Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لتحديد في فيفو السذاجة CD4 T الخلية (خلية T) تنشيط وانتشار، والتمايز Th1 الناجمة عن نخاع العظام GM-CSF (بي أم)-اشتقاق الخلايا الجذعية (DCs). وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول العزلة BM وخلايا T، وجيل العاصمة ونقل العاصمة وخلايا T التبني.
Abstract
التحديد الكمي لتنشيط خلية CD4 T ساذجة والانتشار والتمايز إلى مساعد تي 1 (Th1) الخلايا طريقة مفيدة لتقييم الدور الذي تلعبه الخلايا T في استجابة مناعية. ويصف هذا البروتوكول في المختبر التفريق بين فروعه نخاع العظم (بي أم) للحصول على المحببات بلعم التي حفز مستعمرة الخلايا الجذعية المشتقة عامل (GM-CSF) (DCs). كما يصف البروتوكول نقل التبني ovalbumin الببتيد (أوفاب)-تحميل DCs مشتقة من GM-CSF وخلايا CD4 T ساذجة من الفئران المعدلة وراثيا أوتيي من أجل تحليل التنشيط في فيفو ، والانتشار، والتمايز Th1 من نقل خلايا CD4 تي. هذا البروتوكول تلتف الحد من محض في فيفو أساليب فرضها عدم القدرة على التحديد التلاعب أو حدد الخلية درس السكان. وعلاوة على ذلك، يتيح هذا البروتوكول دراسات في فيفو بيئة، وبالتالي تجنب التعديلات الفنية من العوامل التي قد تحدث في المختبر وذلك إلى تأثير أنواع الخلايا وعوامل أخرى لا توجد إلا في أجهزة سليمة. البروتوكول أداة مفيدة لتوليد التغييرات في وحدات تحكم المجال Dc وخلايا تي أن تعديل الاستجابات المناعية التكيفية، يحتمل أن تقدم نتائج هامة لفهم منشأ أو تطوير محصنة ضد العديد من الأمراض المرتبطة بها.
Introduction
خلايا CD4 T ومستضد تقديم الخلايا (Apc) مثل وحدات تحكم المجال Dc بالوسطاء مطلوب من الحصانة لمسببات الأمراض الميكروبية1،2. في الأجهزة الطرفية اللمفاوية، يتم تنشيط خلايا CD4 T عند الاعتراف بمولدات المضادات المحددة المقدمة من ناقلات الجنود المدرعة3،،من45. تنشيط خلايا CD4 تي تتكاثر وتفرق في خلايا Th المستجيب محددة مميزة ضرورية لتطوير الاستجابة المناعية التكيفية الصحيح6،7. السيطرة على هذه العمليات أمر بالغ الأهمية لإنتاج دفاع كافية تكيفية التي تقتل مسببات المرض دون إنتاج الأنسجة الضارة الضرر8. خلايا Th تتحدد وفقا لتعبير أو إنتاج الجزيئات السطحية، وعوامل النسخ والمستجيب السيتوكينات، وأداء مهام أساسية ومحددة استجابة للعوامل الممرضة1. خلايا فرعية خلية Th1 التعبير عامل النسخ تي-الرهان و γ انترفيرون سيتوكين (IFNγ)، والمشاركة في المضيف في الدفاع ضد الجراثيم داخل الخلايا1. التحديد الكمي لتنشيط خلية CD4 T ساذجة وانتشارها، والتمايز Th1 وسيلة مفيدة لتقييم الخلايا T الدور الذي تضطلع به في استجابة مناعية.
هذا التحليل فيفو في تمكين البروتوكول من القدرة في المختبر-ولدت المستمدة من BM DCs تعدل التنشيط، وانتشار، والتمايز Th1 خلايا CD4 T ساذجة. البروتوكول يعمل أيضا لتقييم قدرة خلايا CD4 T السذاجة المنشط، والتي يسببها آخذة في الانتشار، و Th1 متباينة (الشكل 1). هذا البروتوكول تنوعاً تلتف التمكن على وجه التحديد التلاعب أو حدد الخلية درس السكان في صرفة في فيفو البروتوكولات. يمكن دراسة آثار الجزيئات المتنوعة والعلاجات على وحدات تحكم المجال Dc باستخدام BM من الفئران المعدلة وراثيا5 أو علاج أو التلاعب وراثيا الخلايا BM معزولة9. وبالمثل، يمكن استكشاف ردود الخلية T بالحصول على خلايا T لنقل التبني من مصادر مختلفة أو بعد عدة التلاعب3،،من810.
المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول ذات شقين. ويتم تحليل تنشيط خلية تي وانتشارها، والتمايز Th1 بنهج تدفق الخلوي؛ وهذا هو جنبا إلى جنب مع فيفو الدراسات، مما يمنع حدوث التغيرات التي قد تحدث في المختبر ، بما في ذلك أنواع الخلايا وعوامل أخرى لا توجد إلا في أجهزة سليمة11.
استخدام الأصباغ الحيوية تقنية تستخدم على نطاق واسع لتتبع انتشار الخلايا مع تجنب استعمال النشاط الإشعاعي. ويستند قياس الانتشار مع هذه الكواشف تمييع صبغ بعد انقسام الخلية. وعلاوة على ذلك، هذه الأصباغ يمكن الكشف عنها عند أطوال موجية متعددة ويتم تحليلها بسهولة بالتدفق الخلوي في تركيبة مع عدة علامات أو أجسام مضيئة. نسلط الضوء على فائدة هذا البروتوكول من خلال إظهار كيف يمكن تحليل تنشيط خلية تي وانتشارها، والتمايز Th1 بالتدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أقر إجراءات تجريبية مؤسسة المركز الوطني البحوث كارديوفاسكولاريس كارلوس الثالث (المحوسبة بطاقة الهوية الوطني) والقبلة اوتونوما دي مدريد وفقا للمبادئ التوجيهية للاسبانية والأوروبية. الفئران كانت تربيتها في ظروف (منتدى جنوب المحيط الهادئ) مجاناً الممرض محددة وقد euthanized باستنشاق غاز ثاني أكسيد الكربون (CO2).
1-عزل خلايا نخاع العظام الماوس من تيبياس وقصبة
ملاحظة: الضغط الماوس كونجينيك C57BL/6 يحمل الكريات البيض التفاضلية علامة بتبرك، يعترف عموما بأنهم CD45.1 أو Ly5.1، في حين أن السلالات البرية من نوع C57BL تحمل اليل بتبركب ، المعروفة باسم CD45.2 أو Ly5.2. يمكن التمييز بين المتغيرات CD45.1 و CD45.2 بالتدفق الخلوي استخدام الأجسام المضادة. يمكن استخدام الفئران CD45.1 و CD45.2 و CD45.1/CD45.2 كمصادر للخلية أو كمتلقين لنقل التبني، والسماح بالبحث عن المفقودين السكان خلية متميزة بالتدفق الخلوي. استخدام تفضيلي العمر-ومطابقة الجنس الفئران الذكور أو الإناث دون 12 أسبوعا عمر.
-
إعداد قصبة وتيبياس
- Euthanize الفئران باستخدام بروتوكول أقرته لجنة مؤسسات الرعاية الحيوانية.
- تطهير أطرافه هند بالرش على سطح الحيوان مع الإيثانول 70%.
- استخدام مقص معقم والملقط والمشارط. مع مشرط، جعل قطع في الجلد وإزالة الجلد من الجزء القاصي من الفأرة بما في ذلك الجلد الذي يغطي الأطراف الخلفية. قشر الجلد حول عضلة الساق السفلي وإزالة الجلد من الساقين بالكامل (الشكل 2 أ، 2).
- فصل في عضلة الفخذ من عظم الفخذ باستخدام مشرط. ديسارتيكولاتي الورك دون كسر رأس عظم الفخذ. إزالة العضلات الساق باستخدام مشرط (الشكل 2، 2D). فصل في عظم الفخذ من الساق دون كسر نهايات العظام.
- الحفاظ على العظام في طبق بتري يحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين 1% في المتوسط روزويل بارك التذكاري المعهد (ربمي) 1640 x 1 المثلج.
-
عزل خلية
ملاحظة: يجب إجراء جميع الخطوات اللاحقة تحت غطاء ثقافة ومع مواد معقمة لتجنب التلوث.- في طبق بتري معقم، بعناية قطع نهايات كل العظام مع مشرط القريبة والبعيدة.
- مسح العظام مرارا وتكرارا مع إجمالي حجم 10 مل من الحارة المتوسطة ربمي كاملة (ربمي + 10% FBS، 2 مم يدتا 1% البنسلين/ستربتوميسين، 20 مم هيبيس، 55 ميكرون 2-mercaptoethanol، بيروفات صوديوم 1 مم ومم 2 لتر-الجلوتامين). مسح العظام من كلا الطرفين باستخدام إبرة ز 25 يعلق على حقنه 1 مل.
- نقل افلواتي إلى أنبوب مخروطي 50 مل مزودة بعامل تصفية ويب نايلون ميكرومتر 70. عناية إزاحة التكتلات الحطام وخلية بالتحريك اللطيف وبيبيتينج.
- الطرد المركزي بتعليق خلية في 250 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت تحلل خلايا الدم الحمراء الباردة (0.15 م NH4Cl + 1 مم كهكو3 + 0.1 مم يدتا، تعديل درجة الحموضة إلى 7.2 مع 1 N HCl، 0.4 ميكرومتر العقيمة التي تمت تصفيتها، وتخزينها في 4 درجات مئوية). الحفاظ على الجليد لمدة 5 دقائق مع دليل تهتز.
- إضافة 10 مل من المخزن المؤقت الباردة (1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) + يدتا 2 مم + 2% ألبومين المصل البقري (BSA)) إلى إلغاء تنشيط وتغسل المخزن المؤقت تحلل خلايا الدم الحمراء.
- الطرد المركزي من تعليق خلية في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تغسل الخلايا مع 25 مل كاملة ربمي المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند الخلايا في 5 مل من إكمال ربمي المتوسطة. ميكس 50 ميليلتر من تعليق خلية 1:1 مع تريبان الأزرق. تحديد عدد الخلايا في دائرة عد تحت مجهر. حساب عدد الخلايا باستخدام الصيغة: خلايا/مل = [(الخلية الملطخة بغير حساب/4) × 2 × 10,000]12.
ملاحظة: هذا الأسلوب غلة 40 × 106 إلى 60 × 106 العظام خلايا النخاع الواحدة 8 مصابة بالماوس C57BL/6 الأسبوع عمره 12. - الطرد المركزي من تعليق خلية في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
2-DC التمايز ونضوج وتحميل مستضد
-
خلية BM الحصاد
- بذور ثقافة كاملة على ألواح السطح 6-جيدا جداً منخفضة مرفق في 106 خلايا كل مل متوسطة، عادة في 5 مل كل بئر. سيتم إرفاق الضامة المتباينة للثقافة-اللوحات. بعد ح 12، نقل المادة طافية، الذي يتضمن أساسا وحيدات، لتنظيف لوحات 6-جيدا، وتجاهل لوحات 6-بئر قديمة مع الضامة التقيد بها.
- تعزيز التمايز الخلية، ثقافة الخلايا غير ملتصقة على 5 × 105 خلايا كل مل في عادة 5 مل في بئر المتوسطة ربمي كاملة تحتوي على 20 نانوغرام/مليلتر تجارياً حصلت GM-CSF مورين المؤتلف في غاز ثاني أكسيد الكربون (CO2) 37 درجة مئوية و 5% و نلاحظ يوميا.
- وتدور أسفل كل 3 أيام، تدور أسفل الخلايا مع وقف التنفيذ، وجمع الخلايا ملتصقة مع 5 مم يدتا في برنامج تلفزيوني. والجمع بين وريسوسبيند في 5 × 105 خلايا/مل في المتوسط الطازجة التي تحتوي على 20 نانوغرام/مليلتر جمهورية مقدونيا-GM-CSF.
- اليوم 8، جمع ملتصقة وفصل الخلايا المذكورة أعلاه وريسوسبيند في 5 × 105 خلايا/مل في المتوسط تحتوي على 20 نانوغرام/مليلتر GM-CSF و 20 نانوغرام/مليلتر lipopolysaccharide (LPS) ح 24 في تعامل من زراعة الأنسجة غير معقمة بيتري طبق، للحث على ارتفاع MHC-ثانيا ، التعبير CD80 و CD86.
- التفريق بين العاصمة الاختيار بالتدفق الخلوي كما هو مبين في الخطوة 2، 2.
-
تدفق التمايز الخلوي وتحليل النضوج.
- الطرد المركزي من تعليق خلية في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين.
- مستقبلات Fc كتلة التي تفرخ بيليه حراكه الخلية في الماوس Fc مستقبلات مانع (تنقية المضادة للماوس جسم2b "مفتش" CD16/CD32) لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- الطرد المركزي من تعليق خلية في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- لكل التحقيقات، ريسوسبيند الخلايا 250,000 في 300 ميليلتر من التدفق الخلوي العازلة (1 × يدتا مم 2 + برنامج تلفزيوني + 2% جيش صرب البوسنة) في 4 درجات مئوية.
- نقل 30 ميليلتر من حل الخلية الواحدة وكذلك إلى 96-جيدا-طبق.
- الطرد المركزي من تعليق خلية في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تجاهل المادة طافية وإضافة 30 ميليلتر المحتوية على جسم المخزن المؤقت لكل جيدا بعد مؤشرات الشركة المصنعة. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: عادة ما تستخدم علامات لوحدات تحكم المجال Dc ووحيدات والضامة هي CD11b، CD64، CD115، CD11c، مهسيي، CD80، و CD86 (الشكل 3). - الطرد المركزي في العينات من 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وريسوسبيند في 200 ميليلتر كل من تدفق الباردة الخلوي المخزن المؤقت الذي يحتوي على علامة لاستبعاد الخلايا الميتة (يوديد propidiumمثلاً، أو 4 أو 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) أو صبغ أمين المتفاعلة جيدا ) في تركيز الموصى بها الشركة المصنعة13.
- مراقبة تمايز الخلية بنقل العينات إلى أنابيب التدفق الخلوي وإجراء تحليل التدفق الخلوي باستثناء الخلايا الميتة في الأيام 0, 3 و 6 و 9.
-
تحميل مستضد DC.
- في يوم 8، الطرد المركزي العينات من 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند الكريات في 200 ميليلتر المتوسطة (ربمي + 10% FBS دون المضادات الحيوية). كرر هذه الخطوة مرتين.
- احتضان وحدات تحكم المجال Dc مع 10 ميكروغرام/مل أوفاب (323-339؛ إيسقافهاهاينيجر) الواحدة 1 × 107 وحدات تحكم المجال Dc في 1 مل متوسطة (رمبي + 1% FBS) في أنبوب بلاستيكي لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية. استخدام وحدات تحكم المجال Dc غير محملة أوفاب كشرط من شروط مراقبة سلبية.
- الطرد المركزي في العينات من 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند الكريات في 200 ميليلتر الكامل ربمي المتوسطة. كرر هذه الخطوة مرتين.
- الطرد المركزي في العينات من 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند الكريات في 200 ميليلتر المتوسطة (ربمي + 10% FBS) في 2 × 106 خلايا/مل.
3-عزل الخلايا التائية CD4 ساذجة من الفئران أوتيي
ملاحظة: هذا الأسلوب غلة حوالي 100 × 106 سبلينوسيتيس كل 8 مصابة بالماوس C57BL/6 الأسبوع عمره 12. يمكن استخدام كل من الذكور والإناث. خلايا CD4 T يمكن أن تكون معزولة عن الطحال أو الغدد الليمفاوية؛ خلايا CD4 T تمثل حوالي 25% و 50% من الخلايا في هذه الأجهزة، على التوالي. نفذ الخطوات التالية في ظروف معقمة.
- عزل الليمفاوية الاربية وابطي وعضدي، وسرطان عنق الرحم والمساريقي العلوي والطحال من الفئران المعدلة وراثيا أوتي (الشكل 4) ونقلها إلى بلاستيك طبق بتري يحتوي على 10 مل من إكمال ربمي المتوسطة.
- شطف مصفاة الخلية مع 2 مل من إكمال ربمي المتوسطة وإزالته من أنبوب 50 مل. نقل الغدد الليمفاوية والطحال إلى مصفاة خلية 70 ميكرومتر توضع في أنبوب 50 مل. مجانسة استخدام المحاقن المكبس (الشكل 5)، وإضافة متوسطة تصل إلى 15 مل.
- الطرد المركزي في العينات من 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند بيليه في 15 مل من إكمال ربمي المتوسطة. كرر هذه الخطوة مرتين.
- تعليق خلية الطحال، ريسوسبيند بيليه الخلية وخلايا الدم الحمراء كما هو مبين في الخطوة 1.2.5.
- الطرد المركزي من تعليق خلية في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تغسل الخلايا مع 25 مل كاملة ربمي المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت
- ريسوسبيند الخلايا في 5 مل متوسطة. ميكس 50 ميليلتر من تعليق خلية 1:1 مع تريبان الأزرق. تحديد عدد الخلايا باستخدام دائرة عد تحت مجهر. حساب عدد الخلايا باستخدام الصيغة: خلايا/مل = [(الخلية الملطخة بغير حساب/4) × 2 × 10,000]12.
- كرر الخطوة 2.2.2.
- بناء على تعليمات الشركة المصنعة، احتضان الخلايا مع تخفيف 1:800 الأجسام المضادة بيوتينيلاتيد إلى CD8α، IgM، B220، CD19، مهسيي (I-Ab)، CD11b، CD11c، CD44، CD25 و DX5 لمدة 30 دقيقة على الجليد للانتقاء السلبي في وقت لاحق من خلايا CD4 T.
- اتباع إرشادات الشركة المصنعة، واستنادا إلى العدد الخلايا والقدرة الخرز، حساب المبلغ المطلوب من المغلفة ستريبتافيدين ميكروبيدس المغناطيسي وعزل الخلايا CD4 T باستخدام فاصل خلية مغناطيسية والمناسبة الفصل بين الأعمدة.
- ريسوسبيند الخلايا في 5 مل من إكمال ربمي المتوسطة وإبقائهم على الجليد بينما عد الخلايا الحية كما هو موضح في الخطوة 3، 7.
- استخراج 2 × 105 خلايا والتحقق من نقاء الخلايا المجمعة باستخدام مكافحة CD8 CD4 و B220 و CD3 الأجسام المضادة الفلورسنت في سيتوميتير تدفق استخدام تخفيف جسم توصي الشركة المصنعة.
- لوصمة عار خلايا CD4/أوتيي "تي" السذاجة معزولة، ريسوسبيند 106 خلايا في المخزن المؤقت 500 ميليلتر (1 × يدتا مم 2 + برنامج تلفزيوني + 2% جيش صرب البوسنة). إعداد 500 ميليلتر المخزن المؤقت (1 × يدتا مم 2 + برنامج تلفزيوني + 2% جيش صرب البوسنة) التي تحتوي على مضاعفة تركيز الخلية الحيوية الراسم صبغ النهائي الموصى بها من الشركة المصنعة. مزيج من كلا الحلول عن طريق إضافة الحل الراسم الخلية ببطء إلى تعليق خلية. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- تغسل الخلايا مع 5 مل من إكمال ربمي المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من إكمال المتوسطة ربمي في 1 × 107خلايا/مل.
4. في فيفو التنشيط وانتشارها والمقايسة التمايز Th1
ملاحظة: الخلية الحيوية الراسم صبغ كاربوكسيفلوريسسين اسيتات سوكسينيميديل إستر (CFSE) وأخرى سوكسينيميديل المستندة إلى إستر الأصباغ، ونحن متحمسون وتنبعث منها الأسفار عند أطوال موجية مختلفة، تستخدم على نطاق واسع لتقييم انتشار اللمفاويات بالتدفق الخلوي بسبب كثافة الفلورية العالية، منذ فترة طويلة-حياتهم وتقلب منخفض، وسمية منخفضة14.
- نقل أدوبتيفيلي عن طريق الوريد (رابعا) 1 × 106 خلية حيوية حية الراسم السذاجة الملطخة بصبغ "تي" CD4/أوتي الخلايا في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني للماوس. يمكن نقل الخلايا التائية المسماة أدوبتيفيلي بذيل الوريد أو حقن الرجعية-المداري15؛ وفي كلتا الحالتين، سوف المنزل الخلايا للأجهزة اللمفاوية (الشكل 6A).
- تحدي الفئران المستفيدة يوم واحد بعد ذلك بنقل أدوبتيفيلي 100,000 نضجت لبس أوفاب-تحميل وحدات تحكم المجال Dc بالحقن تحت الجلد (s.i.) في فوتبادس (الشكل 6B).
- حصاد المابضيه الليمفاوية من الفئران المستفيدة ومعالجتها حتى الحصول على تعليق خلية مفردة اتباع نفس الخطوات كما سبق ذكره في 3.1 و 3.2. هذا التحصين بعد يوم 2 لقياس تنشيط خلية CD4/أوتي T، وفي اليوم الخامس لقياس الانتشار بالإضافة إلى التمايز Th1.
- لتحليل تنشيط الخلية تي في اليوم 2، وصمة عار الخلايا مع نيون أجسام مضادة ضد خلايا CD4 و CD69 و CD25 (اختيارياً CD45.1 و CD45.2) وتحديد النسبة المئوية ل C69+CD25+ تي خلايا CD4 السكان. تحليل من خلال التدفق الخلوي (الشكل 7).
- للتحقق من انتشار الخلايا تي في اليوم 5، وصمة عار الخلايا باستخدام الأجسام المضادة الفلورسنت مناسب ضد خلايا CD4 واختيارياً CD45.1 و CD45.2. تحليل انحلال إشارة صبغ الراسم خلية حيوية في السكان CD4 بالتدفق الخلوي (الشكل 8). يمكن تحديد العديد من المعلمات في هذه الدراسات، مثل عدد الشعب الخلية التي مر بها الخلايا المسمى مع صبغ الراسم الخلية الحيوية، والنسبة المئوية لتقسيم الخلايا في كل ذروة الأسفار، والنسبة المئوية لتقسيم الخلايا في خلية الإجمالي السكان.
- لتحديد التمايز Th1 في اليوم الخامس، لوحة خلايا 400,000 كل من صفيحة 96-جيدا في 200 ميليلتر من المتوسطة ربمي كاملة تحتوي على 1 ميكرومتر إيونوميسين و 10 نانوغرام/مل phorbol 12 ميريستاتي 13 خلات (سلطة النقد الفلسطينية) ح 6 في 37 درجة مئوية في الحاضنة جيدا. من أجل ح 4 الماضي، إضافة 3-10 ميكروغرام/مل بريفالدين أ إلى منع إفراز سيتوكين إلى المتوسط.
- الطرد المركزي لوحات لمدة 5 دقائق في 250 x ز في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية بعكس السريع من لوحة 96-جيدا.
- كرر الخطوة 2.2.2.
- وصمة عار أغشية الخلية بحضانة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية في 30 ميليلتر من الأجسام المضادة المخزن المؤقت (1 × يدتا مم 2 + برنامج تلفزيوني + 2% جيش صرب البوسنة) التي تحتوي على خلايا CD4 واختيارياً ل CD45.1 و CD45.2 في تخفيف الموصى بها من الشركة المصنعة. غسل الخلايا بإضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت (1 × يدتا مم 2 + برنامج تلفزيوني + 2% جيش صرب البوسنة) والطرد المركزي لوحات لمدة 5 دقائق في 250 x ز في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية.
- إصلاح الخلايا بإضافة 100 ميليلتر من السكروز paraformaldehyde/1% 2% لمدة 20 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي الرايت اللوحات لمدة 5 دقائق في 1,000 س ز و 4 درجة مئوية. تجاهل المادة طافية.
- بيرميبيليزي الخلايا بإضافة 50 ميليلتر من المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن داخل الخلايا (1 × برنامج تلفزيوني + 0.1% جيش صرب البوسنة، 0.01 م هيبيس، صابونين 0.3 في المائة)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إضافة 150 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1,000 س ز في الرايت تجاهل المادة طافية.
- وصمة عار السيتوكينات داخل الخلايا بإضافة 30 ميليلتر من مترافق fluorophore المضادة للأجسام المضادة IFNγ في المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + صابونين 0.1%)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
- غسل الخلايا بإضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + صابونين 0.1%). الطرد المركزي لوحات لمدة 5 دقائق في 1,000 س ز على RT وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرتين.
- تحليل السكان خلية بالتدفق الخلوي (الشكل 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 الخطوات الموصوفة في هذا البروتوكول. ويبين الشكل 2 بالعزلة وثقافة الخلايا BM الماوس. إضافة GM-CSF ولبس لهذه الثقافات يتيح توليد في المختبر ونضوج DCs. الشكل 3 يوضح تحليل التدفق الخلوي للمفاضلة ونضوج DCs المستمدة من BM GM-CSF تحميل وحدات تحكم المجال Dc-أوفاب التي تم الحصول عليها ويتم نقل الخلية الحيوية المعزولة تتبع الملطخة بصبغ خلايا CD4/أوتي "تي" أدوبتيفيلي للفئران. ويبين الشكل 4 موقع الليمفاوية المستخدمة لعزل خلايا CD4/أوتي "تي". يبين الشكل 5 أنبوب 50 مل مزودة بعامل التصفية النايلون 70 ميكرومتر والمكبس المحاقن المستخدمة لمجانسة بالغدد الليمفاوية والطحال. ويبين الشكل 6 رابعا حقن الخلايا CD4/أوتيي "تي" في الضفيرة الرجعية-المداري وحقن الليبي DCs المستمدة من BM GM-CSF محملة أوفاب إلى قاطع. توزيع الخلايا "التائية" CD4/أوتي إلى مختلف الأجهزة اللمفاوية، بينما DCs GM-CSF تهاجر إلى الغدد الليمفاوية المابضيه حيث DCs GM-CSF تنشيط خلايا CD4/أوتي "تي" السذاجة بعرض أوفاب. الخلايا "التائية" CD4/أوتي ساذجة ثم تتكاثر وتفرق نحو النمط الظاهري Th1. الشكل 7 يوضح بالتحديد الكمي للسذاجة CD4/أوتي "تي" خلية التنشيط من التحليل لغشاء CD69 والتعبير CD25. ويبين الشكل 8 التحديد الكمي لتكاثر الخلايا CD4/أوتي "تي". ويوضح الشكل 9 التحديد الكمي لتمايز خلية CD4/أوتي "ر" نحو النمط الظاهري Th1.
رقم 1: نظام البروتوكول. 1) عزل الخلايا BM من قصبة الماوس وتيبياس. تستمد الخلايا BM 2) الثقافة مع GM-CSF لتوليد BM GM-CSF-DCs. 3) التمايز DC الاختيار وناضجة BM GM-CSF المشتقة-وحدات تحكم المجال Dc مع لبس. 4) التحقق من نضوج DC. 5) تحميل وحدات تحكم المجال Dc مع أوفاب. 6) عزل خلايا CD4/أوتيي "ر" شكل الماوس الطحال. 7) خلايا CD4/أوتي "ر" وصمة عار مع صبغ الراسم الخلية الحيوية. 8) تحقق النقاء العزلة وخلية حيوية الراسم صبغ تلطيخ الخلايا "التائية" CD4/أوتي معزولة. 9) أدوبتيفيلي نقل رابعا خلايا CD4/أوتي "تي" معزولة للفئران المستفيدة. 10)-نقل أدوبتيفيلي الليبي DCs محملة أوفاب ونضجت للفئران المستفيدة. 11) للتحقق من تنشيط الخلايا CD4/أوتي "تي". 12) للتحقق من انتشار الخلايا CD4/أوتي "ر" والتمايز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: عملية عزل نخاع العظام من قصبة الماوس وتيبياس- (أ) الجلد شق بالمقص. (ب) إزالة الجلد من الطرف المصاب. (ج) العضلات شق بالمقص. (د) إزالة العضلات من أطرافهم مع مشرط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
3 الشكل: تدفق التحليل الخلوي لنضوج DCs المستمدة من BM GM-CSF. سطح التعبير مهسيي، و CD80، و CD86 في لبس المنشط (+ لبس) وعدم تفعيلها (-لبس) المستمدة من BM GM-CSF DCs. أرقام تظهر كثافة fluorescence يعني في وحدات التعسفي (a.u.). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: موقع الليمفاوية الاربية وابطي وعضدي، وسرطان عنق الرحم والمساريقي العلوي والطحال في الفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: إعداد تجريبية للعقدة الليمفاوية والطحال التجانس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: التبني نقل الخلايا "التائية" CD4/أوتي وجنرال موتورز محملة أوفاب-CSF BM-المشتقة-DCs. (A) الحقن من خلايا CD4/أوتيي "تي" في الضفيرة الرجعية-المداري. (ب) تحت الجلد حقن DCs المستمدة من BM GM-CSF أوفاب-تحميل إلى قاطع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: التحديد الكمي لخلية تي التنشيط في فيفو. التدفق الخلوي المؤامرات والرسم البياني عرض التحليل والقياس الكمي للتعبير غشاء من CD69 في خلايا CD4 T. كانت الفئران CD45.1/CD45.2 الرابع أدوبتيفيلي المنقولة مع الماوس CD45.1/CD4/OTII والخلايا CD45.1/CD4/OTII 24 ساعة قبل نقل محملة أوفاب GM-CSF BM التبني الليبي-المشتقة-تم قياس DCs. تي خلية التنشيط في أيام 2 وظيفة-العاصمة نقل بالتدفق الخلوي بعد تلطيخ مع معلم الفلورسنت الأجسام المضادة على المستضدات المشار إليه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: القياس الكمي للخلية T انتشار فيفو في. التدفق الخلوي المؤامرات والرسوم البيانية عرض التحليل والقياس الكمي لصبغ الراسم الخلية الحيوية انخفاض تلطيخ في تكاثر الخلايا التائية CD4. كانت الفئران CD45.2 الرابع أدوبتيفيلي المنقولة مع الماوس CD45.1/CD4/OTII الخلايا 24 ساعة قبل نقل محملة أوفاب GM-CSF BM التبني الليبي-المستمدة-تم قياس انتشار الخلايا DCs. تي في 5 أيام بوست-DC نقل بالتدفق الخلوي بعد تلطيخ مع وأشارت إلى أجسام مضيئة. ويمكن تحديد انتشار الخلايا t بقياس النسبة المئوية للخلايا المتكاثرة، النسبة المئوية للخلايا في كل ذروة شعبة، أو بإحصاء عدد قمم شعبة كما هو موضح في الرسوم البيانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 9: القياس الكمي لتمايز الخلايا تي صوب Th1 النمط الظاهري في فيفو. قطع التدفق الخلوي والرسوم البيانية عرض التحليل والقياس الكمي للنسبة المئوية لخلايا CD4 تي IFNγ--وإذ يعرب عن. كانت الفئران CD45.2 الرابع أدوبتيفيلي المنقولة مع الماوس CD45.1/CD4/OTII الخلايا 24 ساعة قبل نقل محملة أوفاب GM-CSF BM التبني الليبي-المستمدة-تم قياس DCs. تي الخلية التمايز في أيام بوست-DC نقل بالتدفق الخلوي بعد تلطيخ مع وأشارت إلى أجسام مضيئة. تمييز الخلايا t نحو النمط الظاهري Th1 مصممة كخلايا معربا عن IFNγ كنسبة مئوية من مجموع خلايا CD4 تي ومن تكاثر الخلايا CD4 T فقط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح هذا البروتوكول لوصف قدرة المستمدة من BM DCs تعدل التنشيط وانتشارها، والتفريق بين خلايا CD4 T ساذجة. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدامه لتقييم قابلية خلايا CD4 T للتحوير بوحدات تحكم المجال Dc المستمدة من بي أم. مع أحكام هذا البروتوكول، التغييرات في هذه الأحداث يمكن أن يقاس في فيفو.
اعتماداً على فرضية قيد التحقيق، ويمكن استخدام العديد من تركيبات من خلايا تي ووحدات تحكم المجال Dc. على سبيل المثال، يمكن تحليل إحدى عواقب يطرق في أو انقطاع جينات محددة أو كفاءة حافزا محددة لتنشيط خلايا CD4 T أو الانتشار أو التمايز Th1. يمكن تنفيذ هذه الإجراءات على وحدات تحكم المجال Dc أو تي CD4 الخلايا أو في كلا النوعين من الخلايا. وهكذا، يمكن الجمع بين خلايا CD4 T من الفئران البرية من نوع أو المحورة وراثيا مع وحدات تحكم المجال Dc المستمدة من الفئران البرية من نوع والعكس بالعكس.
هذا البروتوكول يمكن تكييفها لتمييز أصل السكان خلية مختلفة باستخدام التدفق الخلوي وأجسام مضادة ضد CD45.1 و CD45.2. وفي الواقع، يمكن استخدام الفئران CD45.1/CD45.1 و CD45.2/CD45.2 كمصدر لأي نوع من أنواع الخلايا المستخدمة أو كمتلقين لنقل التبني في أي مجموعة. على سبيل المثال، يمكن الحصول على خلايا CD4 T من الفئران CD45.1/CD45.1/OTII بينما الفئران CD45.2/CD45.2 يمكن أن يكون أصل BM لتوليد DC. في هذه التجربة، يمكن نقل كل أنواع الخلايا أدوبتيفيلي إلى CD45.1/CD45.2 الفئران. وعلاوة على ذلك، الخلايا "التائية" CD4/أوتيي من CD45.1/CD45.1 اكتب أحد الفئران ويمكن الجمع بين الفئران النوع الثاني CD45.2/CD45.2 في CD45.1/CD45.2 نفس أو مختلفة النوع ثلاثة المستلمين لمقارنة سلوك نوع واحد واكتب اثنين من السكان خلية CD4 T في التنافس و غير منافسة الظروف، على التوالي.
يصف هذا الأسلوب الجيل من وحدات تحكم المجال Dc المستمدة من BM GM-CSF. مع ذلك، تتوفر بروتوكولات بديلة للعاصمة النضج والتمايز؛ على سبيل المثال، يمكن استخدام غراء بدلاً من لبس أو المتعلقة بالمكتب الاتحادي للهجرة تيروزين كيناز 3 يجند (Flt3-L) بدلاً من GM-CSF، السماح لدراسة قدرة متميزة phenotypically وحدات تحكم المجال Dc لتنشيط خلايا CD4 T مناعة التكيفية. مع نفس النية، يمكن أن تكون وحدات تحكم المجال Dc لتحميل مستضد والعرض التقديمي مباشرة المعزولة من الفئران. الجمع بين هذا البروتوكول مع الآخرين9 تسمح بالتلاعب بالسذاجة خلايا CD4/أوتي "تي" ب العدوى الفيروسية16 قبل نقلهم التبني للفئران المستفيدة. يمكن أن يكون ترانسدوسيد بي أم أيضا مع الفيروسات القهقرية9 إلى دراسة أثر التعديلات التي تسيطر عليها الخلية على وحدات تحكم المجال Dc قبل استخدامها في البروتوكول.
بالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييفها للفحص المجهري إينترافيتال الدراسات17 هذا البروتوكول باستخدام خلايا الفلورسنت معربا عن البروتين. على سبيل المثال، يمكن أن عبرت الفئران CD4/أوتيي مع الإعراب عن التجارة والنقل أو الكرز الفئران للحصول على الفئران بروتينات فلورية خضراء أو CD4 الكرز/أوتيي. يمكن ثم استخدامها كمصدر للخلايا CD4 T هذه الفئران ويمكن دمجها مع وحدات تحكم المجال Dc BM-مشتقة من الفئران التعبير عن الكرز أو التجارة والنقل، كما هو مطلوب، في فيفو التجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور سيمون بارتليت لتحرير اللغة الإنجليزية. كان يؤيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من معهد دي السعود كارلوس الثالث (إيسسيي) (PI14/00526؛ PI17/01395؛ CP11/00145؛ CPII16/00022)، ميغيل سيرفيت البرنامج ومؤسسة رامون أريسيس؛ بتمويل مشترك من فوندو Europeo للتنمية الإقليمية (فدر). المحوسبة بطاقة الهوية الوطني معتمد من قبل وزارة الاقتصاد والصناعة و "القدرة التنافسية" (ميتش) ومؤسسة برو المحوسبة بطاقة الهوية الوطني وسيفيرو أوتشوا مركز التميز (SEV-2015-0505). RTF هو تأسست على يد مؤسسة رامون أريسيس والمحوسبة بطاقة الهوية الوطني، فزج من إيسسيي، بهف بمعهد دي JMG-ز البرنامج سيرفيت ميغيل إيسسيي و imas12 وبحوث سانيتاريا مستشفى 12 دي تشرين الأول/أكتوبر (imas12).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
- Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
- Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
- Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
- Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
- Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
- Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
- Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
