित विरोधी सीडी 8 (०.२ मिलीग्राम/एमएल)) पर 1 µ l/परीक्षण करने के लिए सेल निलंबन और, फिर, यह 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए मशीन ।
  7. धो FACS बफर के 2 मिलीलीटर के साथ 2x कोशिकाओं और उंहें 5 मिनट के लिए ६०० x g पर केंद्रापसारक । ध्यान से महाप्राण supernatant और कोशिकाओं को resuspend २०० µ एल के FACS बफर के साथ ।
  8. अस्थाई रूप से प्रवाह cytometric विश्लेषण तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान ।
  9. प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए निम्न गेटिंग कार्यनीति का उपयोग करें.
    1. एक फॉरवर्ड स्कैटर (FSC) बनाम साइड स्कैटर (SSC) क्षेत्र की साजिश रचने के द्वारा तिरछे संकुल singlets पर एक गेट बनाएँ.
    2. फिर, CD3 बनाम साइड कैटर (एसएससी) द्वारा CD3+ कोशिकाओं पर गेट; अगला, CD3+ सीडी 8+ कोशिकाओं पर गेट; अंत में, बाह्यरेखा सीडी 8+ tetramer+ कक्ष19।

7. Histopathology, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और Immunohistochemistry परख

  1. Histopathology परख
    1. ZIKV-संक्रमित Ifnar1-/- चूहों 7 डी पोस्ट-टीका के मस्तिष्क और वृषण ऊतकों को इकट्ठा करने और 4% तटस्थ बफर formaldehyde में उन्हें ठीक ।
      सावधानी: Paraformaldehyde विषाक्त है; उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें ।
    2. तेल में ऊतक एंबेड ।
    3. एक vibratome का उपयोग कर 5 मिमी पर ऊतक अनुभाग ।
    4. hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ ऊतक दाग ।
  2. Immunohistochemistry परख
    1. Deparaffinize, rehydrat, और प्रतिजन-ऊतक वर्गों को पुनः प्राप्त, प्रक्रियाओं के आधार पर पहले वर्णित21.
    2. 10 मिनट के लिए (पीएच ७.६) पंजाब में 3% एच2ओ2 के साथ ऊतक वर्गों का इलाज और 10 मिनट के लिए 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के साथ उन्हें ब्लॉक.
    3. चूहे विरोधी माउस CD3 एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने: 1/1000) के लिए 8 घंटे के कमरे के तापमान पर और, फिर, उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में मशीन के साथ ऊतक वर्गों की मशीन ।
    4. पंजाबियों के साथ ऊतकों कुल्ला और, तो, उंहें biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी के 3 बूंदें (कमजोर पड़ने: 1/1000) के लिए 2 घंटे के कमरे के तापमान पर, avidin के 3 बूंदें-बायोटिन-peroxidase (कमजोर पड़ने: 1/200) के साथ गर्मी कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ।
    5. 30, 30 के 3 बूंदें-diaminobenzidine tetrahydrochloride (कमजोर पड़ने: 1/1000), के रूप में पहले22वर्णित के साथ बाइंड ।
    6. Counterstain के hematoxylin के साथ ऊतक वर्गों ।
  3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख
    1. हवा-कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए जमे हुए वृषण वर्गों (6 मिमी) सूखी ।
    2. 10 मिनट के लिए बर्फ ठंडा एसीटोन के साथ उंहें ठीक ।
    3. 3x के लिए पंजाबियों के साथ वर्गों धो और एक अवरुद्ध बफर (1% BSA, ०.३% ट्राइटन, 1x पंजाब) के साथ 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर उंहें ब्लॉक ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी (Z6) (20 µ जी/एमएल) के साथ ऊतक वर्गों की मशीन ।
    5. पंजाबियों के साथ ऊतकों कुल्ला और माध्यमिक एंटीबॉडी लागू (कमजोर पड़ने का पहलू: 1/200) 1 के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एच ।
    6. टिशू अनुभागों को पंजाबियों से धोएं और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए उन्हें 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (कमजोर कारक: 1/1000) का उपयोग करके नाभिक के लिए counterstain ।

Representative Results

इन तरीकों के बाद, हम ZIKV संक्रमण के लिए एक murine मॉडल विकसित किया है । Ifnar1-/- चूहों की उंर के 6-8 सप्ताह से संक्रमित थे 1 x 104 फोकस बनाने इकाइयों (FFU) retroorbital इंजेक्शन द्वारा ZIKV के । रोग लक्षण और लक्षण (चित्रा 1A), साथ ही वजन में परिवर्तन (चित्रा 1ख), ZIKV के साथ एक संक्रमण के बाद Ifnar1-/ चूहों में मनाया गया । murine दिमाग स्पष्ट शोफ और hyperemia दिखाया (चित्रा 1सी) । इस बीच, testes धीरे सिकुड़ गया (चित्रा 1डी) । इसके अलावा, रोग परिवर्तन और ऊतक के विनाश मस्तिष्क में पाए गए थे और testes (चित्रा 2ए) । हम एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख प्रदर्शन के लिए मस्तिष्क में ZIKV का पता लगाने और परीक्षण (चित्रा 2ख) । immunostaining (चित्रा 2बी) द्वारा मस्तिष्क और वृषण में उच्च वायरल लोड का पता लगाया गया । Immunohistochemistry ने ZIKV (चित्रा 2सी) के साथ संक्रमण के बाद चूहों के मस्तिष्क में CD3+ टी कोशिकाओं की दमदार घुसपैठ दिखाई ।

का पता लगाने और ZIKV-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए, हम एक माउस MHC-I H-2db-E294-302 tetramer तैयार किया । पेप्टाइड ई294-302 मदद कर सकता है एच 2 डीबी ठीक हो जाना और घुलनशील MHC की एक उच्च राशि उपज-मैं (चित्रा 3ए) । पाली परख में, biotinylation में एक उच्च दक्षता देखा जा सकता है (चित्रा 3बी) । इसके बाद, तीन streptavidin प्रतिदीप्ति (APC, पीई, और BV421)-टैग pMHC-मैं tetramers ZIKV-विशिष्ट टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उत्पादन किया गया (चित्रा 3सी). पीई-लेबल tetramer एक उच्च प्रभावकारिता APC की तुलना में विशिष्ट सीडी 8+ टी सेल का पता लगाने के लिए था-और BV421-लेबल tetramers, हालांकि अंतर सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं था.

E294-302 tetramer का उपयोग करते हुए, हमने संक्रमित चूहों की तिल्ली में ZIKV-विशिष्ट टी लिम्फोसाइटों का पता लगाया, प्रवाह cytometry द्वारा 7 डी पद-टीका की (३.४९ ± ०.४५%) । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के खंड 3 में वर्णित विधि के समान, 4 सप्ताह के बाद AdC7-एम/ई वैक्सीन, ZIKV-विशिष्ट टी लिम्फोसाइटों तिल्ली में पाया गया के प्रतिरक्षण (६.८९ ± १.३६%) (चित्रा 4).

इसके अलावा, हम immunoprivileged अंगों में घुसपैठ लिम्फोसाइटों का पता लगाया, ऐसे मस्तिष्क और परीक्षण के रूप में, ZIKV संक्रमण के बाद । द्वार मस्तिष्क और परीक्षण के कुल लिम्फोसाइटों में CD3+सीडी 8+ टी कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए सेट किया गया था । ई294-302 tetramer-विशिष्ट टी कोशिकाओं के एक उच्च अनुपात मस्तिष्क में पाया जा सकता है (४२.२% CD3+सीडी 8+ टी कोशिकाओं में) और वृषण (२६.४% CD3+सीडी 8+ टी कोशिकाओं में) लिम्फोसाइटों (चित्रा 5).

Figure 1
चित्रा 1 : Ifnar1-/- चूहों में ZIKV संक्रमण के लक्षण वर्णन । Ifnar1-/- 6 पर चूहों-उंर के 8 सप्ताह retroorbital इंजेक्शन द्वारा ZIKV के 104 फोकस बनाने इकाइयों (FFU) से संक्रमित थे, और पंजाबियों के साथ इंजेक्शन चूहों संक्रमित नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । (क) आकृति विज्ञान और (ख) संक्रमित Ifnar1-/ चूहों के वजन परिवर्तन पर नजर रखी गई । लाल तीर संक्रमण के बाद myeloparalysis और मोटर paraparesis के साथ प्रस्तुत Ifnar1-/- चूहों से संकेत मिलता है । (ग) 7 डी पद पर दिमाग टीका और (घ) 0, 7, 14, और 30 दिनों में परीक्षण के बाद टीका काटा गया । मस्तिष्क के प्रतिनिधि छवियों और चूहों से परीक्षण आकार इंगित करने के लिए एक शासक के साथ दिखाया जाता है. त्रुटि पट्टियों का प्रतिनिधित्व मतलब ± SEM. n = 10 प्रति समूह प्रयोग प्रति चूहों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : ZIKV और लिम्फोसाइटों के मस्तिष्क और वृषण में ZIKV-संक्रमित Ifnar1- चूहों का पता लगाना. (क) यह पैनल मस्तिष्क में histopathological परिवर्तन दिखाता है और ७ डी पोस्ट-टीका पर ऋणात्मक नियंत्रणों की तुलना में ZIKV-संक्रमित चूहों से परीक्षण करता है. स्केल बार = 25 µm (बायां फलक) और ५० µm (दायां फलक) । (ख) एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख विरोधी ZIKV Z6 एंटीबॉडी (ग्रीन) के साथ प्रदर्शन किया गया था । ७ डी पोस्ट-टीका पर ZIKV संक्रमित चूहों से सभी ऊतक के नमूने एकत्र किए गए. नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग थे । स्केल बार = ५० µm. (ग) Immunohistochemistry मस्तिष्क और वृषण में CD3+ टी कोशिकाओं की एक मजबूत घुसपैठ दिखाता है । स्केल बार = 25 µm (बायां फलक) और ५० µm (दायां फलक) । बैंगनी hematoxylin इंगित करता है, भूरा CD3 एंटीबॉडी को दर्शाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : ZIKV-विशिष्ट pMHC-I tetramers की तैयारी । (क) ई294-302 के बंधन को एच 2dबी में एक द्वारा आविर्भाव है एक इन विट्रो में । ब्लू एच 2dबी-ई294-302 प्रोटीन इंगित करता है । नारंगी पेप्टाइड के बिना नकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है । (ख) यह पैनल एच 2dबी-ई294-302 पाली परख दिखाता है । (ग) मॉक एक पंजाब कंट्रोल का प्रतिनिधित्व करता है । तीन streptavidin प्रतिदीप्ति (APC, पीई, और BV421)-टैग की गईं pMHC-I tetramers ZIKV-विशिष्ट टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : वायरस-विशिष्ट सीडी 8 का प्रवाह cytometric विश्लेषण + ZIKV की तिल्ली में टी कोशिकाओं-संक्रमित और वैक्सीन-प्रतिरक्षित चूहों. Ifnar1-/- 6-8 सप्ताह की उंर में चूहों या तो 104 फोकस बनाने इकाइयों (FFU) ZIKV के साथ संक्रमित थे या एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में AdC7-M/E या पंजाब के 4 एक्स 1010 वायरल कणों की एक खुराक प्राप्त की । 7 दिनों के बाद संक्रमण या 4 सप्ताह के बाद टीकाकरण, माउस splenocytes काटा और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में दिखाया जाता है । सांख्यिकीय विश्लेषण एक-तरफ़ा ANOVA (महत्वपूर्ण नहीं: p > ०.०५; *p < ०.०५; * *p < ०.०१; * * *p < ०.००१; * * * *p < ०.०००१) का उपयोग करके किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 5
चित्रा 5 : गेटिंग रणनीति और मस्तिष्क में वायरस विशिष्ट सीडी 8+ टी कोशिकाओं के प्रतिनिधि परिणाम और ZIKV संक्रमित चूहों के परीक्षण. प्रतिनिधि भूखंड (क) मस्तिष्क और (ख) वृषण में घुसपैठ लिम्फोसाइटों के लिए दिखाए जाते हैं. गेट्स की एक उत्तराधिकार का चयन करने के लिए सेट है लसीकावत्-तितर बितर+ और CD3+ घटनाओं । इनमें से, सीडी 8+ ईवेंट्स epitope-विशिष्ट T कक्षों के विश्लेषण के लिए gated हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Discussion

Immunogenic टी सेल epitope सेलुलर प्रतिरक्षा के खिलाफ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है23रोगजनकों । इस प्रकार, immunoprivileged अंगों में ZIKV-विशिष्ट टी कोशिकाओं का पता लगाने के प्राकृतिक ZIKV संक्रमण के खिलाफ टी सेल प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण पद्धति है । इस बीच, टी सेल रिस्पांस डिटेक्शन वायरल वैक्सीन की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है । यहां, हम प्रयोगों, जो तिल्ली, मस्तिष्क से लिम्फोसाइटों के अलगाव शामिल कल्पना करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल दिखाने के लिए, और ZIKV-संक्रमित चूहों के परीक्षण, immunodominant epitope ई294-302 tetramer की तैयारी, और ZIKV-संक्रमित चूहों के immunoprivileged अंगों में ZIKV-विशिष्ट सीडी 8+ टी कोशिकाओं की मान्यता.

एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि एक जीवित ZIKV या उसकी आरएनए पुरुष रोगियों के वीर्य में पता लगाया जा सकता है, जो इंगित करता है कि ZIKV रक्त वृषण बाधा बाईपास और प्रजनन प्रणाली में खुद को दोहराने कर सकते हैं24. पहले, हम यह भी पता चला है कि ZIKV परीक्षण नुकसान का कारण बन सकता है और चूहों25में पुरुष बांझपन के लिए सीसा । ZIKV संक्रमण रीसस बंदरों में viremia का कारण बन सकता है, और वायरल आरएनए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में पाया जा सकता है, साथ ही आंत अंगों में । Immunohistochemistry से पता चला कि ZIKV-विशिष्ट एंटीजन सीएनएस में प्रस्तुत किए गए और मल्टीपल पेरिफेरल अंगों को26. इसके अलावा, murine मॉडल में, ZIKV संक्रमण प्लीहा और26सीएनएस में एक मजबूत एंटीवायरल सीडी 8+ टी सेल प्रतिक्रिया पैदा कर सकता है ।

पिछले काम की तुलना में, इस अध्ययन के लिए व्यवस्थित तरीके स्थापित ZIKV-विशिष्ट सीडी 8+ टी-सेल प्रतिक्रियाओं मस्तिष्क और testes, जो immunoprivileged साइटों रहे है में पता लगाने के लिए । ZIKV-संक्रमित चूहों के immunoprivileged अंगों में विषाणु-विशिष्ट टी कोशिकाओं की कार्यक्षमता का आकलन करना जरूरी है. immunoprivileged अंगों में ZIKV-विशिष्ट सीडी 8+ टी-सेल प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए tetramers का उपयोग बहुत ZIKV संक्रमण और उनके मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के बारे में हमारी समझ में वृद्धि होगी । ई294-302 tetramer का उपयोग करना, मस्तिष्क और वृषण में वायरस विशिष्ट टी कोशिकाओं को प्रवाह cytometry द्वारा अलग किया जा सकता है, एक ZIKV संक्रमण के दौरान सुरक्षा और immunopathogenesis के सेलुलर तंत्र की जांच करने के लिए । इस बीच, यह ZIKV को नियंत्रित करने के लिए सीडी 8+ टी कोशिकाओं के कार्यों को आगे की जांच करने के लिए, या ZIKV संक्रमण के दौरान इन अंगों में immunopathogenesis को बढ़ाने के लिए शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी है ।

immunoprivileged अंगों में antigen-विशिष्ट murine सीडी 8+ टी-सेल प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए, हम एच 2dबी-ई294-302 tetramer तैयार है और सीडी 8+ टी कोशिकाओं का पता लगाया द्वारा प्रवाह cytometry । Tetramers antigen-विशिष्ट टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं । यहाँ तीन प्रकार के fluorochrome-संयुग्मित streptavidin (सुरक्ष, PE, and BV421) उत्पन्न हुए । यद्यपि APC-, BV421-, और pe-लेबल tetramers antigen-विशिष्ट T कक्षों का पता लगाने के लिए में कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर हैं, pe-लेबल pMHC-I tetramers श्रेष्ठ परिणाम प्राप्त । अत: इस अध्ययन में पीई-लेबल tetramer का प्रयोग किया गया । मजे की बात है, पीई लेबल एच 2dबी-ई294-302 tetramer पर आधारित है, हम दोनों मस्तिष्क और परीक्षण में प्रतिजन विशिष्ट टी कोशिकाओं के उच्च अनुपात का पता चला, जो वायरस के रक्त से विशिष्ट टी कोशिकाओं की माइग्रेशन क्षमता का संकेत immunoprivileged अंगों ।

हालांकि, प्रोटोकॉल के लिए कुछ सीमाएं हैं । एच 2dबी-ई294-302 tetramer मानव टी सेल का पता लगाने के लिए उपयोगी नहीं है, क्योंकि tetramer का पता लगाने MHC प्रतिबंध पर निर्भर है । immunodominant एचएलए-प्रतिबंधित पेप्टाइड्स की स्क्रीनिंग की अब भी जरूरत है । इसके अलावा, रेट्रो कक्षीय संक्रमण एक ZIKV संक्रमण के लिए प्रभावी है, लेकिन कुछ जांचकर्ताओं के लिए एक सुविधाजनक आपरेशन नहीं हो सकता है । इस प्रकार, संक्रमण के अंय मार्गों, पेरिटोनियल, चमड़े के नीचे, या नसों सहित, भी सिफारिश कर रहे हैं ।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल में, एक महत्वपूर्ण कदम मस्तिष्क और वृषण से monocytes का अलगाव है । यह उच्च गुणवत्ता लिम्फोसाइटों प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है; इस प्रकार, यह ध्यान देना महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए, केंद्रापसारक गति, पीस ऊतक की ताकत है, और मस्तिष्क और वृषण ऊतक के विच्छेदन । इसके अलावा, tetramer तैयारी के लिए, छेड़ने वाला अवरोधकों (PMSF, pepstatin, leupeptin) जब एक प्रोटीन को नीचा होने से बचाने में सहायक होते हैं । इसलिए, यह समझ में आता है करने के लिए एक छेड़ने अवरोधक जोड़ने के लिए बफर और tetramer तैयारी की प्रक्रिया के दौरान बफर विनिमय ।

अंत में, हम एक ZIKV संक्रमण के लिए Ifnar1-/- माउस मॉडल के immunoprivileged अंगों में प्रतिजन-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के तरीके प्रस्तुत करते हैं । इस मंच व्यापक रूप से उभरते और फिर से उभरते वायरस है जो रक्त और immunoprivileged अंगों के बीच बाधाओं बाईपास कर सकते है की प्रतिरक्षा तंत्र की जांच लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, इस अध्ययन के उंमीदवार टीके और immunotherapies के भविष्य के विकास के लिए मार्ग प्रशस्त हो सकता है ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है.

Acknowledgments

लेखक अंग्रेजी संशोधन के लिए गैरी वोंग का शुक्र है । यह काम चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (ग्रांट 2017YFC1200202), चीन के संक्रामक रोग अनुसंधान (ग्रांट 2016ZX10004222-003) के लिए प्रमुख विशेष परियोजनाओं द्वारा समर्थित किया गया. जॉर्ज एफ गाओ चीन अभिनव अनुसंधान समूह (अनुदान ८१६२१०९१) के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन के एक प्रमुख अंवेषक है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Z6 our lab Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3 Santa Cruz sc-1127; RRID: AB_631128
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) ZSGB-BIO ZF-0308
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated CWBIO CW0115
FITC anti-mouse CD3 Biolegend 17A2
APC anti-mouse CD3 Biolegend 100236
PerCP anti-mouse CD8a Biolegend 100732
Percoll GE Healthcare P8370
PMSF Ameresco 0754-5G Toxic and corrosive reagent.
Handle with care
Streptadivin BD S4762-FZ Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and  stored at -20 °C
Pepstatin Sigma P4265-5MG 5 mg in 2.5 mL DMSO, aliquots stored at -20 ºC
Leupeptin Sigma L8511 5 mg in 2.5 mL dH2O, aliquots stored at - 20 ºC
Peptides Scilight-peptide Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C
RPMI 1640 Hyclone SH30809.01 Must be stored at 4 °C
DMSO MP 219605590 Store at room temperature.
APC-Streptadivin BD 554067 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
FITC-Streptadivin BD 554060 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
PE-Streptadivin BD 554061 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
BV421-Streptadivin BD 563259 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
PageRuler Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific  26614 Must be stored at 4 °C
Cell Strainers BF BF10-5040 Store at room temperature.
Amicon Ultra 100 kDa Millipore UFC510024 Store at room temperature.
Ultracentrifuge Thermo Fisher Scientific 
FACS Cantol Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Superdex 200 Increase 10/300 GL  GE healthcare 28990944
AKTA PURE GE healthcare
red blood cell lysis buffer Solarbio R1010 Store at 4 °C.

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४० Zika वायरस प्रतिजन-विशिष्ट टी सेल टीकाकरण immunoprivileged अंगों tetramer
संक्रमित Ifnar1 के Immunoprivileged अंगों में Zika वायरस-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन<sup>-चूहों/</sup>
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