Summary
Vi præsenterer her, en protokol til i vivo bestemmelse af naive CD4 T celle (T-celle) aktivering, spredning og Th1 differentiering induceret af GM-CSF knoglemarv (BM)-afledt dendritiske celler (DCs). Derudover beskriver denne protokol BM og T-celle isolation, DC generation og DC og T-celle adoptiv overførsel.
Abstract
Kvantificering af naive CD4 T celle aktivering, spredning og differentiering til T hjælper 1 (Th1) celler er en nyttig måde at vurdere den rolle af T-celler i en immunrespons. Denne protokol beskriver in vitro- differentiering af knoglemarven (BM) stamfaderen til få granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) afledt-dendritiske celler (DCs). Protokollen også beskriver adoptiv overførsel af ægalbumin peptid (OVAp)-indlæst GM-CSF-afledte DCs og naive CD4 T celler fra OTII Transgene mus for at analysere i vivo aktivering, spredning og Th1 differentiering af den overførte CD4 T-celler. Denne protokol omgår begrænsning af rent i vivo metoder som manglende evne til at specifikt manipulere eller Vælg befolkningens studerede celle. Desuden, denne protokol giver studier i i vivo miljø, således at man undgår ændringer til funktionelle faktorer, der kan opstå i vitro og med indflydelse af celletyper og andre faktorer, der er kun fundet i intakt organer. Protokollen er et nyttigt værktøj til at skabe ændringer i DCs og T celler, ændre adaptive immunrespons, potentielt giver vigtige resultater for at forstå oprindelsen eller udvikling af talrige immun associerede sygdomme.
Introduction
CD4 T-celler og antigen præsentere celler (PMV'er) som DCs er påkrævet mediatorer af immunitet mod mikrobielle patogener1,2. I perifere lymfoide organer aktiveres CD4 T-celler på anerkendelse af specifikke antigen præsenteret af PMV'er3,4,5. Aktiverede CD4 T celler formere sig og differentiere sig til forskellige specifikke effektor Th celler, der er nødvendige for udviklingen af en korrekt adaptive immunrespons6,7. Kontrol af disse processer er afgørende for at producere en tilstrækkelig adaptive forsvar, der dræber patogenet uden producerer skadelige væv skader8. Th celler defineres efter udtryk eller produktion af overflade molekyler, transkriptionsfaktorer og effektor cytokiner og udføre vigtige og præcise funktioner i svar til patogener1. Celler af Th1 celle delmængde express transkriptionsfaktor T-bet og cytokin interferon γ (IFNγ) og deltage i vært forsvar mod intracellulære patogener1. Kvantificering af naive CD4 T celle aktivering, spredning og Th1 differentiering er et nyttigt middel til at vurdere den rolle T celler spiller i en immunrespons.
Denne protokol giver in vivo analyse af kapaciteten af in vitro -genereret BM-afledte DCs at modulere aktivering, spredning og Th1 differentiering af naive CD4 T-celler. Protokollen også tjener til at vurdere kapaciteten af naive CD4 T celler skal være aktiveret, tilskyndet til at formere sig, og Th1 differentieret (figur 1). Denne alsidige protokol omgår den manglende evne til at specifikt manipulere eller Vælg studerede cellen befolkningen i rent i vivo protokoller. Virkningerne af forskellige molekyler og behandlinger på DCs kan studeres ved hjælp af BM fra genmodificerede mus5 eller behandle eller genetisk manipulere isolerede BM celler9. På samme måde, T-celle svar kan udforskes ved at opnå T celler for adoptiv overførsel fra forskellige kilder eller efter flere manipulationer3,8,10.
De vigtigste fordele ved denne protokol er dobbelt. T-celle aktivering, spredning og Th1 differentiering analyseres med en flow flowcytometri tilgang; og dette er kombineret med i vivo undersøgelser, dermed afværge ændringer, der kan opstå i vitro og herunder celletyper og andre faktorer, der er kun fundet i intakt organer11.
Brugen af vitale farvestoffer er en udbredt teknik til at spore celleproliferation samtidig undgå brugen af radioaktivitet. Måling af spredning med disse reagenser er baseret på farvestof fortynding efter celledeling. Desuden, disse farvestoffer kan påvises på flere bølgelængder og er let analyseres ved flowcytometri i kombination med flere fluorescerende antistoffer eller markører. Vi fremhæve nytten af denne protokol ved at vise, hvordan T-celle aktivering, spredning og Th1 differentiering kan analyseres ved flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentelle procedurer blev godkendt af Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) og Comunidad Autónoma de Madrid i overensstemmelse med spanske og europæiske retningslinjer. Mus blev avlet i specifikke patogen gratis (SPF) betingelser og blev aflivet af kuldioxid (CO2) indånding.
1. isolering af musen knoglemarv celler fra forbenede og lårben
Bemærk: C57BL/6 congenic mus stamme bærer differential leukocyt markør Ptprcen, almindeligt anerkendt som CD45.1 eller Ly5.1, mens vildtype C57BL stammer bære Ptprcb allel, kendt som CD45.2 eller Ly5.2. CD45.1 og CD45.2 varianter kan være kendetegnet ved flowcytometri ved hjælp af antistoffer. CD45.1, CD45.2 og CD45.1/CD45.2 mus kan bruges som celle kilder eller modtagere for adoptiv overførsel, tillader sporing af de forskellige cellepopulationer ved flowcytometri. Fortrinsvis bruger alder- og køn-matchede mandlige eller kvindelige mus under 12 ugens i alder.
-
Forberedelse af lårben og skinneben
- Aflive mus ved hjælp af den protokol, der er godkendt af den institutionelle dyrs pleje.
- Desinficere hind lemmer ved sprøjtning animalske overfladen med 70% ethanol.
- Brug steril saks, pincet og skalpeller. Med en skalpel, gøre et snit i huden og fjern skindet fra den distale del af musen herunder huden dækker de posteriore ekstremiteter. Skræl huden omkring den nederste lægmusklen og fjern skindet fra benene helt (figur 2A, 2B).
- Adskille quadriceps musklen fra lårbenet ved hjælp af en skalpel. Disarticulate i hofteled uden at bryde lårbenet hovedet. Fjerne musklerne fra skinnebenet ved hjælp af en skalpel (figur 2 c, 2D). Adskille lårbenet fra tibia uden at bryde knogleenderne.
- Holde knoglerne i en petriskål, som indeholder 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin i iskold 1 x Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium.
-
Celle Isolation
Bemærk: Alle efterfølgende trin skal udføres under en kultur hætte og med sterile materiale til at undgå forurening.- I en steril petriskål, skær forsigtigt af proksimale og distale enderne af hver knogle med en skalpel.
- Skyl knogler gentagne gange med en samlet maengde paa 10 mL varm komplet RPMI medium (RPMI + 10% FBS, 2 mM EDTA, 1% penicillin/streptomycin, 20 mM HEPES, 55 µM 2-mercaptoethanol, 1 mM natrium pyruvat og 2 mM L-glutamin). Skylle knoglerne fra begge ender, ved hjælp af en 25 G kanyle tilknyttes en 1 mL sprøjte.
- Overførsel af effluate til en 50 mL konisk slange udstyret med en 70 µm nylon webfilter. Forsigtigt løsne snavs og celle konglomerater af blid omrøring og pipettering.
- Der centrifugeres cellesuspension ved 250 x g i 10 min. ved stuetemperatur (RT).
- Celle resuspenderes i 1 mL koldt røde blodlegemer lysisbuffer (0,15 M NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0,1 mM EDTA, justerede pH til 7,2 med 1 N HCl, 0,4 µm sterile filtreret, og opbevares ved 4 ° C). Vedligehold i isbad i 5 min med manuel omrystning.
- Der tilsættes 10 mL af kolde buffer (1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) + 2 mM EDTA + 2% bovint serumalbumin (BSA)) for at inaktivere og vaske ud rød blod celler lysisbuffer.
- Centrifugeres cellesuspension ved 250 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Vaske cellerne med 25 mL af komplet RPMI medium og centrifugeres ved 250 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Resuspend celler i 5 mL af komplet RPMI medium. Mix 50 µL af cellesuspension 1:1 med trypan blå. Bestemme den celle nummer i en optælling kammer under et mikroskop. Beregne den celle nummer ved hjælp af formlen: celler/mL = [(ikke-farvede celle count/4) x 2 x 10.000]12.
Bemærk: Denne metode udbyttet 40 x 106 -60 x 106 knogle marv celler pr. uinficeret 8 til 12 uger gamle C57BL/6 mus. - Centrifugeres cellesuspension ved 250 x g i 5 min. ved 4 ° C.
2. DC differentiering, modning og Antigen lastning
-
BM celle høst
- Seed komplet kultur på 6-godt ultra-lav-attachment overflade plader på 106 celler pr. mL af medium, typisk i 5 mL pr. brønd. Differentierede makrofager vil tillægge kultur-plader. Efter 12 h, overføre supernatanten, der hovedsagelig består af monocytter, for at rense 6-godt plader, kassere de gamle 6-godt plader med de overholdt makrofager.
- For at fremme Celledifferentiering, kultur ikke-tilhænger celler på 5 x 105 celler pr. mL i typisk 5 mL pr. brønd af komplet RPMI medium indeholdende 20 ng/mL kommercielt fremstillet rekombinant murine GM-CSF ved 37 ° C og 5% kuldioxid (CO2) og iagttage dagligt.
- Hver 3 dag, spin ned suspenderede celler og indsamle de vedhængende celler med 5 mM EDTA i PBS og spin-ned. Kombinere og resuspend på 5 x 105 celler/mL i frisk medium indeholdende 20 ng/mL rm-GM-CSF.
- På dag 8, indsamle vedhængende og fritliggende celler som ovenfor og resuspend på 5 x 105 celler/mL i medium indeholdende 20 ng/mL GM-CSF og 20 ng/mL LPS (LPS) i 24 timer i en ikke-vævskultur-behandlede steril petriskål, at inducere høj MHC-II , CD80 og CD86 udtryk.
- Check DC differentiering ved flowcytometri som angivet i trin 2.2.
-
Flow flowcytometri differentiering og modning analyse.
- Centrifugeres cellesuspension ved 250 x g i 5 min. ved 4 ° C. Gentag dette trin to gange.
- Blok Fc receptorer af inkubere resuspenderet celle pellet i mus Fc receptor blokker (renset anti mus CD16/CD32 IgG2b antistof) i 15 min. ved 4 ° C efter fabrikantens anvisninger.
- Centrifugeres cellesuspension ved 250 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- For hver probe resuspend 250.000 celler i 300 µL af flow flowcytometri buffer (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) ved 4 ° C.
- Overføre 30 µL af celle løsning pr. brønd til en 96-brønd-plade.
- Centrifugeres cellesuspension ved 250 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Supernatanten og tilføje 30 µL antistof-holdige buffer til hver godt efter fabrikantens angivelser. Inkuber celler med antistoffer i 20 min. ved 4 ° C.
Bemærk: Normalt ansat markører for DCs, monocytter og makrofager er CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 og CD86 (figur 3). - Centrifugeres prøver ved 250 x g i 5 min. ved 4 ° C og resuspend i 200 µL pr. brønd af kolde flow flowcytometri buffer som indeholder en markør for at udelukke døde celler (f.eks. propidium Iodid, 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) eller en Amin-reaktiv farvestof ) på den af fabrikanten anbefalede koncentration13.
- Overvåge Celledifferentiering ved at overføre prøverne at flow flowcytometri rør og udføre flow flowcytometri analyse undtagen døde celler på dag 0, 3, 6 og 9.
-
DC Antigen lastning.
- På dag 8, centrifugeres prøver ved 250 x g i 5 min. ved 4 ° C og resuspend pellets i 200 µL medium (RPMI + 10% FBS uden antibiotika). Gentag dette trin to gange.
- Inkuber DCs med 10 µg/mL OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) pr. 1 x 107 DCs i 1 mL medium (RMPI + 1% FBS) i et plastikrør i mindst 30 minutter ved 37 ° C. Brug ikke OVAp-loaded DCs som negativ kontrol betingelse.
- Centrifugeres prøver ved 250 x g i 5 min. ved 4 ° C og resuspend pellets i 200 µL komplet RPMI medium. Gentag dette trin to gange.
- Centrifugeres prøver ved 250 x g i 5 min. ved 4 ° C og resuspend pellets i 200 µL medium (RPMI + 10% FBS) på 2 x 106 celler/mL.
3. isolering af naive CD4 T celler fra OTII mus
Bemærk: Denne metode giver ca. 100 x 106 spleenocytes pr. uinficeret 8 til 12 uger gamle C57BL/6 mus. Både hanner og hunner kan bruges. CD4 T-celler kan isoleres fra milt eller lymfeknuder. CD4 T-celler tegner sig for ca. 25% og 50% af celler i disse organer, henholdsvis. Udfør følgende trin i sterile forhold.
- Isolere lyskebrok, aksillær, brachialis, livmoderhalskræft og mesenteriallymfeknuderne lymfeknuder og milt fra OTII Transgene mus (figur 4) og overføre dem til en plastik petriskål indeholder 10 mL af komplet RPMI medium.
- Skyl celle si med 2 mL af komplet RPMI medium og fjerne det fra 50 mL tube. Overførsel lymfeknuder og milt til en 70 µm celle si placeret i en 50 mL tube. Der homogeniseres ved hjælp af en sprøjte stemplet (figur 5) og tilføje medium op til 15 mL.
- Centrifugeres prøver ved 250 x g i 5 min. ved 4 ° C og resuspenderes i 15 mL af komplet RPMI medium. Gentag dette trin to gange.
- For milt cellesuspension, resuspenderes celle og lyse røde blodlegemer som angivet i trin 1.2.5.
- Centrifugeres cellesuspension ved 250 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Vaske cellerne med 25 mL af komplet RPMI medium og centrifugeres ved 250 x g i 5 min på RT.
- Resuspend celler i 5 mL af medium. Bland 50 µL af cellesuspension 1:1 med Trypan blå. Bestemme den celle nummer ved hjælp af en optælling kammer under et mikroskop. Beregne den celle nummer ved hjælp af formlen: celler/mL = [(ikke-farvede celle count/4) x 2 x 10.000]12.
- Gentag trin 2.2.2.
- Efter producentens anvisninger, Ruger celler med 1:800 fortyndinger af biotinylated antistoffer mod CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 og DX5 for 30 min på isen for senere negative udvalg af CD4 T-celler.
- Efter fabrikantens anvisninger og baseret på antallet af celler og kapacitet på perlerne, beregne den nødvendige mængde af streptavidin-belagt magnetiske microbeads og isolere CD4 T-celler ved hjælp af en magnetisk celle separator og de relevante adskillelse kolonner.
- Resuspend celler i 5 mL af komplet RPMI medium og holde dem på køl mens tælle levende celler, som beskrevet i trin 3.7.
- Uddrag 2 x 105 celler og tjekke renheden af de indsamlede celler ved hjælp af anti CD4, CD3, B220 og CD8 fluorescerende antistoffer i en flow Flowcytometret ved hjælp af fabrikanten anbefaler antistof fortyndinger.
- For at pletten isolerede naive CD4/OTII T-celler, resuspend 106 celler i 500 µL buffer (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA). Forberede 500 µL buffer (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) indeholdende fordoble den endelige producent-anbefalede koncentration af afgørende celle tracer farvestof. Bland begge løsninger ved at langsomt tilføje celle tracer løsning til cellesuspension. Inkuber celler i 5 min ved 37 ° C.
- Cellerne vaskes med 5 mL af komplet RPMI medium og centrifugeres ved 250 x g i 5 min. ved 4 ° C. Gentag dette trin to gange. Resuspend celler i 1 mL af komplet RPMI medium på 1 x 107celler/mL.
4. in Vivo aktivering, spredning og Th1 differentiering Assay
Bemærk: Den afgørende celle tracer farvestoffet carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFSE) og andre succinimidyl ester-baserede farvestoffer, der er spændt og udsender fluorescens på forskellige bølgelængder, der bruges til at vurdere lymfocyt spredning i flow flowcytometri på grund af deres høje fluorescens intensitet, lang levetid, lav variabilitet og lav toksicitet14.
- Adoptively overføre intravenøst (i.v.) 1 x 106 live afgørende celle tracer dye-farvede naive CD4/OTII T-celler i 100 µL af PBS pr. mus. Mærket T celler kan overføres adoptively af hale vene eller retro-orbital injektion15; i begge tilfælde vil cellerne hjem til lymfoid organer (figur 6A).
- Udfordre de modtagende mus en dag senere ved at adoptively overføre 100.000 LPS-modnet OVAp-loaded DCs ved subkutan injektion (s.i.) i trædepuder (fig. 6B).
- Høste popliteal lymfeknuder fra recipient mus og behandle dem indtil opnåelse af enkelt celle suspensioner følge de samme trin som tidligere beskrevet i 3.1 og 3.2. Gøre dette på dag 2 efter immunisering at måle CD4/OTII T celle aktivering, og på dag 5 for at måle spredningen plus Th1 differentiering.
- For at analysere T-celle aktivering på dag 2, pletten celler med fluorescerende antistoffer mod CD69 og CD4 og CD25 (valgfrit CD45.1 og CD45.2) og bestemme procentdelen af C69+CD25+ T-celler CD4 befolkning. Analysere ved flowcytometri (figur 7).
- Hvis du vil kontrollere T-celle spredning på dag 5, pletten celler ved hjælp af passende fluorescerende antistoffer mod CD4 og eventuelt CD45.1 og CD45.2. Analysere henfald af afgørende celle tracer farvestof signal i befolkningens CD4 ved flowcytometri (figur 8). Flere parametre kan bestemmes i disse undersøgelser, såsom antallet af celledelinger gennemgået af celler mærket med afgørende celle tracer farvestof, procentdel af delende celler i hver fluorescens top og procentdelen af delende celler i cellen total befolkning.
- At bestemme Th1 differentiering på dag 5, plade 400.000 celler pr. brønd af en 96-brønd plade i 200 µL af komplet RPMI medium indeholdende 1 µM ionomycin og 10 ng/mL phorbol 12 myristate 13 acetat (PMA) i 6 timer ved 37 ° C i inkubatoren. For de sidste 4 h, tilføje 3-10 µg/mL brefeldin A for at blokere cytokin sekretion til medium.
- Centrifugeres plader i 5 min. ved 250 x g ved 4 ° C. Supernatanten ved hurtig inversion af 96-brønd plade.
- Gentag trin 2.2.2.
- Pletten cellemembraner ved inkubation i 15 min. ved 4 ° C i 30 µL af buffer (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) der indeholder antistoffer til CD4 og eventuelt CD45.1 og CD45.2 på producent-anbefalede fortyndinger. Cellerne vaskes ved at tilføje 150 µL af buffer (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) og centrifugeres plader i 5 min. ved 250 x g ved 4 ° C og kassér supernatanten.
- Fix cellerne ved at tilføje 100 µL af 2% paraformaldehyde/1% saccharose i 20 min. på RT. Centrifuge plader for 5 min på 1.000 x g og 4 ° C. Supernatanten.
- Permeabilize cellerne ved at tilføje 50 µL af intracellulære permeabilization buffer (1 x PBS + 0,1% BSA, 0,01 M HEPES, 0,3% saponin) og Inkuber i 30 min. ved 4 ° C.
- Tilføj 150 µL af PBS og centrifugeres i 5 min på 1.000 x g på RT. udsmid supernatanten.
- Pletten intracellulære cytokiner ved at tilføje 30 µL af fluorophore-konjugerede anti IFNγ antistof i buffer (PBS + 0,1% saponin) og Inkuber i 30 min. ved RT.
- Cellerne vaskes med 150 µL af buffer (PBS + 0,1% saponin) at tilføje. Centrifugeres plader i 5 min på 1.000 x g på RT og supernatanten. Gentag dette trin to gange.
- Analysere cellepopulationer ved flowcytometri (figur 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer de trin, der beskrives i denne protokol. Figur 2 illustrerer den isolation og kultur af musen BM celler. Tilføjelsen af GM-CSF og LP'ER til disse kulturer giver mulighed for in vitro- generation og modning af DCs. figur 3 illustrerer strømmen flowcytometri analyse af differentiering og modning af opnåede DCs. OVAp-loaded GM-CSF BM-afledte DCs og isoleret afgørende celle trace dye-farvede CD4/OTII T celler overføres adoptively til mus. Figur 4 viser placeringen af lymfeknuder bruges til isolering af CD4/OTII T-celler. Figur 5 viser en 50 mL tube med 70 µm nylon filter og en sprøjte stemplet anvendes til at homogenisere lymfeknuder og milt. Figur 6 viser i.v. injektion af CD4/OTII T-celler i retro-orbital plexus og s.c. injektion af OVAp-loaded GM-CSF BM-afledte DCs i footpad. CD4/OTII T-celler distribuere til de forskellige lymfoide organer, der henviser til, at GM-CSF DCs migrere til de popliteal lymfeknuder, hvor GM-CSF DCs aktivere naive CD4/OTII T-celler ved præsentationen af OVAp. Naive CD4/OTII T-celler derefter formere sig og differentiere mod Th1 fænotype. Figur 7 illustrerer kvantificering af naive CD4/OTII T celle aktivering fra analysen af membran CD69 og CD25 udtryk. Figur 8 viser kvantificering af CD4/OTII T celledelingen. Figur 9 viser kvantificering af CD4/OTII T Celledifferentiering mod Th1 fænotype.
Figur 1: protokolskemaet. 1) isolere BM celler fra mus lårben og skinneben. 2) kultur BM celler med GM-CSF at generere GM-CSF BM-DCs. 3) Check DC differentiering og modne GM-CSF BM afledt-DCs med LP'ER. 4) check DC modning. 5) load DCs med OVAp. 6) isolere CD4/OTII T celler form mus milt. 7) pletten CD4/OTII T-celler med afgørende celle tracer farvestof. 8) kontrollere isolation renhed og afgørende celle tracer farvestof farvning af isolerede CD4/OTII T-celler. 9) adoptively overføre isolerede CD4/OTII T celler i.v. til recipient mus. 10). adoptively overførsel OVAp-loaded og modnet DCs s.c. til recipient mus. 11) check CD4/OTII T celle aktivering. 12) kontrollere CD4/OTII T celle spredning og differentiering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: knoglemarven isoleret proces fra mus lårben og skinneben. (A) hud indsnit med saks. (B) fjernelse af hud fra lemmer. (C) muskel snit med en saks. (D) fjernelse af muskel fra lemmer med en skalpel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Flow flowcytometri analyse af modningen af GM-CSF BM-afledte DCs. Overfladen udtryk for MHCII, CD80 og CD86 i LPS aktiveret (+ LPS) og ingen-aktiveret (-LP'ER) GM-CSF BM-afledte DCs. tal viser gennemsnitlige fluorescens-intensiteten i arbitrære enheder (a.u.). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: placering af lyskebrok, aksillær, brachialis, livmoderhalskræft og mesenteriallymfeknuderne lymfeknuder og milt i mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: eksperimenterende oprettet for lymfeknude og milt homogenisering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: adoptiv overførsel af CD4/OTII T-celler og OVAp-loaded GM-CSF BM-afledt-DCs. (A) intravenøs injektion af CD4/OTII T-celler i retro-orbital plexus. (B) subkutan injektion af OVAp-loaded GM-CSF BM-afledte DCs i footpad. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: kvantificering af T-celle aktivering in vivo. Flow flowcytometri plots og graf, der viser analyse og kvantificering af membran udtryk for CD69 i CD4 T-celler. CD45.1/CD45.2 mus blev adoptively overførte i.v. med musen CD45.1/CD4/OTII og CD45.1/CD4/OTII celler 24 timer før s.c. adoptiv overførsel af OVAp-loaded GM-CSF BM-afledt-DCs. T celle aktivering blev målt på 2 dage post-DC overførsel ved flowcytometri efter farvning med fluorescerende-mærkede antistoffer til de angivne antigener. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: kvantificering af T celle spredning in vivo. Flow flowcytometri plots og grafer viser analyse og kvantificering af tilbagegang afgørende celle tracer farvestoffet farvning i CD4 T celler. CD45.2 mus blev adoptively overførte i.v. med musen CD45.1/CD4/OTII celler 24 timer før s.c. adoptiv overførsel af OVAp-loaded GM-CSF BM-afledt-DCs. T celleproliferation blev målt på 5 dage post-DC overførsel ved flowcytometri efter farvning med den angivet fluorescerende antistoffer. T-celle spredning kan bestemmes ved at måle procentdelen af prolifererende celler, procentdelen af celler i hver division top, eller ved at tælle antallet af division toppe som vist i graferne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: kvantificering af T-Celledifferentiering mod Th1 fænotype i vivo. Flow flowcytometri plots og grafer viser analyse og kvantificering af procentdelen af IFNγ-udtrykker CD4 T-celler. CD45.2 mus blev adoptively overførte i.v. med musen CD45.1/CD4/OTII celler 24 timer før s.c. adoptiv overførsel af OVAp-loaded GM-CSF BM-afledt-DCs. T Celledifferentiering blev målt til dage post-DC overførsel ved flowcytometri efter farvning med den angivet fluorescerende antistoffer. T-Celledifferentiering mod Th1 fænotype blev fastsat som udtryk for IFNγ celler som en procentdel af samlede CD4 T-celler og fra kun prolifererende CD4 T celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver mulighed for karakterisering af BM-afledte DCs evne til at modulere aktivering, spredning og differentiering af naive CD4 T-celler. Desuden, det kan også bruges til at vurdere modtagelighed af CD4 T-celler til graduering af BM-afledte DCs. Med denne protokol, kan ændringer i disse begivenheder blive målt i vivo.
Afhængigt af hypotese undersøgte kan flere kombinationer af T-celler og DCs bruges. For eksempel kan man analysere konsekvenserne af banker i eller udskære specifikke gener eller effektiviteten af en bestemt stimulus af CD4 T celle aktivering, spredning eller Th1 differentiering. Disse procedurer kan udføres på DCs eller CD4 T celler eller på begge celletyper. Således kan CD4 T celler fra wild-type eller genmodificerede mus kombineres med DCs stammer fra wild-type mus og vice versa.
Denne protokol kan tilpasses til at skelne mellem oprindelsen af de forskellige cellepopulationer ved hjælp af flowcytometri og antistoffer mod CD45.1 og CD45.2. Faktisk, CD45.1/CD45.1 og CD45.2/CD45.2 mus kan bruges, som kilde til nogen af de celletyper, anvendes eller modtagere for adoptiv overførsel i enhver kombination. For eksempel, kan CD4 T-celler fås fra CD45.1/CD45.1/OTII mus CD45.2/CD45.2 mus kan være oprindelsen af BM for DC generation. I dette eksperiment, kan begge celletyper overføres adoptively til CD45.1/CD45.2 mus. Derudover CD4/OTII T celler fra CD45.1/CD45.1 skrive en mus og CD45.2/CD45.2 type to mus kan kombineres i de samme eller forskellige CD45.1/CD45.2 type tre modtagere at sammenligne opførsel af typen en og skrive to CD4 T cellepopulationer i konkurrencen og ikke-konkurrerende betingelser, henholdsvis.
I denne metode beskrives generation af GM-CSF BM-afledte DCs. Men alternative protokoller er tilgængelige for DC modning og differentiering; for eksempel, kan papain bruges i stedet for LP'ER eller fms-relaterede tyrosin kinase 3 ligand (Flt3-L) i stedet for GM-CSF, giver mulighed for undersøgelse af fænotype særskilte DCs evne til at aktivere CD4 T celle adaptive immunitet. Med den samme hensigt, DCs antigen ladning og præsentation kan være direkte isoleret fra mus. Kombinationen af denne protokol med andre9 giver mulighed for manipulation af naive CD4/OTII T-celler af virusinfektion16 før deres adoptiv overførsel til recipient mus. BM kan også transduced med retrovira9 at studere effekten af kontrollerede celle ændringer på DCs før deres brug i protokollen.
Derudover kan denne protokol tilpasses til intravital mikroskopi undersøgelser17 ved hjælp af fluorescerende proteiner-udtrykker celler. For eksempel, kan CD4/OTII mus være krydset med udtryk for normal god landbrugspraksis eller kirsebær mus at opnå normal god landbrugspraksis eller kirsebær/OTII CD4 mus. Disse mus kan derefter bruges som en kilde til CD4 T-celler og kan kombineres med BM-afledte DCs fra at udtrykke kirsebær eller normal god landbrugspraksis mus, som kræves, i vivo eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Vi takker Dr. Simon Bartlett for Dansk redigering. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), af Miguel Servet Program og Fundación Ramón Areces; med samfinansiering fra Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). CNIC er støttet af Ministeriet for økonomi, industri og konkurrenceevne (MEICA) og Pro CNIC Foundation og er en Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF er grundlagt af Fundación Ramón Areces og CNIC, VZG af ISCIII, BHF af Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) og JMG-G af ISCIII Miguel Servet Program og imas12.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
- Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
- Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
- Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
- Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
- Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
- Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
- Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
