Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מצפני ויוו תמים CD4 T התא (תא T) הפעלה, התפשטות, בידול Th1 המושרה על ידי מח העצם GM-CSF (מוניטור)-נגזר תאים דנדריטים (Dc). בנוסף, פרוטוקול זה מתאר בידוד מוניטור ו- T-cell דור DC, DC ו- T-cell העברה המאמצת.
Abstract
כימות של הפעלת תא CD4 T תמימה, התפשטות, בידול T helper 1 (Th1) התאים היא דרך שימושית כדי להעריך את התפקיד שממלאת בתאי T בתגובה חיסונית. פרוטוקול זה מתאר את הבידול במבחנה של מח העצם (מוניטור) אבות כדי להשיג גרנולוציט מקרופאג המושבה-מגרה פקטור (GM-CSF) נגזר-תאים דנדריטים (Dc). הפרוטוקול מתאר גם את ההעברה המאמצת של פפטיד אובלבומין (OVAp)-טעון DCs GM-CSF-derived ותאי CD4 T תמים מן העכברים הטרנסגניים OTII על מנת לנתח את הפעלת ויוו , התפשטות ו Th1 הבידול של תאי CD4 T שהועברו. פרוטוקול זה עוקף המגבלה של גרידא אין ויוו שיטות המוטלים על-ידי חוסר היכולת במיוחד לתמרן או בחר האוכלוסייה תא למד. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר לימודים בסביבת ויוו , וכך להימנע שינויים לגורמים פונקציונלי שעלולות להתרחש במבחנה , לרבות את השפעת סוגי תאים וגורמים אחרים מצאו באיברים ללא פגע. הפרוטוקול הוא כלי שימושי עבור יצירת שינויים ב- DCs ו- T תאים זה לשנות את תגובות מערכת החיסון מסתגלת, פוטנציאל לספק תוצאות חשוב להבין את המקור או את התפתחות מחלות רבים הקשורים החיסון.
Introduction
תאי CD4 T אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים) כגון DCs מגשרים נדרשת חסינות חיידקים פתוגנים1,2בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. באיברי הלימפה ההיקפית, תאי CD4 T מופעלים על הכרה של אנטיגנים ספציפיים שהוצגו על ידי נגמ שים3,4,5. תאי CD4 T מופעל להתרבות, להבדיל לתוך תאי Th ברורים אפקטור ספציפיים הדרושים להתפתחותם של תגובה חיסונית אדפטיבית נכונה6,7. שליטה על תהליכים אלה חיוני לייצור הגנה ראויה מסתגלת שהורג את הפתוגן מבלי לייצר רקמות מזיק נזק8. Th תאים מוגדרים על פי הביטוי או ייצור מולקולות על פני, גורמי שעתוק, ציטוקינים אפקטור ולבצע פונקציות חיוניות ומדויק בתגובה פתוגנים1. תאים של המשנה תא Th1 להביע את T-התערבות של גורם שעתוק של ציטוקין אינטרפרון וγ (IFNγ) ולהשתתף מארח הגנה מפני פתוגנים תאיים1. כימות של הפעלת תא CD4 T תמימה, התפשטות Th1 בידול היא אמצעי שימושי להעריך את משחק התפקידים T תאים, תגובה חיסונית.
ניתוח זה הפרוטוקול מאפשר vivo בתוך לקיבולת של חוץ גופיתבשנוצר BM-derived DCs לווסת את ההפעלה, התפשטות ו Th1 התמיינות של תאי CD4 T נאיביים. הפרוטוקול משמש גם כדי להעריך את היכולת של תאי CD4 T נאיבי להיות מופעל, המושרה כדי להתרבות, Th1 מבודלים (איור 1). פרוטוקול רב-תכליתי זה עוקף חוסר היכולת במיוחד לתמרן או בחר האוכלוסייה תא למדה גרידא אין ויוו בפרוטוקולים. ניתן יהיה ללמוד את ההשפעות של מולקולות שונות וטיפולים על בקרי תחום באמצעות מוניטור עכברים מהונדסים5 או בטיפול או מניפולציה גנטית מוניטור מבודד התאים9. באופן דומה, ניתן לסייר תא T תגובות על ידי קבלת בתאי T להעברת המאמצת ממקורות שונים או לאחר מספר מניפולציות3,8,10.
היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם כפולה. הפעלת תא t התפשטות, בידול Th1 ניתוח בגישה cytometry זרימה; זה בשילוב עם ויוו מחקרים, ובכך הסב שינויים שעלולות להתרחש במבחנה , לרבות סוגי תאים וגורמים אחרים מצאו איברים שלמים11.
השימוש של צבע חיוני היא טכניקה בשימוש נרחב כדי לעקוב אחר התפשטות תאים תוך הימנעות את השימוש רדיואקטיביות. מידת התפשטות עם ריאגנטים אלה מבוסס על דילול צבע לאחר חלוקת התא. יתר על כן, צבעים אלה ניתן להבחין באורכי גל מרובים, מנותחים בקלות על ידי cytometry זרימה בשילוב עם נוגדנים פלורסנט או סמני מרובים. אנחנו להדגיש את התועלת של פרוטוקול זה לפי מראה כיצד הפעלת תא T התפשטות, בידול Th1 ניתן לנתח מאת cytometry זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלים ניסיוני אושרו על-ידי Fundación Centro נאסיונאל דה Investigaciones Cardiovasculares קרלוס השלישי (CNIC), את Autónoma קומונידד דה מדריד בהתאם להנחיות והאירופאים. עכברים התרבית פתוגן מסוים התנאים (SPF) חינם, היו מורדמים על ידי שאיפת פחמן דו-חמצני (CO2).
1. בידוד תאי מח עצם העכבר מ Tibias ועצמות ירך
הערה: המתח העכבר congenic C57BL/6 נושאת ליקוציט דיפרנציאלית הסמן Ptprc, כלל מוכרות כמו CD45.1 או Ly5.1, ואילו פראי-סוג C57BL זנים לשאת אלל Ptprcb , המכונה CD45.2 או Ly5.2. CD45.1 ו- CD45.2 משתנים ניתן לזיהוי על-ידי cytometry זרימה באמצעות נוגדנים. עכברים CD45.1, CD45.2 ו CD45.1/CD45.2 יכול לשמש כמקורות התא או הנמענים להעברת המאמצת, המתיר העקיבה של אוכלוסיות תאים נפרדים על-ידי cytometry זרימה. מעדיפים להשתמש גיל- ועכברים מתאימים-מין זכריים או נקביים מתחת גיל 12 שבועות.
-
הכנת עצמות הירך, Tibias
- המתת חסד עכברים באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים.
- לחטא את הגפיים האחוריות ע י ריסוס על פני חיים עם 70% אתנול.
- להשתמש במספריים סטרילי, מלקחיים, ואזמלי מנתחים. עם איזמל, לעשות חתך בעור ולהסיר את העור מן החלק הדיסטלי של העכבר כולל את העור המכסה את קצות הגפיים האחורי. לקלף את העור סביב שריר עגל נמוך יותר ולהסיר את העור מן הרגליים לחלוטין (איור 2 א, 2 ב).
- להפריד את השריר הארבע ראשי בין עצם הירך באמצעות אזמל. Disarticulate מפרק הירך מבלי לשבור את הראש של עצם הירך. הסר את השרירים בשוקיים באמצעות אזמל (איור 2C, 2D). להפריד בין עצם הירך לבין עצם השוקה מבלי לשבור את קצות העצם.
- שמור את העצמות בצלוחית המכילה 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין במדיום רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 x 1 קרה כקרח.
-
תא בידוד
הערה: כל השלבים הבאים חייב להתבצע תחת ברדס תרבות ועם חומר סטרילי כדי למנוע זיהום.- בצלחת פטרי סטריליות, בזהירות לחתוך את קצוות לקרע, כל עצם עם אזמל.
- לרוקן את העצמות שוב ושוב עם הנפח הכולל של 10 מ"ל של מדיום חם RPMI מלאה (RPMI + 10% FBS, 2 מ מ EDTA, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 20 מ מ HEPES, 55 מיקרומטר מרקפטואתנול, פירובט נתרן 1 מ מ ו- 2 מ מגלוטמין). לרוקן את העצמות משני הכיוונים באמצעות מחט 25 גרם המצורפת מזרק 1 מ"ל.
- להעביר את effluate צינור חרוטי 50 מ ל מצויד במסנן אינטרנט 70 מיקרומטר ניילון. בזהירות לסלק פסולת ותא וקונצרנים על ידי ערבוב עדין ו pipetting.
- Centrifuge התליה תא ב x 250 g 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של מאגר קר פירוק תאי דם אדומים (0.15 מ' NH4קלרנית + 1 מ"מ KHCO3 + 0.1 מ"מ EDTA, מנוכי עונתיות pH עד 7.2 עם HCl N 1, מיקרומטר 0.4 סטרילי מסונן, ומאוחסנים ב 4 ° C). לשמור בקירור למשך 5 דקות עם המדריך רועדת.
- להוסיף 10 מ ל מאגר קר (1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) + 2 מ מ EDTA + 2% אלבומין שור (BSA)) בטל. ולשטוף את המאגר פירוק תאי דם אדומים.
- Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
- לשטוף תאים עם 25 מ ל בינונית RPMI מלאה, צנטריפוגה ב 250 x g למשך 5 דקות ב 4 º C.
- Resuspend התאים 5 מיליליטר בינוני RPMI מלאה. מערבבים 50 µL של התליה תא 1:1 עם trypan blue. לקבוע את מספר הנייד בחדר הספירה תחת מיקרוסקופ. לחשב את מספר הנייד באמצעות הנוסחה: תאים למ"ל = [(ספירת תאים שאינם שהוכתמו/4) x 2 x 10,000]12.
הערה: עצם זה התשואות 40 x 10 בשיטה6 עד 60 x 106 תאים במח לכל 8-12 בת שבוע C57BL/6 העכבר נגוע. - Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
2. DC בידול, ההבשלה וטעינה אנטיגן
-
תא מוניטור קציר
- זרע התרבות מלאה על 6-ובכן נמוך במיוחד-מצורף משטח צלחות-106 תאים לכל מיליליטר בינוני, בדרך כלל ב 5 מ לכל טוב. מקרופאגים הבדיל לצרף התרבות-הצלחות. לאחר 12 שעות, להעביר את תגובת שיקוע, המכיל בעיקר ומונוציטים, לנקות צלחות 6-ובכן, השמטת צלחות 6-ובכן הישן עם המקרופאגים מודבקת.
- לקדם תאית התמיינות, התרבות התאים שאינם מחסידי ב 5 x 10 תאי5 מ ל בדרך כלל 5 מ"ל לכל טוב של בינוני RPMI מלאה המכילה 20 ng/mL מסחרית שהושג רקומביננטי מאתר GM-CSF-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני (CO2), התבונן מדי יום.
- כל 3 ימים, ספין למטה תאים מושעה לאסוף את תאים חסיד עם 5 מ מ EDTA ב- PBS ו ספין למטה. לשלב, resuspend ב 5 x 105 תאים למ"ל בינוני טריים המכילים 20 ng/mL rm-GM-CSF.
- ביום 8, לאסוף תאים חסיד ומנותק כאמור לעיל ו- resuspend-5 x 105 תאים למ"ל בשנת בינוני המכיל 20 ng/mL GM-CSF ו ng/mL 20 ליפופוליסכריד (LPS) במשך 24 שעות ביממה בשאינם תרביות רקמה-מטופלים עקר פטרי, לזירוז גבוהה MHC-II , ביטוי CD80 ו- CD86.
- בידול DC הסימון מאת cytometry זרימה כפי שמצוין בשלב 2.2.
-
בידול Cytometry זרימה וניתוח ההבשלה.
- Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C. חזור על שלב זה פעמיים.
- Fc לחסום קולטנים מאת המקננת בגדר תא resuspended ב העכבר Fc קולטן חוסם הפריטים המוקפצים (מטוהרים אנטי עכבר נוגדן2b אג CD16/CD32) למשך 15 דקות ב 4 ° C לפי הוראות היצרן.
- Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
- עבור כל בדיקה, resuspend 250,000 בתאים µL 300 מאגר cytometry זרימה (1 x PBS + 2 מ מ EDTA + 2% BSA) ב 4 º C.
- להעביר 30 µL של התא פתרון לכל טוב 96-ובכן-צלחת.
- Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
- למחוק את תגובת שיקוע והוסף 30 µL של נוגדן המכיל מאגר כדי כל גם בעקבות האינדיקציות של היצרן. דגירה התאים עם נוגדנים במשך 20 דקות ב 4 º C.
הערה: בדרך כלל המועסקים סמנים עבור בקרי קבוצת מחשבים, ומונוציטים ו מקרופאגים הם CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 ו CD86 (איור 3). - Centrifuge את הדגימות ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 ° C ו resuspend ב µL 200 לאדם טוב של מאגר cytometry זרימה קר המכילה סמן כדי לא לכלול תאים מתים (למשל, propidium יודיד, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) או של צבע אמין-ריאקטיבי )-הריכוז המומלץ של היצרן13.
- צג התמיינות תאים על-ידי העברת הדגימות צינורות cytometry זרימה וביצוע הניתוח cytometry זרימה לא כולל תאים מתים בימים 0, 3, 6 ו- 9.
-
טעינת DC אנטיגן.
- יום 8, centrifuge את הדגימות ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend כדורי במדיום µL 200 (RPMI + 10% FBS ללא אנטיביוטיקה). חזור על שלב זה פעמיים.
- דגירה Dc עם µg/mL 10 OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) לכל עונה 1 פרק 107 DCs ב 1 מ"ל של מדיום (RMPI + 1% FBS) צינור פלסטיק במשך לפחות 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. השתמש DCs שאינם טעונים OVAp כתנאי שליטה שלילי.
- Centrifuge את הדגימות ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend כדורי 200 µL בינוני RPMI מלאה. חזור על שלב זה פעמיים.
- Centrifuge את הדגימות ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend כדורי במדיום µL 200 (RPMI + 10% FBS)-עונה 2 פרק 106 תאים/מ ל....
3. בידוד תאי T CD4 תמים מן OTII עכברים
הערה: שיטה זו מניבה כ 100 x 10 spleenocytes6 לכל 8 נגוע העכבר C57BL/6 בת שבוע 12. הן הזכרים והן הנקבות יכול לשמש. תאי CD4 T ניתן לבודד את הטחול או בלוטות הלימפה; תאי CD4 T חשבון עבור 25% ו- 50% של תאים באיברים אלה, בהתאמה. בצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים.
- לבודד מפשעי בבית השחי, נחתכו, צוואר הרחם, מצע המעי העליון בלוטות הלימפה והטחול מן העכברים הטרנסגניים OTII (איור 4) ומעבירים אותם אל פלסטיק פטרי המכיל 10 מ"ל של מדיום RPMI מלאה.
- לשטוף את מסננת תא 2 מ של מדיום RPMI מלאה ולהסיר אותו מהצינור 50 מ. העברת הלימפה והטחול כדי מסננת תא מיקרומטר 70 הניח צינור 50 מ. Homogenize באמצעות מזרק בוכנה (איור 5) ולהוסיף בינוני עד 15 מ"ל.
- Centrifuge את הדגימות ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend בגדר ב-15 מיליליטר בינוני RPMI מלאה. חזור על שלב זה פעמיים.
- הטחול תא השעיה, resuspend בגדר התא ואת lyse כדוריות דם אדומות כפי שמצוין בשלב 1.2.5.
- Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
- לשטוף תאים עם 25 מ ל בינונית RPMI מלאה, צנטריפוגה ב 250 x g למשך 5 דקות ב- RT.
- Resuspend התאים 5 מ של מדיום. מערבבים 50 µL של התליה תא 1:1 עם Trypan blue. לקבוע את מספר הנייד באמצעות חדר הספירה תחת מיקרוסקופ. לחשב את מספר הנייד באמצעות הנוסחה: תאים למ"ל = [(ספירת תאים שאינם שהוכתמו/4) x 2 x 10,000]12.
- חזור על שלב 2.2.2.
- עקבתי אחרי ההוראות של היצרן, דגירה התאים עם 1:800 דילולים של נוגדנים biotinylated CD8α IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25, DX5 במשך 30 דקות על הקרח מאוחר יותר שלילי לבחירה של תאי CD4 T.
- ההוראות של היצרן, בהתבסס על מספר התאים לבין היכולת של החרוזים, לחשב את הכמות הנדרשת של גרגרי מגנטי מצופה streptavidin בידוד תאי CD4 T באמצעות מפריד תא מגנטי המתאים ההפרדה עמודות.
- Resuspend התאים 5 מיליליטר בינוני RPMI מלאה ולשמור אותם על קרח בזמן ספירת תאים חיים כפי שמתואר בשלב 3.7.
- חלץ 2 x 105 תאים וסמנו את הטוהר של התאים שנאספו באמצעות אנטי CD4, CD3, B220 ו CD8 נוגדנים פלורסנט ב cytometer זרימה באמצעות ממליץ יצרן דילולים נוגדן.
- כתם תאי CD4/OTII T נאיבי מבודד-resuspend 106 תאים במאגר µL 500 (1 x PBS + 2 מ מ EDTA + 2% BSA). הכנת 500 µL המכיל מאגר (1 x PBS + 2 מ מ EDTA + 2% BSA) להכפיל את הריכוז מומלץ היצרן הסופי של התא חיוני מעקב לצבוע. לערבב שני פתרונות על-ידי הוספת לאט הפתרון מעקב תא התליה תא. דגירה את התאים עבור 5 דקות ב 37 º C.
- לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר בינונית RPMI מלאה, צנטריפוגה ב 250 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה פעמיים. Resuspend תאי 1 מ"ל של מדיום RPMI מלאה-עונה 1 פרק 107תאים/מ ל....
4. הפעלת in Vivo , התפשטות, Th1 בידול Assay
הערה: תא חיוני מעקב צבע carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFSE), אחרים succinimidyl מבוסס-אסתר צבעים, אשר שמחים, פולטים קרינה פלואורסצנטית באורכי גל שונים, נמצאים בשימוש נרחב כדי להעריך את התפשטות לימפוציטים על ידי זרימת cytometry שלהם בעוצמה גבוהה פלורסצנטיות, חיים ארוכים, השתנות נמוך וכתוצאה רעילות נמוכה14.
- Adoptively להעביר דרך הווריד (עירוי) עונה 1 פרק 106 התא חיוני בשידור חי מעקב תמים שהוכתמו לצבוע T CD4/OTII בתאים µL 100 ל- PBS לכל העכבר. תאי T עם תוויות יכול להיות הועבר adoptively על-ידי וריד הזנב או רטרו-מסלולית הזרקת15; בשני המקרים, התאים בית לאיברים הלימפה (איור 6A).
- אתגר העכברים הנמען יום אחד מאוחר יותר על ידי העברת adoptively 100,000 התבגר-LPS טעונים OVAp DCs בזריקה תת עורית (ס. י) ב- footpads (איור 6B).
- הקציר popliteal הלימפה עכברים הנמען ולעבד אותם עד הקניית המתלים תא בודד ביצוע הפעולות המתוארות כאמור 3.1 ו- 3.2. לעשות זאת על חיסונים שלאחר יום 2 כדי למדוד את הפעלת תא T CD4/OTII ועל יום 5 כדי למדוד את התפשטות פלוס Th1 בידול.
- כדי לנתח את תא T הפעלה ביום 2, כתם תאים עם פלורסנט נוגדנים נגד CD4, CD69 ו CD25 (לחלופין CD45.1 ו- CD45.2), לקבוע את אחוזי C69+CD25+ T תאים באוכלוסיה CD4. ניתוח על ידי cytometry זרימה (איור 7).
- כדי לבדוק את תא T התפשטות ביום 5, כתם תאים באמצעות נוגדנים פלורסנט המתאים CD4, ובמידת CD45.1, CD45.2. לנתח את הדעיכה של האות לצבוע תא חיוני מעקב באוכלוסייה CD4 ידי cytometry זרימה (איור 8). מספר פרמטרים יכול להיקבע במחקרים אלה, כגון מספר חלוקות תאים עברה על ידי תאים בלוחיות לצבוע מעקב תא חיוני האחוז של תאים שיחצה כל שיא פלורסצנטיות, אחוז התאים החלוקה בתא סכום אוכלוסייה.
- כדי לקבוע Th1 בידול ביום 5, צלחת תאים 400,000 לכל טוב של צלחת 96-ובכן ב- 200 µL בינוני RPMI מלאה המכילה 1 מיקרומטר ionomycin ו 10 ננוגרם למ"ל phorbol 12 פעילים 13 אצטט (PMA) עבור 6-אייץ ' ב 37 מעלות צלזיוס בחממה. במשך 4 שעות האחרונות, להוסיף 3 – 10 µg/mL brefeldin כדי לחסום את הפרשת ציטוקינים למדיום.
- Centrifuge הלוחות עבור 5 דקות ב x 250 g ב- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע על-ידי היפוך מהיר של צלחת 96-ובכן.
- חזור על שלב 2.2.2.
- כתם קרום התא על ידי המקננת למשך 15 דקות ב 4 ° C ב- 30 µL מאגר (1 x PBS + 2 מ מ EDTA + 2% BSA) המכיל נוגדנים ל CD4 ולבחירתך גם CD45.1, CD45.2-דילולים יצרן-מומלץ. לשטוף את התאים על-ידי הוספת µL 150 מאגר (1 x PBS + 2 מ מ EDTA + 2% BSA), centrifuge את הצלחות במשך 5 דקות ב x 250 g ב 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע.
- לתקן התאים על-ידי הוספת µL 100 של paraformaldehyde/1% 2% סוכרוז למשך 20 דקות ב- RT. צנטריפוגה הלוחות עבור 5 דקות ב x 1000 g ו- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע.
- Permeabilize בתאים על-ידי הוספת µL 50 permeabilization תאיים מאגר (1 x PBS + 0.1% BSA, 0.01 M HEPES, סאפונין 0.3%) ואת תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C.
- להוסיף 150 µL של PBS, צנטריפוגה עבור 5 דקות בכל 1,000 x g ב- RT. להשליך תגובת שיקוע.
- כתם ציטוקינים תאיים על-ידי הוספת 30 µL של fluorophore-מצומדת אנטי-נוגדן IFNγ במאגר (PBS + 0.1% סאפונין) ואת תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT.
- לשטוף את התאים על-ידי הוספת µL 150 מאגר (PBS + 0.1% סאפונין). Centrifuge הלוחות עבור 5 דקות ב x 1000 g ב- RT וזורקים את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעמיים.
- לנתח אוכלוסיות תאים על-ידי cytometry זרימה (איור 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מדגימה את השלבים המתוארים פרוטוקול זה. איור 2 מדגים את הבידוד והתרבות של העכבר מוניטור תאים. התוספת של GM-CSF ו LPS לתרבויות אלה מאפשר הדור במבחנה , ההבשלה של בקרי תחום. איור 3 מדגימה ניתוח cytometry זרימה של בידול ועם בגרות שהושג שנטענו DCs-OVAp GM-CSF BM-derived בקרי התחום התא חיוני מבודד מעקב שהוכתמו לצבוע בתאי T CD4/OTII הועבר הם adoptively לעכברים. איור 4 מראה את המיקום של בלוטות הלימפה המשמש את ניתוקה של תאי T CD4/OTII. איור 5 מראה שפופרת 50 מ ל מצויד במסנן ניילון מיקרומטר 70 ופומפה מזרק נהגה homogenize את הלימפה והטחול. איור 6 מראה הזרקת עירוי של תאי T CD4/OTII לתוך מקלעת רטרו-מסלולית הזריקה ספורטינג טעונים OVAp GM-CSF BM-derived בקרי התחום לתוך לו טביעות רגל. תאי T CD4/OTII להפיץ הלימפה לאיברים שונים, ואילו GM-CSF DCs להגר בלוטות הלימפה popliteal איפה GM-CSF DCs להפעיל תאי T CD4/OTII תמים על-ידי המצגת של OVAp. לאחר מכן, תאי T CD4/OTII תמים להתרבות, להבדיל לכיוון פנוטיפ Th1. איור 7 מדגים את כימות של תמים הפעלת תא T CD4/OTII מניתוח של הממברנה CD69 ו CD25 ביטוי. איור 8 מראה כימות של התפשטות תאים T CD4/OTII. איור 9 מדגים כימות של T CD4/OTII תאית התמיינות לכיוון פנוטיפ Th1.
איור 1: ערכת הפרוטוקול. 1) לבודד תאים מוניטור עצמות הירך עכבר ו- tibias. מוניטור 2) התרבות תאים עם GM-CSF ליצירת מוניטור GM-CSF נגזר-Dc-3) בידול הסימון DC ובוגרת GM-CSF מוניטור נגזר-DCs עם LPS. 4) בדוק DC ההבשלה. 5) לטעון DCs עם OVAp. 6) תאי T CD4/OTII ולבודד בצורת עכבר הטחול. 7) כתם בתאי T CD4/OTII עם צבע מעקב תא חיוני. 8) בדיקת טוהר בידוד תא חיוני מעקב צבע צביעת תאי T CD4/OTII מבודדים. 9) adoptively העברה מבודד עירוי תאים T CD4/OTII עכברים הנמען. 10). adoptively להעביר ספורטינג DCs טעון-OVAp והוא התבגר עכברים הנמען. 11) בדוק הפעלת תא T CD4/OTII. 12) לבדוק התפשטות תא T CD4/OTII ובידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: מח עצם בתהליך בידוד עצמות הירך העכבר, tibias. (א) העור החתך עם מספריים. (B) הסרה של עור של האיבר. (ג) שריר החתך עם מספריים. (ד) הסרה של השריר מן האיבר עם אזמל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Flow cytometry ניתוח של ההבשלה של GM-CSF BM-derived DCs- הביטוי של MHCII, CD80 CD86 LPS מופעל (+ LPS) על פני השטח, שלא הופעל (-LPS) נגזר GM-CSF מוניטור DCs. מספרים מראים את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע ביחידות שרירותי (א"א). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מיקום בלוטות לימפה במפשעה, בבית השחי, נחתכו, צוואר הרחם, מצע המעי העליון ואת הטחול בעכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: ניסיוני הגדרת הצומת לימפה, הטחול המגון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: העברה המאמצת של תאי T CD4/OTII ו- GM טעונים OVAp-CSF BM-נגזר-DCs- (א) לעירוי הזרקה של תאי T CD4/OTII לתוך מקלעת רטרו-מסלולית. (B) בזריקה תת עורית OVAp טעון בדרור GM-CSF BM-derived לתוך לו טביעות רגל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: כימות של תא T הפעלה vivo ב. לזרום cytometry חלקות, גרף המציג את הניתוח ואת כימות של הביטוי הממברנה של CD69 בתאי CD4 T. עכברים CD45.1/CD45.2 היו עירוי הועבר adoptively עם העכבר CD45.1/CD4/OTII ותאים CD45.1/CD4/OTII 24 שעות לפני העברת המאמצת ספורטינג טעונים OVAp GM-CSF BM-נגזר-DCs. T לתא ההפעלה נמדדה ב 2 ימים פוסט-DC העברה על ידי cytometry זרימה לאחר צביעת עם פלורסנט מתויג נוגדנים אנטיגנים המצוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: כימות של תא T התפשטות vivo ב. לזרום cytometry חלקות וגרפים מציג ניתוח של כימות של ירידה התא חיוני מעקב לצבוע מכתים בתאי CD4 T מתרבים. עכברים CD45.2 היו עירוי הועבר adoptively עם העכבר CD45.1/CD4/OTII תאים 24 שעות לפני העברת המאמצת ספורטינג טעונים OVAp GM-CSF BM-נגזר-DCs. T התפשטות תאים נמדדה ב 5 ימים פוסט-DC העברה על ידי cytometry זרימה לאחר צביעת עם הצביעו על נוגדנים פלורסנט. תא t התפשטות יכול להיקבע על ידי מדידת אחוז תאים מתרבים, האחוז של תאים בשיא כל חלוקה, או על ידי ספירת מספר חטיבת פסגות כמוצג בגרפים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9: כימות של בידול תא T לכיוון Th1 פנוטיפ ויוו. מגרשים cytometry זרימה, גרפים המראים את הניתוח ואת כימות של האחוז של תאי T CD4 לבטא IFNγ. עכברים CD45.2 היו עירוי הועבר adoptively עם העכבר CD45.1/CD4/OTII תאים 24 שעות לפני העברת המאמצת ספורטינג טעונים OVAp GM-CSF BM-נגזר-DCs. T תאית התמיינות נמדדה ב ימים פוסט-DC העברה על ידי cytometry זרימה לאחר צביעת עם הצביעו על נוגדנים פלורסנט. תא t בידול לכיוון פנוטיפ Th1 נקבע כתאים IFNγ-ביטוי כאחוז של תאי CD4 T הכולל וממנו רק תאי CD4 T proliferating. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מאפשר אפיון הקיבולת של מוניטור-derived DCs לווסת את ההפעלה, התפשטות, התמיינות של תאי CD4 T נאיביים. יתר על כן, זה יכול לשמש גם כדי להעריך את הרגישות של תאי CD4 T מודולציה על-ידי בקרי נגזר מוניטור. עם פרוטוקול זה, שינויים באירועים אלה יכולים להיות נמדד ויוו.
בהתאם ההשערה תחת חקירה, ניתן להשתמש במספר שילובים של תאי T ו- DCs. לדוגמה, אחד ניתן לנתח את ההשלכות של דופק או לדפוק גנים ספציפיים או את היעילות של גירוי ספציפי של הפעלת תא CD4 T, התפשטות או בידול Th1. ניתן לבצע הליכים אלה Dc או CD4 T התאים או על שני סוגי תאים. לפיכך, ניתן לשלב בתאי CD4 T מפראי-סוג או מהונדס גנטית עכברים DCs נגזר מפראי-סוג עכברים ולהיפך.
פרוטוקול זה ניתן להתאים כדי להבחין בין המקור של אוכלוסיות תאים שונים באמצעות cytometry זרימה של נוגדנים נגד CD45.1 ו- CD45.2. אכן, עכברים CD45.1/CD45.1 ו- CD45.2/CD45.2 יכול לשמש כמקור של כל אחד מסוגי התאים המשמש או הנמענים להעברת המאמצים בכל צירוף. לדוגמה, בתאי CD4 T ניתן להשיג CD45.1/CD45.1/OTII עכברים בעוד עכברים CD45.2/CD45.2 יכול להיות המקור של מוניטור לדור DC. בניסוי זה, שני סוגי תאים יכולים להיות הועבר adoptively CD45.1/CD45.2 לעכברים. יתר על כן, תאי T CD4/OTII מ- CD45.1/CD45.1 הקלד אחת עכברים, CD45.2/CD45.2 סוג שני עכברים, ניתן לשלב הנמענים סוג 3 זהים או שונים של CD45.1/CD45.2, כדי להשוות את ההתנהגות של סוג אחד, הקלד שתי אוכלוסיות תאים CD4 T בתחרות קשה, בלתי מתחרים תנאים, בהתאמה.
שיטה זו מתארת את הדור של GM-CSF BM-derived DCs. עם זאת, פרוטוקולים חלופיים זמינים עבור DC ההבשלה ובידול; לדוגמה, ניתן להשתמש פפאין במקום LPS או הקשורים ל- fms טירוזין קינאז 3 ליגנד (Flt3-L) במקום GM-CSF, המאפשר לימוד של הקיבולת של Dc phenotypically ברורים להפעלת תא CD4 T חסינות מסתגלת. עם אותה כוונה, DCs אנטיגן וטעינה של המצגת יכול להיות מבודד ישירות מן העכברים. שילוב של פרוטוקול זה עם אחרים9 מאפשר המניפולציה של תמים בתאי T CD4/OTII על ידי זיהום ויראלי16 לפני העברתם המאמצת עכברים הנמען. מוניטור יכול להיות transduced גם עם רטרווירוסים9 כדי לחקור את ההשפעה של שינויים התא מבוקרת על בקרי תחום לפני השימוש בפרוטוקול.
בנוסף, פרוטוקול זה ניתן להתאים intravital מיקרוסקופיית לימודים17 באמצעות תאים המבטאים חלבונים פלורסנט. לדוגמה, ניתן חצה CD4/OTII עכברים עם GFP - או דובדבן-הבעת עכברים להשיג עכברים GFP או דובדבן/OTII CD4. עכברים אלה יכול לשמש כמקור של תאי CD4 T, יכול להיות משולב עם מוניטור-derived DCs של עכברים דובדבן - או GFP-לבטא, כנדרש, ניסויים ויוו .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף
Acknowledgments
אנו מודים ד ר סיימון ברטלט לצורך עריכה באנגלית. מחקר זה נתמך על ידי מענקים אינסטיטוטו דה סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), ושל מיגל Servet התוכנית Fundación רמון Areces; עם השתתפות במימון של הועדה המחוזית Fondo Europeo דה Desarrollo (פדר). CNIC נתמך על ידי משרד הכלכלה, התעשייה, תחרותיות (MEIC), קרן CNIC Pro, Severo אוצ'ואה התמחות (SEV-2015-0505). RTF היא נוסדה על ידי Fundación רמון Areces, CNIC, VZG על ידי ISCIII, BHF על ידי דה אינסטיטוטו Investigación Sanitaria חולים 12 דה אוקטוברה (imas12) ו- jmg ב- G על ידי תוכנית Servet של מיגל ISCIII imas12.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
- Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
- Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
- Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
- Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
- Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
- Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
- Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
