Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Оценка ответов Зика вирус специфических Т-клеток в Immunoprivileged органах зараженных Ifnar1- / - мышей

Published: October 17, 2018 doi: 10.3791/58110
Automatic Translation
*1,2, *2, *3, 1,2, 4, 2, 5, 6, 3, 1,2,4,6, 1,2
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3State Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 4Research Network of Immunity and Health (RNIH), Beijing Institutes of Life Science, Chinese Academy of Sciences, 5Laboratory Animal Center, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 6CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Протокол для оценки реакции антиген специфические Т-клеток в immunoprivileged органах Ifnar1- / - мышиных модели для вируса Зика (ZIKV) описано. Этот метод имеет решающее значение для изучения клеточных механизмов защиты и иммунопатогенезе ZIKV вакцин и также является ценным для оценки их эффективности.

Abstract

Зика вирус (ZIKV) может вызвать воспаление в immunoprivileged органов (например, мозг и яичка), ведущих к синдром Гийена-Барре и повреждение яичек. Во время инфекции с ZIKV иммунные клетки было показано, чтобы проникнуть в ткани. Однако клеточных механизмов, определяющих защиту и/или иммунопатогенезе этих иммунных клеток при ZIKV инфекции по-прежнему в значительной степени неизвестными. Здесь мы описываем методы для оценки функции вирус специфических Т-клеток в этих органах immunoprivileged ZIKV-инфицированных мышей. Эти методы включают) ZIKV инфекции и прививки вакцины в Ifnar1- / - мышей; b) гистопатология, иммунофлюоресценции и иммуногистохимии анализов для выявления вирусной инфекции и воспаления в мозг, яички и селезенки; c подготовка Тетрамер ZIKV-производные Т-клеточных эпитопов; d обнаружение ZIKV-специфических Т-клеток в моноцитов, изолированный от мозг, яички и селезенки. С помощью этих подходов, это можно обнаружить антиген специфические Т-клеток, которые проникли в immunoprivileged органы и оценить функции этих клеток T во время инфекции: потенциал иммунной защиты через вирус Специальные акции и иммунопатогенезе или усугубить воспаление. Эти выводы могут также помочь прояснить вклад Т-клеток, вызванные иммунизации против ZIKV.

Introduction

ZIKV является flavivirus комарами, который был впервые выделен в 1947 году в Уганде от лихорадочного резус макака. Недавно ZIKV стал общественного здравоохранения чрезвычайной ситуации, из-за его быстрое распространение в Америке и его неожиданные связи с микроцефалия и Гийена-Барре синдром1,2,3. Эпидемиологических данных ZIKV было подозрение, чтобы быть причиной синдрома Гийена-Барре в около 1 на 4000 инфицированных взрослых4. Кроме того была продемонстрирована связь между ZIKV и яичках инфекции/повреждения в модель мыши, предполагая, что ZIKV инфекции, при определенных обстоятельствах, может обойти барьер крови яичка и в конечном итоге привести к мужского бесплодия5 . Эти выводы подчеркивают важность полностью понимания индукции защитных или патологические иммунные реакции при ZIKV инфекции.

Многое еще предстоит узнать о сотовых иммунной реакции на ZIKV. CD4+ и CD8+ Т-клеточных реакций к капсидному, конверт и неструктурных протеин 1 (NS1) были обнаружены в ZIKV-инфицированных обезьян и людей6,,7,8. В мышей, несколько исследований показали что CD8+ T клетки играют защитную роль в контроле ZIKV репликации9,10,11. Важно отметить, что Хурадо et al. показал, что ZIKV инфекции приводит к распаду blood - brain барьер и периваскулярной инфильтрации CD8+ клеток-эффекторов T в семенниках мышей- / - Ifnar1. Кроме того, они показали, что CD8+ T клетки провоцируют связанные ZIKV паралич и появляются играть определенную роль в неонатальной мозга иммунопатологии. В предыдущем исследовании, мы подготовили Тетрамер294-302 ZIKV-E и показал, что ZIKV-конкретных CD8+ T клетки существуют в мозги и шнуры спинного мозга мышей- / - ZIKV-инфицированных Ifnar1, которые могут иметь важные последствия для разработки и разработка вакцин ZIKV10.

В ответ на настоятельную необходимость вакцинации для предотвращения инфекции ZIKV несколько вакцин в доклинических стадиях развития, включая вакцины, рекомбинантных вакцин на основе векторной и очищенный протеин Субблок вакцин РНК. В фазе 1 клинические испытания12вакцины ДНК плазмиды. Оценка безопасности и эффективности вакцин ZIKV, таким образом, важное значение. Одним из преимуществ вакцин является их способность добиться конкретных ответов в Т-клеток, которые могут быть важны для защиты от ZIKV. С помощью связанных с epitope тетрамера ZIKV-производные Т-клеток, иммунореактивности Т-клеток, вызванные аденовируса векторной ZIKV вакцины могут быть обнаружены в иммунизированной мыши, и M и E гликопротеинов были показаны побудить надежные антиген специфические CD8+ Т-клеток иммунореактивности13.

Во время вирусной инфекции признание пептидные антигены, представленных сложных молекул гистосовместимости (MHC) Т-клеточных рецепторов (TCR) является важным механизмом для защиты принимающих14T-cell-mediated. На основе этой теории, технологии Тетрамер является уникальным инструментом для выяснения роли, которые антиген специфические клетки T играть в регулировании иммунной реакции15. Этот протокол описывает создание модели Ifnar1- / - мышь для ZIKV инфекций и обнаружение реактивных Т-клеток в селезенку, мозг и семенниках мышей с использованием технологии Тетрамер. Кроме того мы использовали Тетрамер294-302 ZIKV-E для выявления и оценки иммунореактивности Т-клеток, индуцированных ZIKV вакцина (AdC7-M/E) в иммунизированной мыши. Это исследование обеспечивает руководство для изучения ответов Т-клеток в immunoprivileged органах и предоставляет ссылку для потенциальных приложений в плаценты или мозг плода.

Protocol

Эксперименты на животных были утверждены институциональный уход животных и использование Комитета национального института для вирусного контроля и профилактики заболеваний, Китай CDC. Все эксперименты проводились после институциональный уход животных и использование Комитет одобрил животных протоколов.

1. вирусной инфекции

  1. Держать взрослого (6-8 недели старый) Ifnar1- / - (50% мужчин и 50% женщин) мышах в условиях стандартных специальных возбудителя бесплатно (SPF) и позволить им регулярного доступа к продовольствию и воде.
  2. Заразить Ifnar1- / - мышей с ZIKV через ретро орбиталь прививка 100 мкл ZIKV в фосфат амортизированное saline (PBS) буфер, содержащий 1 х 104 фокус формирование единиц (FFUs) вируса. Аналогичным образом обеспечивают контроль мышей с равным объемом PBS.
    Предупреждение: Заразить мышей в условиях ABSL2 и выполнять эти процедуры с вирусом мышей в кабинете биобезопасности.
  3. Контролировать вес и клинические признаки (толчки, шатаясь марта, двусторонние вялого задних конечностей) мышах ежедневно на 15 дней.

2. иммунизации вакциной ZIKV

  1. Использование Ifnar1- / - (50% мужчин и 50% женщин) мышах между 6 и 8 недель возраста. Держите мышей в стандартных условиях SPF 18 – 29 ° C и 12 h свет/темно цикла с доступом к продовольствию и воде.
  2. Иммунизировать мышей- / - Ifnar1 с ZIKV вакцины: придать 100 мкл AdC7-M/E [4 x 1010 (частицы вируса)] в PBS буфера через внутримышечной инъекции (и.м. маршрут) с помощью 1 мл шприца с иглой 23 G.
  3. Аналогичным образом придать управления мышей с равным объемом PBS.

3. изоляция моноциты из селезенки

Примечание: Изоляции моноциты из селезенки описан как упоминалось ранее,16.

  1. Анестезировать прививки и ZIKV-инфицированных мышей 7 d после прививки, используя 5% изофлюрановая concentrationin 100% кислорода (при скорости потока 1 Л/мин). Усыпить мышей от шейки матки дислокации. Затем сразу окуните всю поверхность мыши в 75% этанола.
    Предупреждение: от этого шага все экспериментальные процедуры должны выполняться консерванта в биобезопасности кабинета.
  2. С помощью иглы, исправьте конечностей (Усыпленных, ранее инфицированных/прививки) мышей на пены пластины с живота вверх.
  3. Вырезать кожу вдоль средней линии живота на грудную клетку с стерильным скальпель, сократить мышцы живота с ножницами, разоблачить брюшной полости и аккуратно удалить печень.
    Примечание: Длиной, темно красный орган слева от желудка является селезенки.
  4. Удаление селезенки, промойте его 3 x в PBS для удаления любой крови и поместите его в 1,5 мл ледяной Розуэлл парк Мемориальный институт среды (RPMI). Держите селезенки на льду.
  5. Для создания одной ячейки подвеска из селезенки, место органа(ов) на стерильную 40 мкм-клеток сетчатый фильтр на вершине 50 мл трубки и добавить 2 мл ледяной RPMI средних содержащий 10% плода бычьим сывороточным (ФБС). С помощью плунжера шприц 5 мл, механически размять органа(ов) и добавить среднего до тех пор, пока орган был полностью землю через сетку.
  6. Передать 15 мл суспензии клеток и центрифуги на 600 x g 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант.
  7. Ресуспензируйте клетки с 5 мл буфера lysis эритроцитов (РБК) (NH4Cl, Na2ЭДТА и KHCO3; см. Таблицу материалы) и инкубировать реакция лизиса при комнатной температуре для 5 – 6 мин.
  8. Остановить РБК lysis с 10 мл ледяной RPMI/FBS среды и центрифуги трубки на 600 x g 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант.
  9. Ресуспензируйте клетки с 10 мл полного среднего RPMI (RPMI с 10% vol/vol FBS и 100 ед/мл пенициллин стрептомицином). Перевести небольшой трубки 10 мкл суспензии клеток, смешать его с 10 мкл 0,4% wt/vol Трипановый синий и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева.

4. изоляция моноциты из мозга и яичек

  1. Анестезировать ZIKV-инфицированных мышей-самцов 7 d после прививки, используя 5% isofluranein 100% кислорода (при скорости потока 1 Л/мин). Усыпить мышей от шейки матки дислокации. Затем сразу окуните всю поверхность мыши в 75% этанола.
    Предупреждение: От этого шага все экспериментальные процедуры должны выполняться консерванта в биобезопасности кабинета. Изоляции моноциты из мозга и яичках описан как упоминалось ранее,17.
  2. Иммобилизации (Усыпленных, ранее инфицированных) мужчины мыши в лежачем положении на разделочную доску.
  3. Защиты головы с прямой 1 x 2 зубов щипцами и использовать Iris ножницы сделать разрез средней линии на голове подвергать черепа.
  4. Зажать обе стороны орбит с острыми пинцетом и исправить мозга. Поместите один подсказки ножницами Ирис в затылочного и боков нарезать черепа. Повторите этот шаг для другой стороны.
  5. Используйте острые ножницы Iris тщательно вырезать из полости же, вверх по средней линии, к носу. Попробуйте держать конец ножницы как поверхностные избежать, ранив мозга.
  6. Поднимите мозга с щипцами и использовать Iris ножницами тщательно анализировать черепных нервных волокон. Удаление мозга с щипцами и поместите его в тубы 15 мл 5 мл ледяной RPMI/10% FBS среды.
  7. Grab брюшной кожи пинцетом и использовать Iris ножницами сделать продольный разрез через кожный покров и брюшной стенки и разоблачить в нижней части живота. Нажмите яички до разрез. Осторожно потяните жирового слоя с помощью пинцета и разоблачить шаровидных яичка с обеих сторон.
  8. Использование резкого Ирис ножницы тщательно анализировать жирового слоя и придатка. Разместите яички в тубы 15 мл 5 мл ледяной RPMI/10% FBS среды с щипцами.
  9. Для создания одной ячейки подвеска из мозга или яички, место орган на стерильную ячейки сито с сеткой 100 мкм на вершине 50 мл трубки и добавить 2 мл ледяной RPMI/10% FBS среды. С помощью плунжера шприц 5 мл, размять орган и добавить среднего до тех пор, пока орган был полностью землю через сетку.
  10. Передать 15 мл суспензии клеток и центрифуги на 600 x g 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант.
  11. Ресуспензируйте клетки с 5 мл 30% плотности градиента средних и, затем, добавить их очень медленно в 2 мл 70% плотности градиента среды в 15 мл.
  12. Выключить тормоз и центрифуги трубы на 4 ° C на 800 x g для 30 минут получить лимфоцитов из среднего слоя.
  13. Передать свежие 15 мл интерфаза, добавляют 10 мл холодной RPMI/10% FBS среднего и центрифуги трубки на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Удалите супернатант.
  14. Ресуспензируйте клетки с 10 мл ледяной RPMI/FBS среды и центрифуги их на 600 x g 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант.
  15. Ресуспензируйте клетки с 10 мл полного RPMI среды и подсчитать количество ячеек как шаг 3.9.

5. Тетрамер подготовка

  1. Постройте плазмид, выражая внеклеточных доменовb H-2D с тегом биотинилированным сайта на C-конечная α3 домена и β2м с помощью вектора pET28a с NdeI и XohI ограничения сайта18.
  2. Экспресс и подготовить включение тела H-2Db и β2м как описано выше20.
  3. RENATURE и очистить MHC/пептидный комплекс H-2Db-E294-302.
    1. Подготовка 200 мл refolding раствора [100 мм трис-HCl (рН 8,0), 400 мм L-аргинин, 2 ЭДТА-Na, 5 мм GSG и 0,5 мм GSSG]. Добавление ингибиторов протеазы: 2 мл phenylmethylsulphonyl фтора (PMSF, акций 100 мм), 100 мкл pepstatin (штока 2 мг/мл), и 100 мкл leupeptin (штока 2 мг/мл). Прохладный буфера на 4 ° C на 30 мин.
    2. ДобавьтеbH-2D, β2m и пептида refolding решение.
      1. Придать 500 мкл β2м растворяют в растворе гуанидина (30 мг/мл бульона), с помощью шприца. Для этого использовать шприц 5 мл с иглой 23 G и вставляют β2m refolding решения по капле. Держите решение, медленно и постоянно помешивая на 150 об/мин при 4 ° C.
      2. После того, как β2m была распущена в refolding растворе, решить 2 мг E294-302 пептида в 200 мкл ДМСО и быстро внедрить его в refolding раствор с помощью пипетки. Медленно перемешайте раствор на 150 об/мин при 4 ° C на 15 мин.
      3. Придать 1,5 мл H-2Dб растворяют в растворе гуанидина. Держите движение вращающийся бар на 150 об/мин для складывая H-2Db на 4 ° C для 8-10 ч.
        Примечание: Решение был помещен в закрытом поле в холодной комнате.
    3. Концентрат сложил белка в камере под давлением с мембраной 10 кДа. Обмен буфера [20 мм трис-HCl (pH8.0), 50 мм NaCl] в палату и сосредоточить его в окончательный объем 30-50 мл.
    4. Передача refolding решение для пластиковых пробирок и спина его на 2500 x g 15 мин при 4 ° C.
    5. Тщательно супернатант передать 10 кДа центробежного фильтра и далее сосредоточить его в окончательный объем 500 мкл на 2500 x г за 30 мин.
    6. Супернатант передать свежие трубки и спина его на g 12000 x 15 мин очистить протеин с S200 10/300 GL гель filtration хроматографии.
    7. Собирать MHC комплекса пик и сосредоточить его в окончательный объем 350 мкл.
  4. Для создания тома 500 мкл реакции для biotinylation, добавьте regents в следующем порядке: 100 мкл раствора A [0.5M bicine (рН 8.3)], 100 мкл раствора B (100 мм АТФ, 100 мм MgOAc, 200 µΜ биотин), 100 мкл дополнительных d-биотина (500 µΜ биотин) , 20 мкл Бира фермента (60 мкг), 0.5 мкл pepstatin (2 мг/мл) и 0,5 мкл leupeptin (2 мг/мл). Инкубировать трубки реакции на ночь при 4 ° C.
    Предупреждение: Не добавляйте любые ЭДТА в реакции biotinylating.
  5. Очищают с помощью S200 MHC 10/300 GL гель фильтрации столбца для удаления любых дополнительных биотин.
  6. Определите эффективность biotinylating с Пробирной стрептавидина сдвиг18.
    1. Подготовка трех образцов, A, B и C, на льду за 30 мин. Затем, проанализировать результаты на 10% SDS-PAGE. Образец состоит из 8 мкл биотинилированным MHC молекул и 2 мкл буфера обмена, образца B 8 мкл биотинилированным MHC молекул и 2 мкл стрептавидина (20 мг/мл) и образца C 2 мкл стрептавидина (20 мг/мл) и 8 мкл буфера обмена.
      Предупреждение: Не кипятите образца.
  7. Форма мультимеры биотинилированным MHC молекул.
    1. Производят Тетрамер путем смешивания биотинилированным E294-302 пептид H2Db комплекс с надписью фикоэритрин стрептавидина в соотношении 1:5 обеспечить полную привязку всех молекул MHC биотинилированным моль.
    2. Рассчитайте количество стрептавидина конъюгата, необходимые для tetramerization.
      1. Определить родинки MHC/пептидных комплексов, приходится концентрацию белка и молярная масса (пример: 1.8 мг общего белка = 40 нмоль).
      2. Рассчитать родинки стрептавидина конъюгата, необходимо путем деления родинки пептид MHC 5 (пример: 40/5 = 8 нмоль стрептавидина конъюгат).
      3. Рассчитать количество стрептавидина необходимы (мкг) в зависимости от стрептавидина конъюгата (пример: стрептавидина PE [300 000 г/М] → 8 нмоль необходимы = 2400 g).
    3. Разделите стрептавидина фикоэритрин 10 образцов. Добавьте каждый образец трубка, содержащая биотинилированным E294-302 пептид H2Db комплекса, с интервалом в 20 мин. После загрузки последний пример, Инкубируйте трубки реакции на 4 ° C на ночь в темноте.
  8. Применить multimerized реагенты в трубку спин 100 кДа и сосредоточить его центрифугированием в 2000 x g при 4 ° C к объему < 100 мкл.
  9. Разбавить образец в спин трубы до 4 мл, используя PBS (рН 8.0) и сосредоточить его снова < 100 мкл.
  10. Повторите шаг буфера обмена в PBS (рН 8,0) 4 x.
  11. Заполните общий объем снова до 500 мкл, используя PBS (рН 8,0). Концентрат образец оценкам концентрации 2-2,5 мг/мл в 2 000 x g при 4 ° C. Магазин образец в темноте при 4 ° C.

6. проточной цитометрии

  1. Инкубируйте клеточных суспензий (с шагом 3,9 и/или шаг 4.15) при 4 ° C с 0.1 мкл против мышиных CD16/CD32 Fc-рецептор блокировки реагента на 20 мкл (коэффициент разбавления 1: 200) на 10 минут, чтобы предотвратить любой неспецифических привязки.
  2. Центрифуга Тетрамер трубки на 20000 x g для по крайней мере 15 мин при 4 ° C.
  3. Каждый хорошо добавьте 20 мкл суспензии клеток в 96-луночных platecontaining 1 x 106 клеток.
  4. Готовить достаточное количество смеси Тетрамер294-302 E пятно все экспериментальные трубы. Подготовьте свыше 15% от общего объема этой смеси на счет для дозирования ошибок. Разбавить294-302 тетрамера E (2 мг/мл, 1 мкл/испытание) в буфере СУИМ (PBS, 0,5% FBS) так что 20 мкл E294-302 Тетрамер смесь добавляется к каждому тесту.
  5. 20 мкл E294-302 Тетрамер смеси, 96-луночных пластины. К концу этого шага окончательный объем в каждой скважине должна быть 40 µL.Incubate пластину в темноте при комнатной температуре за 30 мин.
  6. Добавьте первичного антитела (FITC-конъюгированных или APC-конъюгированных анти CD3 (0,2 мг/мл), PerCP конъюгированных анти CD8 (0,2 мг/мл)) в 1 мкл/тест суспензию клеток и, затем, Инкубируйте на 4 ° C на 30 мин в темноте.
  7. Вымыть клетки 2 x с 2 мл буфера СУИМ и центрифуги их в 600 x g 5 мин тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 200 мкл буфера СУИМ.
  8. Храните образцы временно на 4 ° C в темноте до гранулярных анализ потока.
  9. Используйте следующие стробирования стратегию для анализа гранулярных потока.
    1. Создайте ворот на диагонали кластерных фуфайки путем построения вперед точечной (FSC) по сравнению с боковой области точечной (SSC).
    2. Затем, ворота на CD3+ клеток на стороне точечной (SSC) против CD3; Далее, ворота на CD3+ CD8+ клетки; Наконец, наброски CD8+ + Тетрамер клетки19.

7. гистопатология, иммунофлюоресценции и Immunohistochemistry Assay

  1. Гистопатология пробирного
    1. Собирать тканей мозга и яичка ZIKV-инфицированных Ifnar1- / - мышей 7 d после прививки и исправить их в 4% нейтральные амортизированное формальдегида.
      Предупреждение: параформальдегида токсичен; носите соответствующие средства индивидуальной защиты.
    2. Внедрите ткани в парафин.
    3. Раздел ткани на 5 мм, с помощью vibratome.
    4. Окрашивать ткани с гематоксилином и эозином (H & E).
  2. Иммуногистохимия пробирного
    1. Deparaffinize, увлажняет и антиген получить ткани секций, основанная на процедурах описано ранее21.
    2. Лечить разделов ткани с 3% H2O2 в PBS (рН 7,6) за 10 мин и блокировать их с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) за 10 мин.
    3. Инкубировать разделов ткани с крыса анти мыши антитела CD3 (разбавление: 1/1000) за 8 ч при комнатной температуре и, затем, инкубировать их в 4 ° C на ночь.
    4. Полоскания тканей с PBS и, затем, инкубировать их с 3 капли биотинилированным вторичное антитело (разрежения: 1/1000) за 2 ч при комнатной температуре, после чего 3 капли авидин биотин пероксидаза (разбавления: 1/200) при комнатной температуре за 30 мин.
    5. Привязка, с 3 капли 30, 30-Диаминобензидин tetrahydrochloride (разбавления: 1/1000), как описано ранее22.
    6. Counterstain разделов ткани с Мейера гематоксилином.
  3. Помощью иммунофлуоресцентного анализа
    1. Просушите секции замороженные яичка (6 мм) для 10 мин при комнатной температуре.
    2. Исправьте их с ледяной ацетона 10 мин.
    3. Вымойте секции с PBS для 3 x и блокировать их с блокирующий буфер (1% BSA, 0,3% Тритон, ПБС) при 37 ° C за 30 мин.
    4. Инкубировать разделов ткани с основного антитела (Z6) (20 мкг/мл) при 4 ° C на ночь.
    5. Полоскания тканей с PBS и применять вторичные антитела (коэффициент разбавления: 1/200) за 1 ч при 37 ° C.
    6. Вымойте разделов ткани с PBS и counterstain их для ядер с помощью 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (коэффициент разбавления: 1/1000), следуя инструкциям производителя.

Representative Results

После этих методов мы разработали модель мышиных ZIKV инфекций. 1 х 104 фокус формирование единиц (ФФУ) из ZIKV Ifnar1- / - мышей в возрасте 6 – 8 недель были заражены retroorbital инъекции. После инфекции с ZIKV в Ifnar1- / - мышей наблюдались патологические симптомы и признаки (рис. 1А), а также изменения веса (рис. 1Б). Мышиных мозги показал очевидное отек и гиперемию (рис. 1C). Тем временем, яички сжал постепенно (рис. 1D). Кроме того патологические изменения и разрушение ткани были найдены в головном мозге и яички (рисA). Мы исполняли assay иммунофлюоресценции для обнаружения ZIKV в мозг и яички (рис. 2B). Высоких вирусных нагрузок были обнаружены в головном мозге и яичка иммуноокрашивания (рис. 2B). Иммуногистохимия показал надежную инфильтрации CD3+ T клеток в головном мозге мышей после инфекции с ZIKV (рис. 2C).

Чтобы обнаружить и оценить ответы ZIKV-специфических Т-клеток, мы подготовили мыши MHC-I H-2Db-E Тетрамер294-302 . Пептид E294-302 может помочь renatureb H-2D должным образом и дают большое количество растворимого MHC-I (рисA). В assay сдвига высокая эффективность в biotinylation можно наблюдать (рис. 3B). Впоследствии три стрептавидина флуоресцирования (APC, PE и BV421) - меткой реализует - я тетрамера были произведены для обнаружения ZIKV-специфических Т-клеток (рис. 3C). PE-помечены Тетрамер был выше эффективность для выявления конкретных CD8+ Т-клеток, по сравнению с надписью APC и BV421 тетрамера, хотя разница не была статистически значимой.

Используя E Тетрамер294-302 , мы обнаружили ZIKV-специфических Т-лимфоцитов в селезенке зараженных мышей подачей cytometry в 7 d после прививки ZIKV (3.49 ± 0,45%). Кроме того аналогично описанному в разделе 3 настоящего Протокола, с 4 недель после вакцинации вакцины AdC7-M/E, ZIKV-специфических Т-лимфоцитов были обнаружены в селезенке (6.89 ± 1,36%) (Рис. 4).

Кроме того мы обнаружили лимфоцитов, проникли в immunoprivileged органах, таких как мозг и яичек, после ZIKV инфекции. Ворота были установлены для выбора CD3+CD8+ T-клеток в общей лимфоцитов мозга и яичках. Высокий коэффициент E294-302 Тетрамер специфичные Т-клетки могут быть обнаружены в головном мозге (42,2% в CD3+CD8+ T клетки) и яичка (26,4% в CD3+CD8+ T клетки) лимфоцитов (рис. 5).

Figure 1
Рисунок 1 : Характеристика ZIKV инфекции в Ifnar1- / - мышей. Ifnar1- / - мышей в возрасте 6 – 8 недель были заражены с 104 фокус формирование единиц (ФФУ) из ZIKV retroorbital инъекции, и мышей, вводится с PBS использовались как неинфицированных элементов управления. Морфология (A) и (B) Вес изменения зараженных Ifnar1- / - мышей наблюдали. Красные стрелки показывают Ifnar1 мышей- / - , представленные с myeloparalysis и мотор парезами после инфекции. (C) мозги на 7 d после прививки и яички (D) на 0, 7, 14 и 30 дней после прививки были собраны. Представитель изображения мозга и яички от мышей отображаются с линейкой для обозначения размеров. Планки погрешностей представляют среднее ± SEM. n = 10 мышей на группу за эксперимент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Обнаружение ZIKV и лимфоцитов в головном мозге и яички мышей- / - ZIKV-инфицированных Ifnar1. (A) Эта группа показывает гистопатологические изменения в мозге и яички от ZIKV-инфицированных мышей, по сравнению с негативный контроль на 7 d после прививки. Шкалы бар = 25 мкм (левая панель) и 50 мкм (правая панель). (B) иммунофлюоресценции пробирного была выполнена с анти ZIKV Z6 антитела (зеленый). С ZIKV-инфицированных мышей на 7 d после прививки были собраны все образцы тканей. Ядра, окрашивали DAPI (синий). Шкалы бар = 50 µm. (C) иммуногистохимия показывает надежные инфильтрации CD3+ T-клеток в мозг и яички. Шкалы бар = 25 мкм (левая панель) и 50 мкм (правая панель). Фиолетовый указывает гематоксилином, Браун представляет собой Антитело CD3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Подготовка реализует специфичные для ZIKV-я тетрамера. (A) привязки E294-302 до H-2Db выяснены путем в vitro складывая. Голубой означает H-2Db-E294-302 белка. Оранжевый представляет отрицательный контроль без пептид. (B) Эта группа показывает пробирного сдвиг H-2Db-E294-302 . (C) макет представляет элемент управления, PBS. Три стрептавидина флуоресцирования (APC, PE и BV421) - меткой реализует - я тетрамера были использованы для обнаружения ZIKV-специфических Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Гранулярных анализ вирус специфических CD8 потока + Т-клеток селезенки мышей, инфицированных ZIKV и прививки вакцины в. Ifnar1- / - мышей в возрасте 6-8 недель либо были заражены 104 фокус формирование единиц (ФФУ) из ZIKV или получил разовая доза-4 x 1010 вирусных частиц AdC7-M/E или PBS как отрицательный контроль. Через 7 дней после инфицирования или 4 недель после вакцинации splenocytes мыши были собраны и проанализированы подачей cytometry. Данные отображаются как среднее ± SD. Статистический анализ проводился с помощью односторонней ANOVA (не значительные: P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0.01; ***P < 0,001; ***P < 0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 5
Рисунок 5 : Стробирования стратегии и представитель результаты CD8 вирус специфических+ T клеток в головном мозге и семенниках мышей, инфицированных ZIKV. Представитель участки отображаются для проникли лимфоцитов в (A), мозг и (B) яички. Правопреемства ворот имеет значение для выбора лимфоидных точечная+ и CD3+ события. Из них, CD8+ события являются воротами для анализа epitope специфичных Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Discussion

Иммуногенность epitope Т-клеток играет значительную роль в клеточный иммунитет против патогенов23. Таким образом обнаружение ZIKV-специфических Т-клеток в immunoprivileged органах является методология критической понять Т-клеточные ответы против естественной ZIKV инфекции. Тем временем Т-клеточного ответа обнаружения является отличным инструментом для изучения эффективности вирусных вакцин. Здесь, мы покажем всеобъемлющий протокол визуализировать эксперименты, которые включают изоляцию лимфоцитов из селезенки, мозг и яичек ZIKV-инфицированных мышей, подготовка Тетрамер294-302 epitope E immunodominant и признание ZIKV-конкретных CD8 клетки+ T в immunoprivileged органах ZIKV-инфицированных мышей.

Предыдущие исследования показали, что живой ZIKV или его РНК могут быть обнаружены в сперме пациентов мужского пола, который указывает, что ZIKV может обойти барьер крови яички и повторить себя в репродуктивной системе24. Ранее мы также показали, что ZIKV может вызвать повреждение яичек и привести к мужского бесплодия в25мышей. ZIKV инфекция может привести к виремии в макаках, и вирусной РНК могут быть обнаружены в центральной нервной системе (ЦНС), а также в висцеральных органов. Иммуногистохимия показали, что ZIKV-специфические антигены были представлены в ЦНС и несколько периферийных органов26. Кроме того, в мышиных моделях, ZIKV инфекция может вызвать надежные противовирусное CD8+ Т-клеточный ответ в селезенке и СНК26.

По сравнению с предыдущей работы, это исследование устанавливает систематические методы для обнаружения ZIKV-конкретных CD8+ Т-клеточных реакций в мозге и яичек, которые immunoprivileged сайтов. Важно оценить функциональность вирус специфических Т-клеток в immunoprivileged органах ZIKV-инфицированных мышей. Использование тетрамера для обнаружения ZIKV-конкретных CD8+ Т-клеток ответов в immunoprivileged органах значительно укрепит наше понимание ZIKV инфекций и их принимающих иммунных реакций. Используя E Тетрамер294-302 , вирус специфических Т-клеток в головном мозге и яички могут быть изолированы проточной цитометрии, расследовать клеточных механизмов защиты и иммунопатогенезе во время ZIKV инфекции. Между тем, это полезно для исследователей на изучение функций CD8 клетки+ T для управления ZIKV, или для повышения иммунопатогенезе в этих органах во время ZIKV инфекции.

Для анализа мышиных CD8 антиген специфические+ Т-клеток ответы в immunoprivileged органах, мы подготовили H-2Db-E294-302 Тетрамер и обнаружен CD8 клетки+ T подачей cytometry. Тетрамера являются мощным инструментом для выявления антигена специфичные Т-клетки. Здесь были созданы три типа флюрохром конъюгированных стрептавидина (APC, PE и BV421). Хотя Есть никаких статистически значимых отличий в APC-, BV421-и PE-меченых тетрамера для обнаружения антиген специфические Т-клеток, PE-меченых реализует-я тетрамера принесли наилучшие результаты. Следовательно PE-помечены Тетрамер был использован на протяжении всего этого исследования. Интересно, что основываясь на PE-меченых H-2Db-E Тетрамер294-302 , мы обнаружили высокое соотношение антиген специфические Т-клеток в головном мозге и яичек, которые показывают способность миграции вирус специфических Т-клеток из крови immunoprivileged органов.

Однако существуют некоторые ограничения к протоколу. H-2Db-E294-302 Тетрамер не является полезным для обнаружения человека Т-клеток, потому что Тетрамер обнаружения зависит от ограничений MHC. Показ immunodominant HLA-ограничено пептиды по-прежнему необходима. Кроме того ретро орбитальной инфекции эффективна для ZIKV инфекции, но может быть не удобно операции для некоторых следователей. Таким образом другие маршруты инфекции, включая брюшной полости, подкожно или внутривенно, также рекомендуется.

В протоколе, описанные здесь важнейшим шагом является изоляция моноциты из мозга и яички. Важно приобрести высококачественные лимфоцитов; Таким образом важно обратить внимание, например, центробежный скорость, прочность шлифовальных ткани и рассечение тканей мозга и яички. Кроме того для подготовки Тетрамер, Ингибиторы протеаз (PMSF, pepstatin, leupeptin) полезны при защите белок от ухудшается. Поэтому имеет смысл добавить ингибитор протеазы в refolding буфер и обмениваться буфера во время процесса подготовки Тетрамер.

В заключение мы представляем методы обнаруживать антиген специфические Т-клеток ответов в органах immunoprivileged модели Ifnar1- / - мышь для ZIKV инфекции. Эта платформа может широко применяется для расследования иммунные механизмы новых и вновь возникающих вирусов, которые могут обойти барьеры между кровью и immunoprivileged органов. Кроме того это исследование может проложить путь для будущего развития вакцин и immunotherapies.

Disclosures

Авторы не имеют ничего объявить.

Acknowledgments

Авторы благодарят Гарри Вонг за английская редакция. Эта работа была поддержана национальной ключ научных исследований и развития программа Китая (Грант 2017YFC1200202), майор специальных проектов для инфекционных заболевания исследования из Китая (Грант 2016ZX10004222-003). F. Джордж Гао является ведущих главным следователем национальной естественных наук фонд из Китая инновационных исследований группы (Грант 81621091).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Z6 our lab Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3 Santa Cruz sc-1127; RRID: AB_631128
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) ZSGB-BIO ZF-0308
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated CWBIO CW0115
FITC anti-mouse CD3 Biolegend 17A2
APC anti-mouse CD3 Biolegend 100236
PerCP anti-mouse CD8a Biolegend 100732
Percoll GE Healthcare P8370
PMSF Ameresco 0754-5G Toxic and corrosive reagent.
Handle with care
Streptadivin BD S4762-FZ Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and  stored at -20 °C
Pepstatin Sigma P4265-5MG 5 mg in 2.5 mL DMSO, aliquots stored at -20 ºC
Leupeptin Sigma L8511 5 mg in 2.5 mL dH2O, aliquots stored at - 20 ºC
Peptides Scilight-peptide Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C
RPMI 1640 Hyclone SH30809.01 Must be stored at 4 °C
DMSO MP 219605590 Store at room temperature.
APC-Streptadivin BD 554067 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
FITC-Streptadivin BD 554060 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
PE-Streptadivin BD 554061 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
BV421-Streptadivin BD 563259 Must be stored and maintained at
4 °C. Do not freeze.
PageRuler Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific  26614 Must be stored at 4 °C
Cell Strainers BF BF10-5040 Store at room temperature.
Amicon Ultra 100 kDa Millipore UFC510024 Store at room temperature.
Ultracentrifuge Thermo Fisher Scientific 
FACS Cantol Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Superdex 200 Increase 10/300 GL  GE healthcare 28990944
AKTA PURE GE healthcare
red blood cell lysis buffer Solarbio R1010 Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Hazin, A. N., et al. Computed Tomographic Findings in Microcephaly Associated with Zika Virus. The New England Journal of Medicine. 374 (22), 2193-2195 (2016).
  3. Zhang, Y., et al. Highly diversified Zika viruses imported to China, 2016. Protein & Cell. 7 (6), 461-464 (2016).
  4. Cauchemez, S., et al. Association between Zika virus and microcephaly in French Polynesia, 2013-15: a retrospective study. The Lancet. 387 (10033), 2125-2132 (2016).
  5. Turtle, L., et al. Human T cell responses to Japanese encephalitis virus in health and disease. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1331-1352 (2016).
  6. Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nature Communications. 7, 12204 (2016).
  7. Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nature Medicine. 22 (12), 1448-1455 (2016).
  8. Stettler, K., et al. cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
  9. Zhao, M., Zhang, H., Liu, K., Gao, G. F., Liu, W. J. Human T-cell immunity against the emerging and re-emerging viruses. Science China Life Sciences. 60 (12), 1307-1316 (2017).
  10. Huang, H., et al. CD8+ T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), 00900-00917 (2017).
  11. Elong Ngono, A., et al. Mapping and Role of the CD8+ T Cell Response During Primary Zika Virus Infection in Mice. Cell Host & Microbe. 21 (1), 35-46 (2017).
  12. Marques, E. T. A., Burke, D. S. Tradition and innovation in development of a Zika vaccine. The Lancet. 391 (10120), 516-517 (2017).
  13. Xu, K., et al. Recombinant Chimpanzee Adenovirus Vaccine AdC7-M/E Protects against Zika Virus Infection and Testis Damage. Journal of Virology. , 01722-01817 (2018).
  14. Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of human alloantigen-specific T cells from peripheral blood. Journal of Visualized Experiments. (93), e52257 (2014).
  15. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. Journal of Visualized Experiments. (68), e4420 (2012).
  16. Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen. Journal of Visualized Experiments. (105), e53256 (2015).
  17. Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. Journal of Visualized Experiments. (108), e53658 (2016).
  18. Altman, J. ohnD., et al. Phenotypic Analysis of Antigen-Specific T Lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  19. Li, H., Zhou, M., Han, J., Zhu, X., Dong, T., Gao, G. F., Tien, P. Generation of murine CTL by a hepatitis B virus-specific peptide and evaluation of the adjuvant effect of heat shock protein glycoprotein 96 and its terminal fragments. J Immunol. 174 (1), 195-204 (2005).
  20. Valkenburg, S. A., et al. Preemptive priming readily overcomes structure-based mechanisms of virus escape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5570-5575 (2013).
  21. Shang, T., et al. Toll-like receptor-initiated testicular innate immune responses in mouse Leydig cells. Endocrinology. 152 (7), 2827-2836 (2011).
  22. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), e52293 (2015).
  23. Zhou, M., et al. Screening and identification of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus-specific CTL epitopes. The Journal of Immunology. 177 (4), 2138-2145 (2006).
  24. Barzon, L., Lavezzo, E., Palu, G. Zika virus infection in semen: effect on human reproduction. The Lancet Infectious Diseases. 17 (11), 1107-1109 (2017).
  25. Ma, W., et al. Zika Virus Causes Testis Damage and Leads to Male Infertility in Mice. Cell. 167 (6), 1511-1524 (2016).
  26. Li, X. F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 140 Зика вирус антиген специфические Т-клеток вакцинации immunoprivileged органов Тетрамер
Оценка ответов Зика вирус специфических Т-клеток в Immunoprivileged органах зараженных Ifnar1<sup>- / -</sup> мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Zhang, H., Ma, W., Liu,… More

Zhang, Y., Zhang, H., Ma, W., Liu, K., Zhao, M., Zhao, Y., Lu, X., Zhang, F., Li, X., Gao, G. F., Liu, W. J. Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice. J. Vis. Exp. (140), e58110, doi:10.3791/58110 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter