Summary
Denne protokol indfører en simpel to-trins metode til skelne hornhinde limbal epitelial stamceller fra humane pluripotente stamceller på xeno- og feeder celle-fri kultur betingelser. Metoderne celle kultur præsenteres her aktiverer omkostningseffektive, omfattende produktion af klinisk kvalitet celler gælder for hornhinde celle terapi brug.
Abstract
Hornhinde limbal epitelial stamceller (LESCs) er ansvarlig for løbende fornyelse af hornhindens epitel, og dermed opretholde hornhinde homøostase og visuel klarhed. Humane pluripotente stamceller (hPSC)-afledte LESCs giver en lovende celle kilde for hornhinde celleudskiftnings. Udefineret, xenogene kultur og differentiering betingelser forårsage variation i forskningsresultater og hindre den kliniske oversættelse af hPSC-afledte therapeutics. Denne protokol indeholder en reproducerbar og effektiv metode til hPSC-LESC differentiering på xeno- og feeder celle-fri betingelser. For det første tjener éncellelag kultur af udifferentierede hPSC på rekombinant laminin-521 (LN-521) og definerede hPSC medium som et fundament for robust produktion af høj kvalitet råvare til differentieringer. For det andet giver en hurtig og enkel hPSC-LESC differentiering metode LESC populationer på kun 24 dage. Denne metode omfatter en fire-dages overflade ectodermal induktion i suspension med små molekyler, efterfulgt af vedhængende kultur fase på LN-521/kollagen IV kombination matrix i definerede hornhindens epitel differentiering medium. Cryostoring og udvidede differentiering yderligere renser cellen befolkningen og gør det muligt for bank af celler i store mængder til celleterapi. De deraf følgende høj kvalitet hPSC-LESCs give en potentiel roman behandlingsstrategi for hornhindens overflade genopbygning at behandle limbal stamceller mangel (LSCD).
Introduction
Gennemsigtig hornhinden ved okulær overflade giver lys til at indtaste nethinden og indeholder størstedelen af øjets refraktive magt. Det yderste lag, Strata hornhindens epitel, er løbende regenereres ved limbal epitelial stamceller (LESCs). LESCs er bosat i den basale lag af limbal nicher på corneoscleral junction1,2. LESCs mangler specifikke og unikke markører, så deres identifikation kræver en mere omfattende analyse af en række formodede markører. Epitelial transskription faktor p63 og især N-terminalt afkortet udskrift af den alpha isoform af p63 (ΔNp63α), er blevet foreslået som en relevant positiv LESC markør3,4. Asymmetriske fordeling af LESCs mulighed at selv forny, men også producere afkom, der vandrer centripetally og anteriorly. Som cellerne fremskridt mod hornhindens overflade de gradvist mister deres stemness og endelig uhelbredeligt differentiere til overfladiske planocellulære celler, der er løbende tabt fra hornhindens overflade.
Skade på nogen af de hornhinde lag kan føre til svære synshandicap, og hornhinde defekter er således en af de førende årsager til tab af synet på verdensplan. I limbal stamceller mangel (LSCD), er limbus ødelagt af sygdommen eller traumet, der fører til conjunctivalization og mattering af hornhindens overflade og efterfølgende tab af vision5,6. Celle substitutionsterapi ved hjælp af autologe eller allogene limbal grafts tilbyder en behandlingsstrategi for patienter med LSCD4,7,8,9. Men høst autologe transplantater bærer en risiko for komplikationer til det raske øje, og donorvæv er en mangelvare. Humane pluripotente stamceller (hPSCs), specifikt menneskelige embryonale stamceller (hESCs) og menneskeligt inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs), kan tjene som en ubegrænset kilde til klinisk relevante celletyper, herunder hornhindens epitel celler. HPSC-afledte LESCs (hPSC-LESCs) repræsenterer derfor et attraktivt nye celle kilde for okulær celleudskiftnings.
Traditionelt, har både udifferentierede hPSC kultur metoder og deres differentiering protokoller til LESCs stolet på brug af udefinerede feeder celler, animalsk sera, konditioneret medier eller fostervand membraner10,11, 12 , 13 , 14 , 15. for nylig, indsats mod sikrere celleterapi har bedt om at søge efter mere standardiseret og xeno-fri kultur og differentiering protokoller. Som følge heraf er flere definerede og xeno-gratis metoder til langtidskulturer af udifferentierede hPSCs nu kommercielt tilgængelige16,17,18. Som et kontinuum, styret differentiering protokoller bygger på molekylære stikord til at guide hPSCs til hornhindens epitel skæbne har været for nylig indført19,20,21,22, 23. Endnu bruges mange af disse protokoller enten udefineret, feeder baseret hPSCs som udgangsmateriale eller komplekse, xenogene vækstfaktor cocktails for differentiering.
Formålet med denne protokol er at give en robust, optimeret, xeno- og feeder-fri hPSC kultur metode og efterfølgende differentiering til hornhinde LESCs. Éncellelag kultur af pluripotente hPSCs på laminin-521 (LN-521) matrix i definerede, albumin-fri hPSC medium (specielt vigtigt 8 Flex) giver mulighed for hurtig produktion af homogene råvare til differentiering. Derefter en simpel to-trins differentiering strategi guider hPSCs mod overfladen ectodermal skæbne i suspension, efterfulgt af vedhængende differentiering til LESCs. En celle population hvor > 65% express ΔNp63α er opnået inden for 24 dage. Xeno - og feeder-fri protokol er blevet testet med flere hPSC linjer (både hESCs og hiPSCs), uden krav til celle linje specifikke optimering. Protokoller for weekend-free vedligeholdelse, passaging, cryostoring og hPSC-LESC fænotyper beskrevet her aktiverer produktionen af store partier af højkvalitative LESCs for klinisk eller forskning formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Universitetet i Tampere er godkendt af den nationale myndighed for Medicolegal anliggender Finland (Dnro 1426/32/300/05) til at gennemføre forskning på menneskelige embryoner. Instituttet har også støttende sætninger af det etiske udvalg af bydelen Pirkanmaa Hospital til at udlede, kultur, og skelne menneskelige stamceller linier (Skottman/R05116) og anvende hiPSC linjer i oftalmologiske forskning (Skottman/R14023). Ingen nye cellelinjer blev udledt til denne undersøgelse.
Bemærk: Protokollen beskrevet er baseret på specifikke, kommercielt tilgængelige hPSC og hornhindens epitel differentiering medier. Henvises til Tabel af materialer til producent/leverandør oplysninger og katalog numre.
1. etablering af Xeno - og Feeder-fri hPSC kultur
- Præparater
- Frakke 24-godt plader med humane rekombinante laminin-521 (LN-521). For det første feeder-fri (FF) passage, bruge LN-521 ved en koncentration på 1,09 µg/cm2, og på 0,55 µg/cm2 for følgende passager. De foreslåede LN-521 koncentrationer tjene som udgangspunkt for vellykkede FF kultur men kan sænkes.
- Tø LN-521 hætteglas langsomt ved 4 ° C som anvist af fabrikanten.
Bemærk: Korrekt håndterede LN-521 løsning kan opbevares ved 4 ° C i op til 3 måneder efter optøning. - For at forberede belægning løsning, fortyndes passende mængde LN-521 stamopløsning med 1 x Dulbecco Phosphate-Buffered saltvand (DPBS) indeholdende Ca2 + og Mg2 + til en samlet maengde paa 300 µL pr. brønd.
- Pipette belægning løsning brønde, forsegle den godt plade med parafilm, og der inkuberes natten over ved 4 ° C. Overtrukne plader opbevares ved 4 ° C i op til 2 uger.
(Valgfri): Alternativt, for en hurtig belægning protokol, inkuberes godt plader med belægning løsning i 2 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
- Tø LN-521 hætteglas langsomt ved 4 ° C som anvist af fabrikanten.
- Forberede hPSC næringssubstratet (specielt vigtigt 8 Flex) ved at supplere basal medium med medfølgende supplement, som anvist af fabrikanten. Tilføje 50 U/mL penicillin-streptomycin. Bemærk, at formuleringen er følsomme over for lys og høje temperaturer. Tø supplementet og varm medier ved stuetemperatur (RT), beskyttet mod lys. Bruge suppleret hPSC medium inden for to uger fra datoen for tilskud.
- Frakke 24-godt plader med humane rekombinante laminin-521 (LN-521). For det første feeder-fri (FF) passage, bruge LN-521 ved en koncentration på 1,09 µg/cm2, og på 0,55 µg/cm2 for følgende passager. De foreslåede LN-521 koncentrationer tjene som udgangspunkt for vellykkede FF kultur men kan sænkes.
- Overførsel af hPSC til FF kultur på LN-521
- Pre varme alle de nødvendige materialer og reagenser til RT i laminar flow hætte.
- Passage hPSCs fra standard kultur system på feeder lag (fx inaktiverede menneskelige forhuden (hFF) eller mus embryonale fibroblaster), eller andre FF kultur systemer ved hjælp af standard metode. For eksempel, kan hPSC kolonier kulturperler på hFF feeder celler blive dissekeret at små stykker med en skalpel og brikkerne derefter skilt med en nål-spids. Menneskelige PSC'er kulturperler bruger FF kultur systemer kan overføres ved hjælp af cluster passaging metode med eller uden forudgående enzym behandling.
- Fjern LN-521 belægning løsning fra 24-brønde og tilsæt 1 mL pre varmede hPSC medium pr. brønd.
Bemærk: Lad ikke brøndene tørre som LN-521 vil inaktivere ved tørring. - Overføre koloni stykker/celle klynger LN-521 belagt 24-brønde i hPSC medium med en pipette. Overføre 20 – 30 koloni stykker pr. brønd, undgår overbelægning brøndene.
- Udskift mediet med 1 mL af hPSC medium dagen efter overførsel og hver anden dag derefter. Kulturer er klar til passaging 3 – 4 dage senere, da hPSCs er vokset ud til kolonier med glat, udifferentierede morfologi. For reference, se figur 1B (første billede). For det første FF passage, kolonierne må ikke vokse til et fuldt sammenflydende éncellelag, men kulturer bør være passaged når kolonier nå et omtrentlige størrelse af 1 mm.
- Passaging og vedligeholdelse af FF hPSC kultur
- Pre varme alle de nødvendige materialer og reagenser til RT i laminar flow hætte.
- Fra den anden FF passage og fremefter, passage FF hPSCs når kulturen har nået 80-100% confluency. Passage FF hPSCs til nye LN-521 belagt 24-godt plader ved hjælp af enkelt celle passaging to gange om ugen (på mandage og torsdage) at opretholde høj kvalitet kulturer med udifferentierede morfologi og opnå weekend-fri fodring regime. For flere oplysninger henvises til18,24,25.
- Skyl FF hPSCs to gange med 1 mL af 1 x DPBS uden Ca2 + og Mg2 +.
- Frigør FF hPSCs med xeno-fri trypsin-EDTA (specielt TrypLE Vælg enzym) ved udrugning 500 µL pr. brønd ved 37 ° C, 5% CO2. For optimal inkubationstiden, Tillad cellerne at runde op men ikke at frigøre. Det tager normalt 3 min ved 37 ° C, 5% CO2 (ikke overstiger 5 min).
- Fjerne xeno-fri trypsin-EDTA og straks tilføje 500 µL pr. brønd af definerede trypsin hæmmer.
- Frigør FF hPSCs ved forsigtig, men grundig pipettering for at få en enkelt cellesuspension. Overføre FF hPSC suspension via en 40 µm celle si i en 15 mL konisk centrifugeglas indeholdende pre varmede hPSC medium.
- Brøndene vaskes med 1 mL af hPSC medium og tilføje vask medium til 15 mL konisk centrifugeglas.
- Centrifugeres enkelt cellesuspension for 5 min på 300 x g og Opsug den celle pellet resuspend i 1 mL pre varmede hPSC medium.
- Tælle celler med hemocytometer eller automatiseret celle counter.
- Fjerne LN-521 belægning løsning (0,55 µg/cm2) fra 24-brønde og tilføje hPSC medium som i 1.2.3.
- Plade FF hPSCs på 0,55 µg/cm2 LN-521 belagt 24-brønde med en celle tæthed på 40.000 – 50.000 celler/cm2.
- Erstatte medium med friske hPSC medium dagen efter passaging, og hver anden dag derefter undtagen søndage.
- Cellerne er klar til at blive brugt til differentiering 3-4 dage efter passaging, når kulturen har nået > 85% confluency. For at sikre den høje kvalitet af hPSCs, henvise til karakterisering metoder beskrevet detaljeret i forrige værker18,24,25. Det anbefales at kun kultur hPSCs passage niveau 15 i FF system ved hjælp af enkelt celle passaging for at undgå ændringer af karyotypic. Brug kun høj kvalitet, udifferentierede hPSCs som udgangspunkt materiale for differentieringer.
2. direkte differentiering og kryopræservering af hPSC-afledte LESCs
- Præparater
- Forberede xeno-fri basal induktion medium (basal induktion medium): Supplement Dulbecco modificeret Eagle's medium (specielt KnockOut DMEM) med 15% xeno-gratis serum udskiftning (spesifically CTS KnockOut SR XenoFree), 2 mM L-glutamin, 0.1 mM 2 - mercaptoethanol, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 50 U/mL penicillin-streptomycin. Bruge basal induktion medium inden for to uger.
- Forberede medier for hornhinde induktion i suspension kultur.
- Dag 1: Supplere basal induktion medium med 5 μM blebbistatin.
- Dag 2: Supplere basal induktion medium med 10 µM SB-505124 og 50 ng/mL menneskelige basic fibroblast vækstfaktor (bFGF).
- Dag 3-4: Supplement basal induktion medium med 25 ng/mL ben morfogenetiske proteiner 4 (BMP-4).
- Forberede vedhængende kultur hornhindens epitel differentiering medium (differentiering mellem, specielt CnT-30): tilføje kosttilskud til basal medium ifølge producentens anvisninger og tilføje 50 U/mL penicillin-streptomycin.
Bemærk: Differentiering medium formulering er følsomme over for lys. Bruge suppleres med differentiering medium senest 6 uger efter datoen for tilskud. - Coat 100 mm vævskultur retter for vedhængende differentiering (Se trin 2.3) med en blanding af 5 µg/cm2 menneskelige placenta kollagen type IV (col IV) og 0,5 µg/cm2 LN-521 fortyndet i 1 x DPBS indeholdende Ca2 + og Mg2 +, i alt belægning volumen af 5 mL pr parabol. Forberede og gemme belægninger med col IV og LN-521 som beskrevet i 1.1.1.3.
-
Trin I: hornhinde induktion i suspension kultur
- Pre varme alle de nødvendige materialer og reagenser til RT i laminar flow hætte.
- Frigøre FF hPSCs til enkelt cellesuspension med xeno-fri trypsin-EDTA, som anvist i trin 1.3.2.1–1.3.2.6. Tælle cellerne, og distribuere 2-3 x 106 celler pr. lav vedhæftede 6-godt plade godt, i samlet volumen af 3 mL af basal induktion medium suppleret med 5 μM blebbistatin til at fremkalde EB dannelse natten over ved 37 ° C, 5% CO2 (dag 1).
- Den følgende dag (dag 2) fjerne medium og erstatte med 3 mL af basal induktion medium suppleret med 10 µM SB-505124 og 50 ng/mL bFGF.
- På følgende to dage (dage 3 – 4), fjerne medium og erstatte med 3 mL af basal induktion medium suppleret med 25 ng/mL BMP-4.
- Trin II: Hornhinde differentiering i vedhængende kultur
- Pre varme alle de nødvendige materialer og reagenser til RT i laminar flow hætte.
- På dag 5, plade af EBs ned på 100 mm vævskultur retter belagt med 5 µg/cm2 col IV og 0,5 µg/cm2 LN-521.
- Fjerne belægning løsningen fra 100 mm vævskultur retter og der tilsættes 10 mL af pre varmede differentiering medium pr. fad.
Bemærk: Tillad ikke retter til tørre som LN-521 vil inaktivere ved tørring. - Overføre EBs fra en 6-godt plade godt til to til tre 100 mm vævskultur retter (ca 50 EBs per cm2) når der afpipetteres. Distribuere EBs jævnt af blid ryster.
- Fjerne belægning løsningen fra 100 mm vævskultur retter og der tilsættes 10 mL af pre varmede differentiering medium pr. fad.
- Opretholde cellerne i vedhængende kultur ved 37 ° C, 5% CO2, erstatter mediet med 10 mL frisk differentiering mellem tre gange om ugen (på mandag, onsdag og fredag) for de næste 2,5 – 3 uger. Kontroller cellerne regelmæssigt for fremkomsten af korrekte epitelial morfologi ved hjælp af fase kontrast mikroskop.
- Trin III: Cryo-bank hPSC-afledte LESCs
- Pre varme alle de nødvendige materialer og reagenser til RT i laminar flow hood, undtagen kryopræservering medium, der bør nedkøles før.
- Frigøre hPSC-afledte LESCs med xeno-fri trypsin-EDTA og tælle cellerne, som anvist til FF hPSCs i skridt 1.3.2.1–1.3.2.6, men ved hjælp af differentiering medium.
Bemærk: For hPSC-afledte LESCs, optimal inkubationstiden med xeno-fri trypsin-EDTA er længere (ca. 5 min). Brug 3 mL xeno-fri trypsin-EDTA og definerede trypsin hæmmer pr. 100 mm parabol. - Efter tælle cellerne, Gentag centrifugering i 5 min på 300 x g, Aspirér medium og resuspenderes celle i pre kølede, xeno-fri hPSC kryopræservering medium. Med pipette overfoeres enkelt celle suspension i cryotubes, således at hver cryotube indeholder 0,5 til 1 x 106 celler i 1 mL kryopræservering medium.
- Sted rør i en indefrysning container og overførsel straks (inden for 5 min) til-80 ° C natten over.
- Den følgende dag, skal du overføre rør til flydende kvælstof til langtidsopbevaring.
- Trin IV: Optøning af befrugtede hPSC-LESCs
- Forud for optøning, pels retter/godt plader med 5 µg/cm2 col IV og 0,5 µg/cm2 LN-521.
- Pre varme alle de nødvendige materialer og reagenser til RT i laminar flow hætte.
- Fjerne belægning løsningen fra retter/brønde og tilføje passende volumen af pre varmede differentiering medium.
Bemærk: Tillad ikke retter til tørre som LN-521 vil inaktivere ved tørring. - Tø celler hurtigt på RT og straks overføre cellesuspension til en 15 mL konisk centrifugeglas der indeholder 5 mL af pre varmede differentiering medium.
- Der centrifugeres cellesuspension for 5 min på 300 x g, Aspirér, og resuspenderes i differentiering medium til at fjerne enhver kryopræservering medium.
- Plade celler på retter/brønde belagt med 5 µg/cm2 col IV og 0,5 µg/cm2 LN-521, i medium, differentiering med en tæthed på 40.000 – 50.000 celler/cm2. Vedligeholde celler ved 37 ° C, 5% CO2, erstatter differentiering mellem tre gange om ugen.
3. fænotyper af hPSC-afledte LESCs
- Kvalitative immunofluorescens analyse
- Immunfluorescens, pels 24 - eller 12-godt plade brønde med 5 µg/cm2 col IV og 0,5 µg/cm2 LN-521 og plade/tø hPSC-LESCs i differentiering medium med en tæthed på 40 000 – 50 000 celler/cm2.
- Når kulturer har nået confluency, lave cellerne med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA): brøndene vaskes to gange med 1 x DPBS uden Ca2 + og Mg2 +og Inkuber 15-20 min med 4% PFA på RT. Derefter vaskes to gange med 1 x DPBS til at fjerne enhver PFA rester. Brug 0,5-1 mL af løsninger pr. brønd.
Bemærk: Fast celler kan opbevares i 1 x DPBS ved 4 ° C i op til én uge før farvning.
Forsigtig: PFA er giftige og ætsende. Håndtere PFA i et stinkskab og bære beskyttelsestøj, beskyttelse af øjne og handsker. - Opsug 1 x DPBS og permeabilize celle membraner af inkubere for 10-15 min med 0,1% Triton X-100 i 1 x DPBS.
- Opsug 0,1% Triton X-100 og blokere uspecifik antistof bindende websteder ved at inkubere for 1 h med 3% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x DPBS på RT. Forbered primære antistof fortyndinger i 0,5% BSA i 1 x DPBS.
Bemærk: Se tabel 1 for anbefalede primære antistoffer. - Opsug 3% BSA og inkuberes med passende fortyndet primære antistof natten over ved 4 ° C.
- Vaske wells 3 x i 5 min. med 1 x DPBS. Forberede sekundær antistof fortyndinger i 0,5% BSA i 1 x DPBS.
Bemærk: Se tabel 1 for anbefalede sekundære antistoffer. - Opsug 1 x DPBS og inkuberes med egnet, passende fortyndet sekundær antistof til 1 h i RT, beskyttet mod lys.
Bemærk: Fra dette trin på, holde prøver beskyttet mod lys for at forhindre falmning af de fluorescerende farvestoffer. - Vaske wells 3 x 5 min. med 1 x DPBS og endelig kontrastfarve kerner med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og mount med fluorescens montering medier. DAPI kan bruges separat i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger eller inkluderet i montering medium. Sted runde coverslips (diameter 19 mm og 13 mm til 12 - og 24-godt plader, henholdsvis) i hver brønd. Følg producentens anvisninger med hensyn til tørring og opbevaring af de monterede prøver.
- Billede af farvede celler med en fluorescerende mikroskop.
- Kvantitative immunofluorescens analyse
- Forberede cytospin prøver af hPSC-afledte LESCs på objektet briller.
- Frigøre hPSC-afledte LESCs med xeno-fri trypsin-EDTA og tælle cellerne, som anvist i trin 2.4.2.
- Efter tælle, tilføje pre kølet 1 x DPBS og centrifugeres i 5 min. ved 300 x g. justere sample volumen og celle koncentration i henhold til producentens anvisninger for den givne cytocentrifuge, fx 50.000-100.000 celler i en sample volumen af 150 µL.
- Spin celler ned til objektet glas med en cytocentrifuge fx 5 min på 28 x g og fix straks for 15-20 min med 4% PFA i 1 x DPBS på RT. Den anbefalede spinning tid og hastighed, finder du brugsanvisningen for den givne cytocentrifuge.
- Fortsæt til farvning cytospin prøver som beskrevet i trin 3.1.3–3.1.8 brug flydende blocker pen til surround-prøver med en hydrofobe cirkel og udføre farvning i et slipværktøj til økonomisk praksis. Vasker kan udføres i containere med slide indehavere, for at sikre effektiv fjernelse af overskydende antistoffer og minimal baggrund farvning. Kontrastfarve kerner med DAPI og montere de farvede prøver med fluorescens montering medier, der dækker med coverslips. Følg producentens anvisninger med hensyn til tørring og opbevaring af de monterede prøver.
- Tage 5-10 billeder pr. sample fra tilfældigt udvalgte steder ved hjælp af fx 10 X forstørrelse af et fluorescens mikroskop.
- Anslå procentdelen af positivt farvede celler i forhold til samlede (DAPI positive) celler, fx med ImageJ billedbehandling og analyse-softwareværktøjer (https://imagej.nih.gov/ij/). Helst analysere > 500 celler pr. prøve.
- Åbn billedet, der skal analyseres i ImageJ software. Duplicate billede og filter med standard Gaussian blur til at fjerne støj.
- Oprette en tærskel. Justere tærskelværdierne for optimal udvælgelse af positivt farves cellekerner, og anvende. Duplikerede billedet er nu konverteret til en binær opfattelse.
- Processen i binært billede med binære forarbejdning værktøjer "Udfylde huller" og "Vandskel", som automatisk vil adskille flettede områder repræsenterer single kerner.
- Brug værktøjet "Analyze partikler" at automatisk liste områder af interesser (ROIs) til vinduet ROI manager, som vil åbne efter anvender kommandoen. Luk den binært billede.
- Visualisere ROIs i det originale billede ved at vælge "Vis alle" i ROI Manager. Bekræfte korrekte udvælgelse af bejdset cellekerner, og om nødvendigt manuelt fjerne og tilføje individuelle valg.
- Forberede cytospin prøver af hPSC-afledte LESCs på objektet briller.
- Flow flowcytometri analyse
- For at bekræfte p63α udtryk niveauer, pletten celler til flowcytometri.
- Frigøre hPSC-afledte LESCs med xeno-fri trypsin-EDTA og tælle cellerne, som anvist i trin 2.4.2.
- Vask celler to gange med 1 mL pre kølet 1 x DPBS og centrifugeres i 5 min. ved 300 x g. rettelse og permeabilize med klar-til-brug fiksering/permeabilization løsning i 20 min. ved 4 ° C. Derefter vask celler to gange med 1 mL pre kølet 1 x permeabilizing wash buffer.
Bemærk: Fra dette trin på, holde cellerne ved 4 ° C eller på is, medmindre andet er angivet. - Forsigtig: Fiksering/permeabilization løsning indeholder 4,2% formaldehyd. Håndtere de farlige løsning i et stinkskab og bære beskyttelsestøj, beskyttelse af øjne og handsker.
- Opdele prøver i 5 mL polypropylen rør. Hver prøve skal indeholde 100.000-200.000 celler og prøve lydstyrken skal justeres til ca 100 µL 1 x vaskebuffer.
- Tilføj 2 µL af fluorokrom konjugeret p63-α FACS antistof (for anbefalede antistof, se tabel af udstyr og materialer) til prøveglassene. Orlov en prøve unstained for at tjene som negativ kontrol. Vortex prøverne og Inkuber i 1 time på RT, beskyttet mod lys.
- Cellerne vaskes to gange med 1 mL pre kølet 1 x vaskebuffer og endelig resuspend pellets med 300 µL af buffer. Gemme rør på is, beskyttet mod lys.
- Analysere prøver med et flow Flowcytometret. Brug unstained negativ kontrolprøve gating med befolkningens korrekte celle, og for at udelukke fluorescerende baggrund signal. Analysere et minimum af 10.000 p63-α-farvede celler. For detaljerede tekniske gennemførelse, henvises til brugervejledningen til given flow Flowcytometret.
- For at bekræfte p63α udtryk niveauer, pletten celler til flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fra hPSCs til hPSC-LESCs
Hele processen fra inducere differentiering af FF hPSCs til cryostoring hPSC-LESCs tager omkring 3,5 uger. Skematisk oversigt over metoden differentiering fremhæver dens vigtigste skridt er præsenteret i figur 1A. Figur 1B viser typiske morfologier af cellepopulationer i forskellige faser af protokollen. De fremlagte data er fremstillet med Regea08/017 menneskelige stamceller linje og UTA.04607.WT hiPSC linje, både fremstillet og karakteriseret ved universitetet i Tampere, Finland, som tidligere beskrevet26,27,28.
På LN-521 i hPSC medium danne udifferentierede, høj kvalitet FF hPSCs først forskellige kolonier med skarpe kanter, som fusionere til homogene encellelag ved sammenløbet (figur 1B, første billede). Flere individuelt afledte og genetisk forskellige menneskelige stamceller og hiPSC linjer blev tilpasset og kulturperler med dette system. FF hPSC populationer formere ca 3-fold inden for hver passage, giver robust middel til at generere xeno- og feeder-fri start materiale for differentieringer25. 24 h induktion i EB medium producerer typisk en suspension af stramme, regelmæssig EBs af varierende størrelser (figur 1B, andet billede). Under overfladen ectodermal induktion i suspension (dag 2 – 4), bør EB morfologi ikke ændre dramatisk. Colonial udvækst synes snart efter at EBs er belagt på col IV/LN-521 kombination grundsubstans i differentiering medium (figur 1B, tredje og fjerde billeder), og inden for 21-25 dage af differentiering af celler danner sammenflydende homogent lag med polygonal morfologi typisk at epitelceller (figur 1B, femte billede). Cellerne kan derefter blive cryostored til senere brug. Levedygtighed og morfologi, der er velbevaret efter optøning hPSC-LESCs (figur 1B, sidste billede).
Typisk, 3 x 106 FF hPSCs forkromet til en enkelt 6-godt plade udbytte nok EBs at blive forgyldt for vedhængende kultur i 2-3 celle kultur retter (100 mm). Fra hver 100 mm skål, kan 1 til 1,5 x 106 celler høstes til cryobanking af dagen 22 – 25 af differentiering. I gennemsnit genererer hver udifferentierede FF hPSC 0,7 celler af dag 25 (figur 2).
Validering af hPSC-afledte LESCs
I mangel af specifikke LESC markør proteiner, er korrekte celle fænotype bekræftet med et sæt af markører, der viser, at faldet i udtryk for pluripotency forbundet proteiner og øget udtryk for anerkendte LESC markører. Dag 24 af differentiering, langt størstedelen af hPSC-afledte LESCs udtrykkelige forbundne boks protein PAX6 (PAX6), den centrale regulator af øjet udvikling, såvel som p63α, den bredt anerkendte LESC markør. Afkortet p63-isoform ΔNp63 er co udtrykt i de fleste af de p63α-positive celler, bekræfter mest hornhinden-specifikke ΔNp63α-positive celle fænotype. Basal epitelial markører og formodede LESC markører cytokeratin (CK) -15 og CK-14 udtrykkes delvis, hvorimod pluripotente stamceller markør OCT3/4 og modne hornhindens epitel markør CK-12 er målbart på dette punkt. Dette angiver differentiering af FF hPSCs mod unipotent limbal epitelial stamfaderen, men ikke endnu terminal differentiering af modne hornhindens epitel celler. (Figur 3A) HPSC-LESCs bevarer med succes deres fænotype efter genopretning fra cryostorage (Data sammenlignes med figur 3A).
Efter 24 dage af differentiering, ΔNp63 var udtrykt i 66,2% (n = 33, SD 9,3%) af Regea08/017 menneskelige stamceller-LESCs, og i 65,7% (n = 10, SD 4,1%) Uta.04607.WT hiPSC-LESCs (tal fra cytospin prøver, figur 3B). Efter inddrivelsen fra cryostorage, 82,2% (n = 10, SD 5,7%) af menneskelige stamceller-LESCs og 90,5% (n = 10, SD=3.7%) af hiPSC-LESCs udtrykt ΔNp63 (tal fra godt plader på dag 26-28, figur 3B).
Udtrykket p63α blev yderligere bekræftet med flow flowcytometri analyse for Regea08/017 menneskelige stamceller-LESCs. På dag 25 af differentiering var 62% af de frisk differentierede hPSC-LESCs positive for p63α. To dage efter genopretning fra cryostorage (dag 28 i alt), var 81% af cellerne p63α-positive (figur 3 c).
Figur 1: skematisk illustration af hPSC-LESC differentiering protokol (A) og typiske celle morfologier observeret i forskellige faser af processen (B). EBs er dannet fra en enkelt cellesuspension af høj kvalitet, udifferentierede hPSCs under den første 24 h. tre-dages lille molekyle induktion mod overfladen ectoderm i suspension er efterfulgt af vedhængende differentiering fase. Dag 24 af differentiering viser hovedparten af cellerne typiske LESC-lignende morfologi. Repræsentative billeder vist for Regea08/017 menneskelige stamceller linje før og under differentiering. Sort skala bar = 200 µm, gælder for alle billeder i panelet. Forkortelser: Blebb.: blebbistatin, SB: SB-505124 lille molekyle hæmmer, bFGF: basic fibroblast vækstfaktor, BMP-4: ben morfogenetiske proteiner 4, LN-521: humane rekombinante laminin 521, col IV: menneskelige placenta kollagen type IV, hPSC: humane pluripotente stamceller, EB: embryoid krop, LESC: limbal epitelial stamceller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: forventede celle udbytte. Boxplots viser antallet af celler fremstillet for cryostoring på dag 22-25 af differentiering, divideret med antallet af udifferentierede hPSCs belagt for EB dannelse skridt på dag 0. På gennemsnitlige 0.72 (SD 0,4) celler blev produceret fra hver pluripotente Regea08/017 menneskelige stamceller, mens 0,78 (SD 0,67) celler blev produceret fra hver UTA.04607.WT hiPSC. n: antal differentiering eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Forventet Fænotypen af hPSC-afledte LESCs. Immunfluorescens antistof mærkning (A) viser ensartet udtryk for øje udvikling regulator PAX6 og anerkendte LESC markører p63α og dens ΔNp63 isoform, samt to andre foreslog LESC markører - CK15 og 14. Pluripotency markør OCT3/4 og modne hornhindens epitel markør CK-12 er negativ. Repræsentative hvis billeder vist for Regea08/017 menneskelige stamceller-LESCs på dag 24 af differentiering. Skalere barer = 100 µm. (B) ΔNp63 celle optælling fra frisk differentieret og cryostored hPSC-LESCs viser, at cellerne ikke kun beholde, men Vis øget ΔNp63 udtryk efter cryostorage. Celle tælle resultater Vis > 65% af de frisk differentierede hPSC-LESCs farves positiv for ΔNp63 før proceduren cryobanking og > 80% efter vellykket inddrivelse. n = antal separate differentiering eksperimenter (minimum 600 celler tælles pr. sample og > 1600 celler pr. tidspunkt) (C) Flow flowcytometri analyse viser 62% af de frisk differentierede hPSC-LESCs og 81% af de optøede celler positiv for p63α, bekræfter cellen tælle resultater for linje Regea08/017. * i B-C angive optøede celler. Rød histogram for positiv prøve og sort for negative (unstained) prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Antistof | Værten | Fortynding |
| Primære antistoffer, hvis | ||
| PAX6 | kanin | 1:200 |
| p63α | mus | 1:200 |
| ΔNp63α | kanin | 1:200 |
| CK-15 | mus | 1:200 |
| CK-14 | mus | 1:200 |
| CK-12 | ged | 1:200 |
| OCT3/4 | ged | 1:200 |
| Sekundære antistoffer, hvis | ||
| Alexa Fluor 568 anti-ged Ig | æsel | 1:800 |
| Alexa Fluor 568 anti-mus Ig | æsel | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 anti-kanin Ig | æsel | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 anti-mus Ig | æsel | 1:800 |
Tabel 1: anbefalet primære og sekundære antistoffer bruges til immunofluorescens (hvis) mærkning af hPSC-afledte LESCs. Se Tabel af materialer for producenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det forventede resultat af denne protokol er den succesfulde og robust generation af LESCs fra en enkelt cellesuspension af FF hPSC inden for ca. 3,5 uger. Som hornhindens epitel udvikler sig fra overfladen ectoderm29, det første trin i protokollen tager sigte på styring hPSCs mod denne afstamning. En kort 24 h induktion med at omdanne vækst faktor beta (TGF-β) antagonist SB-505124 og bFGF bruges til at fremkalde ectodermal differentiering, efterfulgt af 48 h mesodermale BMP-4 stikord til at skubbe celler mod overfladen ectoderm. Det følgende vedhængende differentiering skridt på col IV/LN-521 kombination matrix sammen med kemisk definerede differentiering medium bruges til yderligere guide differentiering mod LESCs.
Høj kvalitet af råvaren (FF-hPSCs) er afgørende for vellykket differentiering. Kun FF hPSC kulturer med nær sammenløbet og næsten 100% af udifferentierede fænotype bør anvendes. Regelmæssige hPSC karyotyping er anbefalet, som enkelt celle passaging kan prædisponere hPSCs til karyotypic abnormiteter, der fører til vækst og differentiering fordele30. Langvarig udsættelse for trypsin kan forårsage utilstrækkelig EB dannelse eller hPSC død. Protokollen blev testet med fem individuelt stammer og genetisk forskellige hPSC linier, både menneskelige stamceller og hiPSC linjer. Der var ikke behov for celle linje specifikke ændringer til den lille molekyle koncentrationer eller induktion gange. Men under den indledende optimering af protokollen, overdreven celledød eller udseendet af celler med fibroblastic, neuronal eller andre morfologi angivet differentiering til uønskede lineages. I så fald kan metoden kræve finjustering. Kultur fartøj formater giver et udgangspunkt og kan være opskaleret fra de anbefalede størrelser.
Hele protokollen fra hPSC kultur til LESC differentiering og kryopræservering er defineret, så let overgang til god fremstilling af praksis (GMP) til produktion af celle terapi produkter. Som de kommercielle medier og reagenser gennemgå robust udvikling, fremstilling og kvalitetskontrolprocedurer, giver de en konsekvent og ensartet kvalitet platform for hPSC kultur og differentiering. De definerede betingelser minimere batch til batch variationer, som tilbyder en fordel i forhold til eksisterende hPSC-LESC differentiering protokoller10,11,12,13,14, 20 , 22 , 23. den hurtige og forholdsvis enkel protokol indeholder også en fordel i forhold til tre-dimensionelle hornhinde organoids, som er vanskeligt at standardisere på tværs af cellelinjer og laboratorier, og kræver robuste metoder til at rense ønskede celletyper31 ,32. Derudover giver højeffektive protokollen robust middel til at producere LESCs til forskningsformål, fx sygdom modellering, genteknologi, stof screening og toksikologiske test. Platformen kan desuden være let finjusteret for differentiering af andre okulære epitelcelle typer såsom retinale pigment epitel celler (ÅV celler)25.
Vellykket limbal celleudskiftnings kræver kun et par tusinde p63-positive LESCs4, pr. øje, men kvalitetssikring kræver yderligere cellepopulationer og derfor stor skala produktion. Cryobanking giver mulighed for forberedelse af let tilgængelige celle bestande for transplantation og for kvalitet og sikkerhed testning. Yderligere, hPSC-LESC renhed forbedrer efter cryostoring, og yderligere efter passaging og langvarig kultur25, som foreslået af øget ΔNp63 udtryk.
I Resumé genererer Denne robuste metode ΔNp63α-positive celler fra hPSCs i 3,5 uger på xeno- og feeder celle-fri kultur betingelser. Metoderne celle kultur præsenteres her aktiverer produktion af høj kvalitet LESCs gælder for okulær celle terapi brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev støttet af Academy of Finland (grant nummer 297886), programmet Human reservedele af Tekes, finsk finansiering agentur for teknologi og Innovation, den finske øje og væv Bank Foundation og den finske Kulturfond. Forfatterne vil gerne takke de biomedicinske laboranter Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt og Outi Heikkilä for fremragende teknisk bistand og bidrag til cellekultur. Professor Katriina Aalto-Setälä er anerkendt for at levere den hiPSC linje bruges og BioMediTech Imaging Core facilitet for at levere udstyr til fluorescens imaging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
- Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
- Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
- Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
- Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
- Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
- Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
- Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
- Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).
- Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
- Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
- Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
- Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
- Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).
- Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).
- Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4 (2017).
- Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
- Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).
- Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).
- Ali, R. R., Sowden, J. C.
- International Stem Cell Initiative,, et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286 (2017).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
