Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação na vivo da ativação de células (células T) de T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pela medula óssea de GM-CSF (BM)-derivado de células dendríticas (DCs). Além disso, este protocolo descreve isolamento BM e células T, geração de DC e DC e células T transferência adotiva.
Abstract
Quantificação da ativação de células T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de T helper 1 (Th1) células é uma maneira útil para avaliar o papel desempenhado pelas células T em uma resposta imune. Este protocolo descreve a diferenciação em vitro dos progenitores da medula óssea (BM) para obter granulócitos macrófagos colônia-estimulando factor (GM-CSF) derivado-células dendríticas (DCs). O protocolo descreve também a transferência adotiva de peptídeos ovalbumina (OVAp)-carregado DCs GM-CSF-derivados e as células T CD4 do ingênuo de ratos transgénicos OTII a fim de analisar na vivo ativação, proliferação e diferenciação de células Th1 do transferidas as células T CD4. Este protocolo contorna a limitação de puramente na vivo métodos impostas pela incapacidade de manipular ou selecione população celular estudado especificamente. Além disso, este protocolo permite que estudos em um ambiente em vivo , evitando assim alterações funcionais fatores que podem ocorrer em vitro e inclusive a influência dos tipos de células e outros fatores encontrados somente em órgãos intactos. O protocolo é uma ferramenta útil para gerar mudanças em DCs e T células que modificar adaptáveis respostas imunes, potencialmente, fornecendo resultados importantes para compreender a origem ou o desenvolvimento de inúmeras doenças associadas imunes.
Introduction
Células T CD4 e apresentadoras de antígenos (APCs) de células como DCs são necessários mediadores da imunidade a patógenos microbianos1,2. Nos órgãos linfoides secundários, as células T CD4 são ativadas mediante reconhecimento de antígenos específicos apresentados por APCs3,4,5. Células CD4 T ativadas proliferaram e diferenciarem em células de Th effector específicos distintos que são necessárias para o desenvolvimento de uma correta resposta imune adaptativa6,7. Controle desses processos é fundamental para produzir uma defesa adequada adaptável que mata o patógeno sem produzir dano de tecido prejudicial8. Células th são definidas de acordo com a expressão ou a produção de moléculas de superfície, fatores de transcrição e citocinas efetoras e executam funções essenciais e precisas em resposta a agentes patogénicos1. Células do subconjunto de células Th1 expressam o fator de transcrição T-aposta e a citocinas interferon γ (relato) e participarem na defesa do hospedeiro contra patógenos intracelulares1. Quantificação da ativação de células T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de células Th1 é um meio útil de avaliar a T células dramatização em uma resposta imune.
Este protocolo permite que vivo em análise da capacidade de in vitro -gerado DCs BM-derivado de modular o ativação, proliferação e diferenciação de Th1 de células T CD4 de ingênuo. O protocolo também serve para avaliar a capacidade das células T CD4 de ingênuo para ser ativado, induzidas a proliferar e Th1 diferenciadas (Figura 1). Este protocolo versátil contorna a incapacidade especificamente manipular ou selecione população celular estudados em puramente na vivo protocolos. Os efeitos de diversas moléculas e tratamentos em controladores de domínio podem ser estudados usando BM de camundongos geneticamente modificados5 ou tratar ou manipular geneticamente isolados de células BM9. Da mesma forma, respostas de células T podem ser exploradas através da obtenção de células T para transferência adotiva de diferentes fontes ou após várias manipulações3,8,10.
As principais vantagens do presente protocolo são dupla. Ativação de célula t, proliferação e diferenciação de células Th1 são analisados com uma abordagem de citometria de fluxo; e isto é combinado com estudos em vivo , evitando, assim, alterações que podem ocorrer em vitro , incluindo tipos de células e outros fatores encontrados somente em órgãos intactos11.
O uso de corantes vitais é uma técnica amplamente utilizada para controlar a proliferação celular, evitando o uso da radioactividade. A medida da proliferação com estes reagentes baseia-se na diluição do corante após a divisão celular. Além disso, esses corantes podem ser detectados em vários comprimentos de onda e são facilmente analisadas por citometria de fluxo em combinação com vários anticorpos fluorescentes ou marcadores. Destacamos a utilidade do presente protocolo, mostrando como a ativação de célula T, proliferação e diferenciação de células Th1 podem ser analisados por citometria de fluxo.
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Protocol
Procedimentos experimentais foram aprovados pela Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) e da Comunidad Autónoma de Madrid, em conformidade com diretrizes de espanhol e europeus. Os ratos foram criados em condições (SPF) livre de patógeno específico e foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono (CO2).
1. isolamento de células de medula óssea de rato de tíbias e fêmures
Nota: A cepa de rato C57BL/6 congenic carrega o diferencial de leucócitos marcador Ptprcum, geralmente reconhecido como CD45.1 ou Ly5.1, Considerando que estirpes de tipo selvagem C57BL portadores do alelo Ptprcb , conhecido como CD45.2 ou Ly5.2. Variantes cd45.1 e CD45.2 podem ser distinguidas por citometria de fluxo, usando anticorpos. Ratos cd45.1, CD45.2 e CD45.1/CD45.2 podem ser usados como fontes de célula ou como destinatários para transferência adotiva, permitindo o rastreamento das populações distintas de células por citometria de fluxo. Utilizar preferencialmente idade- e correspondência sexo masculinos ou femininos de ratos abaixo de 12 semanas de idade.
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Preparação dos fêmures e tíbias
- Eutanásia em ratos usando o protocolo aprovado pelo Comitê institucional cuidados com animais.
- Desinfecte os membros traseiros pulverizando a superfície animal com etanol a 70%.
- Uso de bisturis, pinças e tesoura esterilizada. Com um bisturi, fazer um corte na pele e remover a pele da parte distal do mouse incluindo a pele que cobre as extremidades posteriores. Tirar a pele ao redor do músculo da panturrilha inferior e retire a pele das pernas totalmente (Figura 2A, 2B).
- Separe o músculo quadríceps do fémur utilizando um bisturi. Desarticular a articulação do quadril sem quebrar a cabeça do fêmur. Remova os músculos da tíbia usando um bisturi (Figura 2, 2D). Separe o fêmur a tíbia sem quebrar as extremidades do osso.
- Manter os ossos em uma placa de Petri contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina no meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x gelada.
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Isolamento de célula
Nota: Todas as etapas subsequentes devem ser realizadas sob uma capa de cultura e com material estéril para evitar contaminação.- Em uma placa de Petri estéril, cuidadosamente, corte fora as extremidades proximais e distais de cada osso com um bisturi.
- Lave os ossos repetidamente com um volume total de 10 mL de quente meio RPMI completo (RPMI + 10% FBS, 2 mM EDTA, 1% penicilina/estreptomicina, 20 mM HEPES, 55 µM 2-Mercaptoetanol, piruvato de sódio 1 mM e 2 mM L-glutamina). Limpe os ossos de ambas as extremidades, usando uma agulha 25g anexada a uma seringa de 1 mL.
- Transferi o effluate para um tubo cônico de 50 mL, equipado com um filtro de web de nylon 70 do µm. Cuidadosamente, desalojar conglomerados de detritos e célula por agitação suave e pipetagem.
- Centrifugar a suspensão de célula 250 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT).
- Ressuspender as células em 1 mL de tampão de lise de eritrócitos-sangue frio (0,15 M NH4Cl + 1mm KHCO3 + 0,1 mM EDTA, pH ajustado a 7.2 com 1 N HCl, 0,4 µm estéril, filtrada e armazenadas a 4 ° C). Manter-se no gelo por 5 min com agitação manual.
- Adicione 10 mL de tampão frio (1 x salina tamponada fosfato (PBS) + 2 mM EDTA + 2% albumina de soro bovino (BSA)) para inativar e desbotar a Lise-glóbulos vermelhos.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C.
- Lavam-se células com 25 mL de meio RPMI completo e centrifugar 250 x g por 5 min a 4 ° C.
- Ressuspender as células em 5 mL de meio RPMI completo. Mix 50 µ l de suspensão de célula 1:1 com trypan azul. Determine o número de células em uma câmara de contagem ao microscópio. Calcular o número de células usando a fórmula: células/mL = [(célula não manchadas de contagem/4) x 2 x 10.000]12.
Nota: Este método produz 40 x 106 a 60 x 106 óssea de células de medula por 8 não infectados ao rato de C57BL/6 12 semanas de idade. - Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C.
2. DC diferenciação, maturação e carregamento de antígeno
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Célula de BM colheita
- As sementes da cultura completa em placas de superfície 6-poços ultra-low-fixação em 106 células por mL de meio, normalmente em 5 mL por bem. Os macrófagos diferenciados irão anexar para as placas de cultura. Depois de 12 h, transferi o sobrenadante, que contém principalmente monócitos, para limpar as placas 6-poço, descartando as placas 6-poços antigas com os macrófagos aderidas.
- Para promover a diferenciação celular, cultura das células não-aderentes em 5 x 105 células por mL em tipicamente 5 mL por alvéolo de meio RPMI completo contendo 20 ng/mL obtidos comercialmente recombinante murino GM-CSF em 37 ° C e 5% de dióxido de carbono (CO2) e Observe-se diariamente.
- Cada 3 dias, spin para baixo de células suspensas e coletar as células aderentes com 5 mM de EDTA em PBS e spin para baixo. Combinar e ressuspender em 5 x 105 células/mL de meio fresco contendo 20 ng/mL rm-GM-CSF.
- No dia 8, coletar células aderentes e destacadas como acima e ressuspender em 5 x 105 células/mL em média com 20 ng/mL GM-CSF e 20 lipopolissacarídeo ng/mL (LPS) para 24 h em uma cultura de tecidos não-tratados Petri estéril, para induzir a alta MHC-II , Expressão de CD80 e CD86.
- Diferenciação de seleção DC por citometria de fluxo, conforme indicado no passo 2.2.
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Diferenciação de citometria de fluxo e análise de maturação.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C. Repita duas vezes.
- Receptores Fc bloco incubando o centrifugado ressuspensão em rato Fc receptor bloqueador (purificada anti anticorpo de2b CD16/CD32 IgG de rato) por 15 min a 4 ° C, de acordo com as instruções do fabricante.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C.
- Para cada teste, resuspenda 250.000 células em 300 µ l de tampão de citometria de fluxo (1X PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) a 4 ° C.
- Transferi 30 µ l de solução de célula por alvéolo para uma 96--placa.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C.
- Desprezar o sobrenadante e adicionar 30 µ l de contendo anticorpos buffer para cada bem seguindo as indicações do fabricante. Incubar as células com anticorpos por 20 min a 4 ° C.
Nota: Normalmente utilizados marcadores para DCs, monócitos e macrófagos são CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 e CD86 (Figura 3). - Centrifugar as amostras a 250 x g por 5 min a 4 ° C e Resuspenda em 200 µ l por alvéolo do buffer de citometria de fluxo frio contendo um marcador para excluir células mortas (por exemplo, o iodeto de propidium, ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ou um corante reativo-amina ) no concentração recomendada13 do fabricante.
- Monitorar a diferenciação celular, transferindo as amostras para tubos de citometria de fluxo e realizar a análise de citometria de fluxo excluindo células mortas nos dias 0, 3, 6 e 9.
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Carregamento de antígeno de DC.
- No dia 8, Centrifugar as amostras a 250 x g por 5 min a 4 ° C e ressuspender as bolinhas no meio de 200 µ l (RPMI + 10% FBS sem antibióticos). Repita duas vezes.
- Incubar as DCs com 10 µ g/mL OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) por 1 x 107 DCs em 1 mL de meio (RMPI + 1% FBS) em um tubo de plástico pelo menos 30 min a 37 ° C. Use o DCs OVAp não-carregado como uma condição de controle negativo.
- Centrifugar as amostras a 250 x g por 5 min a 4 ° C e Resuspenda as pelotas em 200 µ l RPMI o meio completo. Repita duas vezes.
- Centrifugar as amostras a 250 x g por 5 min a 4 ° C e ressuspender as bolinhas no meio de 200 µ l (RPMI + 10% FBS) 2 x 106 células/ml.
3. isolamento de células T Naïve CD4 OTII ratos
Nota: Este método produz aproximadamente 100 x 106 spleenocytes por 8 não infectados ao rato de C57BL/6 12 semanas de idade. Machos e fêmeas podem ser usadas. Células T CD4 podem ser isoladas de baço ou gânglios linfáticos; Células T CD4 representam cerca de 25% e 50% das células nesses órgãos, respectivamente. Execute as seguintes etapas em condições estéreis.
- Isolar o inguinais, axilares, braquiais, cervicais e mesentéricos linfonodos e baço de ratos transgénicos OTII (Figura 4) e transferi-los para uma placa de Petri contendo 10 mL de meio RPMI completo de plástico.
- Lave o filtro de célula com 2 mL de meio RPMI completo e retire o tubo de 50 mL. Transferência de linfonodos e baço de um coador de célula de 70 µm colocados em um tubo de 50 mL. Homogeneizar usando um êmbolo da seringa (Figura 5) e adicionar médio de 15 mL.
- Centrifugar as amostras a 250 x g por 5 min a 4 ° C e resuspenda o pellet em 15 mL de meio RPMI completo. Repita duas vezes.
- Para suspensão de células de baço, resuspenda o pellet de células e lisar os glóbulos vermelhos, como indicado no passo 1.2.5.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C.
- Lavam-se células com 25 mL de meio RPMI completo e centrifugar 250 x g por 5 min à RT
- Ressuspender as células em 5 mL de meio. Mix 50 µ l de suspensão de célula 1:1 com Trypan azul. Determine o número de células utilizando uma câmara de contagem ao microscópio. Calcular o número de células usando a fórmula: células/mL = [(célula não manchadas de contagem/4) x 2 x 10.000]12.
- Repita a etapa 2.2.2.
- Seguindo as instruções do fabricante, Incube as celulas com diluições de 1:800 de anticorpos biotinilado CD8α IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 e DX5 para 30 min no gelo para mais tarde uma seleção negativa de linfócitos T CD4.
- Seguindo as instruções do fabricante e com base no número de células e a capacidade dos grânulos, calcular a quantidade necessária de microbeads magnéticos streptavidin-revestido e isolar as células T CD4, usando um separador magnético da célula e o adequado colunas de separação.
- Ressuspender as células em 5 mL de meio RPMI completo e mantê-los no gelo durante a contagem de células vivas como descrito na etapa 3.7.
- Extrair a 2 x 105 células e verificar a pureza das células coletadas usando anti-CD4 e CD8 CD3, B220 anticorpos fluorescentes em um citômetro de fluxo usando diluições de anticorpo fabricante-recomendando.
- Para manchar as pilhas de T de CD4/OTII isolado ingênuo, resuspenda 106 células no buffer de 500 µ l (1X PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA). Preparar 500 µ l de tampão (1X PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) contendo duas vezes a concentração final de fabricante-recomendado de corante marcador de célula vital. Misture as duas soluções adicionando lentamente a solução de rastreamento de celular para a suspensão de eritrócitos. Incube as celulas por 5 min a 37 ° C.
- Lavar as células com 5 mL de meio RPMI completo e centrifugar 250 x g por 5 min a 4 ° C. Repita duas vezes. Ressuspender as células em 1 mL de meio RPMI completo a 1 x 107células/mL.
4. in Vivo a ativação, proliferação e ensaio de diferenciação de células Th1
Nota: O célula vital traçador corante carboxyfluorescein diacetato succinimidil éster (CFSE) e outros succinimidil éster-baseado corantes, que são excitados e emitem fluorescência em diferentes comprimentos de onda, são amplamente utilizados para avaliar a proliferação de linfócitos pelo fluxo citometria devido a sua intensidade de fluorescência de alta, longa vida, baixa variabilidade e baixa toxicidade14.
- Enviaram transferi por via intravenosa (i.v.) 1 x 106 célula viva vital traçador ingênuo manchadas de tinta CD4/OTII as células T em 100 µ l de PBS por rato. Rotulado de células T podem ser transferidas enviaram pela veia da cauda ou injeção retro-orbital15; em ambos os casos, as células vão em casa para órgãos linfoides (figura 6A).
- Desafie os ratos destinatários um dia mais tarde enviaram Transferindo 100.000 LPS envelhecido carregado OVAp DCs por via subcutânea (s.i.) dos footpads (Figura 6B).
- Colheita de linfonodos poplíteos de ratos destinatários e processá-los até a obtenção de suspensões de célula única, seguindo as mesmas etapas, conforme descritas em 3.1 e 3.2. Fazer isso no pós-imunização de dia 2 para medir a ativação de células T CD4/OTII e no dia 5 para medir a proliferação e diferenciação de células Th1.
- Para analisar a ativação de células T no dia 2, mancha células com anticorpos fluorescentes contra CD4, CD25 e CD69 (opcionalmente, CD45.1 e CD45.2) e determinar a porcentagem de C69+CD25+ T células na população CD4. Análise por citometria de fluxo (Figura 7).
- Para verificar a proliferação de células T no dia 5, mancha de células usando anticorpos fluorescentes apropriados contra CD4 e, opcionalmente, CD45.1 e CD45.2. Analise a decadência do sinal vital célula traçador corante na população CD4 por citometria de fluxo (Figura 8). Vários parâmetros podem ser determinados nestes estudos, tais como o número de divisões celulares sofrido pelas células marcadas com o corante marcador de célula vital, a percentagem de células divisórias em cada pico de fluorescência e a percentagem de células divisórias na célula total população.
- Para determinar a diferenciação de células Th1 no dia 5, 400.000 células de placa por alvéolo de uma placa de 96 poços em 200 µ l de meio RPMI completo contendo 1 ionomycin µM e 10 ng/mL phorbol 12 myristate 13 acetato (PMA) para 6 h a 37 ° C na incubadora. Para a última 4 h, adicione 3 – 10 µ g/mL brefeldin A para bloquear a secreção de citocinas ao meio.
- Centrifugar as placas durante 5 min à 250 x g a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante por inversão rápida da placa de 96 poços.
- Repita a etapa 2.2.2.
- Manche as membranas celulares incubando por 15 min a 4 ° C em 30 µ l de tampão (1X PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) que contém os anticorpos para CD4 e, opcionalmente, CD45.1 e CD45.2 em diluições recomendadas fabricante. Lavar as células adicionando 150 µ l de tampão (1X PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) e centrifugar as placas durante 5 min à 250 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
- Corrigir as células adicionando-se 100 µ l de paraformaldehyde/1% 2% sacarose por 20 min no centrifugador do RT. as placas por 5 min a 1.000 x g e 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
- Permeabilize as células pela adição de 50 µ l de tampão de permeabilização intracelular (1X PBS + 0,1% BSA, 0,01 M HEPES, 0,3% saponina) e incube por 30 min a 4 ° C.
- Adicione 150 µ l de PBS e centrifugar por 5 min a 1.000 x g em RT. descartar o sobrenadante.
- Mancha de citocinas intracelulares adicionando 30 µ l de conjugado anti anticorpo relato fluoróforo no buffer (PBS + 0,1% saponina) e incube por 30 min em RT
- Lave as células adicionando 150 µ l de tampão (PBS + 0,1% saponina). Centrifugar as placas durante 5 min à 1.000 x g em RT e descartar o sobrenadante. Repita duas vezes.
- Analise as populações de células por citometria de fluxo (Figura 8).
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Representative Results
A Figura 1 ilustra as etapas descritas neste protocolo. A Figura 2 ilustra o isolamento e a cultura de células de rato BM. A adição de GM-CSF e LPS para essas culturas permite a geração em vitro e maturação de DCs. a Figura 3 ilustra a análise de citometria de fluxo da diferenciação e maturação de obtidos DCs DCs. OVAp-carregado derivado de GM-CSF BM e célula vital isolado rastreamento manchadas de tinta T CD4/OTII células enviaram são transferidas para os ratos. A Figura 4 mostra a localização dos gânglios linfáticos utilizados para o isolamento de células T CD4/OTII. A Figura 5 mostra um tubo de 50 mL, equipado com o filtro de nylon 70 µm e um êmbolo da seringa usada para homogeneizar os linfonodos e baço. A Figura 6 mostra a injeção de soro das células T CD4/OTII no plexo retrô-orbital e a injeção de s.c. dos DCs de GM-CSF BM-derivado OVAp-carregado para o Whitney. Células T CD4/OTII distribuem para os diferentes órgãos linfoides, Considerando que o GM-CSF DCs migram para os linfonodos poplíteos onde GM-CSF DCs ativar as células T CD4/OTII de ingênua pela apresentação de OVAp. As pilhas de T de CD4/OTII ingênua então proliferaram e diferenciam para o fenótipo Th1. A Figura 7 ilustra a quantificação de ingênuo, ativação de células T CD4/OTII a partir da análise da membrana CD69 e expressão de CD25. A Figura 8 mostra a quantificação da proliferação de células T CD4/OTII. A Figura 9 ilustra a quantificação da diferenciação de células T CD4/OTII para o fenótipo Th1.
Figura 1: esquema de protocolo. 1) Isole células BM de fêmures de rato e tíbias. BM 2) a cultura de células com GM-CSF, GM-CSF BM de gerar derivadas-DCs. 3) DC seleção diferenciação e maduro GM-CSF BM derivado-DCs com LPS. 4) verificar a maturação DC. 5) carga DCs com OVAp. 6) isoladas células T CD4/OTII formam o baço de rato. 7) mancha de células T CD4/OTII com corante marcador de célula vital. 8) verificar a pureza de isolamento e célula vital traçador corante de coloração de células T CD4/OTII isoladas. 9) enviaram transferi i.v. de células T CD4/OTII isolado de ratos destinatários. 10). enviaram transferir s.c. de DCs OVAp-carregado e amadurecido para destinatários ratos. 11) verificar a ativação de células T CD4/OTII. 12) verificar a diferenciação e proliferação das células T CD4/OTII. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: processo de isolamento da medula óssea de fêmures de rato e tíbias. (A) incisão de pele com uma tesoura. (B) remoção da pele do membro. (C) incisão do músculo com uma tesoura. (D) remoção do músculo do membro com um bisturi. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: fluxo cytometry análise da maturação de GM-CSF BM-derivado DCs. Expressão de MHCII, CD80 e CD86 em LPS ativados (+ LPS) de superfície e não está ativado (-LPS) derivado de GM-CSF BM DCs. números mostram a intensidade da fluorescência média em unidades arbitrárias (u.a.). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: localização dos gânglios linfáticos inguinais, axilares, braquiais, cervicais e mesentéricos e o baço em camundongos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Experimental criado para linfonodo e baço homogeneização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: transferência adotiva de células T CD4/OTII e OVAp-carregado de GM-CSF BM-derivada-DCs. (A) injeção intravenosa de células T CD4/OTII no plexo retrô-orbital. (B) injecção subcutânea de DCs de GM-CSF BM-derivado OVAp-carregado na Whitney. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: quantificação da ativação de células T em vivo. Fluxo cytometry parcelas e gráfico que mostra a análise e a quantificação da expressão membrana de CD69 em células T CD4. CD45.1/cd45.2 ratos foram transferidos enviaram i.v. com mouse CD45.1/CD4/OTII e células CD45.1/CD4/OTII 24 h antes da transferência adotiva s.c. de BM OVAp-carregado do GM-CSF-derivada-ativação de células T DCs. foi medido em 2 dias post-C.C. transferência por citometria de fluxo depois da coloração com anticorpos fluorescentes marcados aos antígenos indicados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: quantificação da proliferação de células T em vivo. Fluxo cytometry enredos e gráficos que mostram a análise e a quantificação do declínio corante marcador célula vital coloração T CD4 nas células em proliferação. CD45.2 ratos foram transferidos enviaram i.v. com células de rato CD45.1/CD4/OTII 24 h antes da transferência adotiva s.c. de BM OVAp-carregado do GM-CSF-derivada-proliferação de célula T DCs. foi medido em 5 dias post-C.C. transferência por citometria de fluxo após coloração com o indicado de anticorpos fluorescentes. Proliferação de células t pode ser determinada medindo-se a percentagem de células proliferando, a percentagem de células em cada pico de divisão, ou pela contagem do número de picos de divisão conforme mostrado nos gráficos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: quantificação da diferenciação de células T para células Th1 fenótipo na vivo. Parcelas de citometria de fluxo e gráficos que mostram a análise e a quantificação da percentagem de células T de CD4 relato-expressando. CD45.2 ratos foram transferidos enviaram i.v. com células de rato CD45.1/CD4/OTII 24 h antes da transferência adotiva s.c. de BM OVAp-carregado do GM-CSF-derivada-diferenciação de células T DCs. foi medido em dias post-C.C. transferência por citometria de fluxo após coloração com o indicado de anticorpos fluorescentes. Diferenciação de células t para o fenótipo Th1 determinou-se como células de relato-expressa como uma porcentagem do totais células T CD4 e de apenas as células T CD4 proliferando. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo permite a caracterização da capacidade de DCs BM-derivado de modular a ativação, proliferação e diferenciação das células T CD4 de ingênuo. Além disso, ele pode também ser usado para avaliar a suscetibilidade de células T CD4 a modulação por DCs BM-derivado. Com este protocolo, mudanças nestes eventos podem ser medidos em vivo.
Dependendo da hipótese sob investigação, várias combinações de células T e DCs podem ser usadas. Por exemplo, um pode analisar as consequências de bater em ou nocauteando genes específicos ou a eficiência de um estímulo específico da ativação de células T CD4, proliferação ou diferenciação de Th1. Estes procedimentos podem ser realizados na DCs ou T CD4 células ou em ambos os tipos de células. Assim, as células T CD4 de camundongos geneticamente modificados ou de tipo selvagem podem ser combinadas com DCs derivados do selvagem-tipo ratos e vice-versa.
Este protocolo pode ser adaptado para distinguir a origem das populações de célula diferente usando citometria de fluxo e anticorpos contra CD45.1 e CD45.2. Com efeito, CD45.1/CD45.1 e CD45.2/CD45.2 de ratos podem ser usados como a fonte de qualquer um dos tipos celulares usados ou como destinatários para transferência adotiva em qualquer combinação. Por exemplo, as células T CD4 podem ser obtidas CD45.1/CD45.1/OTII ratos enquanto ratos CD45.2/CD45.2 podem ser a origem do BM para a geração de DC. Neste experimento, os dois tipos de células podem ser transferidos enviaram aos ratos CD45.1/CD45.2. Além disso, as células T CD4/OTII de CD45.1/CD45.1 tipo um ratos e ratos de tipo dois CD45.2/CD45.2 podem ser combinados nos mesmos ou diferentes receptores de tipo três CD45.1/CD45.2 para comparar o comportamento do tipo um e tipo duas populações de células T CD4 em competir e não-concorrentes condições, respectivamente.
Este método descreve a geração de GM-CSF BM-derivado DCs. No entanto, protocolos alternativos estão disponíveis para a maturação de DC e diferenciação; por exemplo, a papaína pode ser usada em vez de LPS ou ligante de fms-relacionados tirosina quinase 3 (Flt3-L) em vez de GM-CSF, permitindo o estudo da capacidade do DCs fenotipicamente distintas para ativar a imunidade adaptativa do célula T CD4. Com a mesma intenção, DCs para carregamento do antígeno e apresentação podem ser diretamente isolados de ratos. Combinação do presente protocolo com outros9 permite a manipulação de ingênuo células T CD4/OTII por infecção viral16 antes de sua transferência adoptiva para destinatários ratos. BM pode ser também transfectada com o retrovírus9 para estudar o efeito de modificações de célula controlada em controladores de domínio antes de seu uso no protocolo.
Além disso, este protocolo pode ser adaptado para estudos de microscopia intravital17 usando células expressando a proteína fluorescentes. Por exemplo, ratos de CD4/OTII podem ser cruzados com camundongos expressando GFP ou cereja para obter ratos GFP ou cereja/OTII CD4. Estes ratos podem ser usados como uma fonte de células T CD4 e podem ser combinados com DCs BM-derivado de cereja - ou de expressando GFP ratos, conforme necessário, experimentos na vivo .
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar
Acknowledgments
Agradecemos o Dr. Simon Bartlett para edição inglesa. Este estudo foi suportado por concessões do Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), o programa de Miguel Servet e Fundación Ramón Areces; com o co-financiamento do Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). A CNIC é suportado pelo Ministério da economia, da indústria e competitividade (MEIC) e Fundação Pro CNIC e é um Severo Ochoa centro de excelência (SEV-2015-0505). RTF é fundada pela Fundación Ramón Areces e CNIC, VZG por ISCIII, BHF pelo Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) e JMG-G pelo ISCIII Miguel Servet programa e imas12.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
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