Summary
Dit protocol introduceert een eenvoudige twee stappen methode voor het differentiëren van hoornvlies limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen xeno- en voorwaarden feeder cel-vrije cultuur. De cel kweekmethoden gepresenteerde inschakelen kostenefficiënte en grootschalige productie van klinische kwaliteit cellen toepassing op hoornvlies cel therapie gebruik.
Abstract
Hoornvlies limbal epitheliale cellen van de stam (LESCs) zijn verantwoordelijk voor het continu vernieuwen het hoornvlies epithelium en dus behoud van hoornvlies homeostase en visuele helderheid. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide LESCs bieden een veelbelovende cel bron voor hoornvlies cel substitutietherapie. Ongedefinieerde, XENOGENECELLEN cultuur en differentiatie voorwaarden variatie veroorzaken in de onderzoeksresultaten en de klinische vertaling van hPSC afkomstige therapeutics belemmeren. Dit protocol biedt een reproduceerbare en efficiënte methode voor hPSC-LESC differentiatie xeno- en voorwaarden feeder cel-vrij. Ten eerste serveert enkelgelaagde cultuur van ongedifferentieerde hPSC op recombinante laminin-521 (LN-521) en gedefinieerde hPSC medium als een fundament voor de robuuste productie van kwalitatief hoogwaardige grondstof voor differentiaties. In de tweede plaats levert een snelle en eenvoudige hPSC-LESC differentiatie methode LESC populaties in slechts 24 dagen. Deze methode omvat een vierdaags oppervlakte ectodermal inductie in suspensie met kleine molecules, gevolgd door aanhangend cultuur fase op LN-521/collageen IV combinatie matrix in gedefinieerde hoornvlies epitheliale differentiatie medium. Cryostoring en uitgebreide differentiatie verder zuivert de celpopulatie en kunt bankieren van de cellen in grote hoeveelheden voor cel therapie producten. De resulterende hoogwaardige hPSC-LESCs bieden een mogelijke nieuwe behandeling strategie voor hoornvlies oppervlakte wederopbouw voor de behandeling van de cel van de stam van de limbal deficiëntie (LSCD).
Introduction
Het transparante hoornvlies aan de oculaire oppervlakte kunt licht in te voeren van het netvlies en biedt de meeste refractieve vermogen van het oog. De buitenste laag, de gestratificeerde hoornvlies epitheel, wordt voortdurend geregenereerd door limbal epitheliale cellen van de stam (LESCs). De LESCs bevinden zich in de basale laag van de limbal nissen in het corneoscleral junction1,2. LESCs geen specifieke en unieke markers, zodat hun identificatie een meer uitgebreide analyse van een aantal vermeende markeringen vereist. Epitheliale transcriptie factor p63, en met name N-terminaal afgeknotte transcript van de alpha isovorm van p63 (ΔNp63α), is voorgesteld als een relevante positieve LESC markeerdraad3,4. Asymmetrische verdeling van LESCs kan ze zelf vernieuwen, maar ook de productie van nakomelingen die centripetaal en anteriorly worden gemigreerd. Als de cellen vooruitgang richting het hoornvlies oppervlak ze geleidelijk verliezen hun stemness en ten slotte terminaal onderscheid maken naar oppervlakkige squamous cellen die voortdurend verloren gaan van het hoornvlies oppervlak.
Schade aan een van de lagen van het hoornvlies kan leiden tot ernstige visuele handicap, en hoornvlies gebreken zijn dus een van de belangrijkste oorzaken van zicht verlies wereldwijd. In de cel van de stam van de limbal-deficiëntie (LSCD), is de limbus vernietigd door ziekte of een trauma die tot conjunctivalization en troebelingen van het hoornvlies oppervlak en daaropvolgende verlies van visie5,6 leidt. Cel substitutietherapie met behulp van autologe of allogene limbal transplantaties biedt de strategie van een behandeling voor patiënten met LSCD4,,7,,8,9. Echter, oogsten van autologe transplantaten draagt een risico van complicaties voor het gezonde oog en donorweefsel is schaars. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), specifiek menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), kan dienen als een onbeperkte bron van klinisch relevante celtypen, met inbegrip van hoornvlies epitheliale cellen. Zodoende, hPSC afkomstige LESCs (hPSC-LESCs) vormen een aantrekkelijke nieuwe cel voor oogbeschadigingen en/of cel substitutietherapie.
Traditioneel, hebben zowel de ongedifferentieerde hPSC cultuur-methoden en de protocollen van de differentiatie te LESCs vertrouwd op het gebruik van niet-gedefinieerde feeder cellen, dierlijke sera, geconditioneerde media of vruchtwater membranen10,11, 12 , 13 , 14 , 15. onlangs, streven naar veiligere cel therapie producten de zoektocht naar meer gestandaardiseerde en xeno-vrije cultuur en differentiatie protocollen hebben gevraagd. Dientengevolge, zijn verschillende gedefinieerde en xeno-gratis methoden voor langetermijnkweek van ongedifferentieerde hPSCs nu verkrijgbare16,17,18. Als een continuüm, gestuurde differentiatie protocollen te vertrouwen op moleculaire signalen bij hPSCs aan hoornvlies epitheliale lot onlangs geweest geïntroduceerd19,20,21,22, 23. Nog veel van deze protocollen beide ongedefinieerde, feeder gebaseerd hPSCs gebruikt als materiaal of complexe, XENOGENECELLEN groeifactor cocktail voor differentiatie wordt gestart.
Het doel van dit protocol is bedoeld als een robuuste, geoptimaliseerde, xeno- en feeder-vrije hPSC cultuur methode en latere differentiatie naar hoornvlies LESCs. Enkelgelaagde cultuur van pluripotente hPSCs op laminin-521 (LN-521) matrix gedefinieerd, albumine-gratis hPSC medium (specifiek essentiële 8 Flex) kunt snelle productie van homogene grondstof voor differentiaties. Daarna een eenvoudige, de strategie van de differentiatie van de twee stappen begeleidt hPSCs naar oppervlakte ectodermal lot in suspensie, gevolgd door aanhangend differentiatie naar LESCs. Een waar > 65% ΔNp63α express-celpopulatie wordt verkregen binnen 24 dagen. Het protocol xeno - en feeder-free is getest met verschillende hPSC lijnen (zowel hESCs als hiPSCs), zonder dat er gelden voor de cel specifieke optimalisering van de lijn. De protocollen voor het weekend-vrije onderhoud, passaging, cryostoring en hPSC-LESC fenotypering hier beschreven inschakelen productie van grote hoeveelheden van kwalitatief hoogwaardige LESCs voor klinische of onderzoek doeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Universiteit van Tampere heeft de goedkeuring van de nationale autoriteit voor Medicolegal zaken Finland (Dnro 1426/32/300/05) voor onderzoek naar menselijke embryo's. Het Instituut heeft ook ondersteunende verklaringen van de ethische commissie van de Pirkanmaa ziekenhuis District te ontlenen, cultuur, en hESC lijnen (Skottman/R05116) te onderscheiden en te gebruiken hiPSC lijnen in ophthalmic onderzoek (Skottman/R14023). Geen nieuwe cellijnen zijn afgeleid voor deze studie.
Opmerking: Het protocol beschreven is gebaseerd op specifieke, verkrijgbare hPSC en hoornvlies epitheel differentiatie media. Raadpleeg de Tabel van materialen voor fabrikant/leverancier informatie en catalogus nummers.
1. invoering van Xeno - en Feeder-free hPSC cultuur
- Voorbereidingen
- Jas 24-Wells-platen met menselijke recombinante laminin-521 (LN-521). Gebruik voor de eerste feeder-gratis (FF) passage, LN-521 bij een concentratie van 1,09 µg/cm2, en op 0.55 µg/cm2 voor de volgende passages. De voorgestelde LN-521 concentraties dienen als uitgangspunt voor succesvolle FF cultuur maar kunnen worden verlaagd.
- Ontdooi LN-521 flacon langzaam bij 4 ° C volgens de instructies van de fabrikant.
Opmerking: Op de juiste wijze behandeld LN-521 oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C voor maximaal 3 maanden na het ontdooien. - Ter voorbereiding van de oplossing van de coating, Verdun juiste hoeveelheid LN-521 stockoplossing met 1 x Dulbecco Phosphate-Buffered zout (DPBS) met Ca2 + en Mg2 + tot een totaal volume van 300 µL per putje.
- Pipetteer de oplossing van de coating aan de putjes, verzegelen de goed plaat met parafilm, en na een nacht bebroeden bij 4 ° C. Gecoate platen kunnen tot 2 weken bij 4 ° C worden bewaard.
(Optioneel): als alternatief voor een snelle coating protocol, incubeer goed platen met coating oplossing gedurende 2 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
- Ontdooi LN-521 flacon langzaam bij 4 ° C volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereiden hPSC kweekmedium (specifiek essentiële 8 Flex) door aanvulling van basaal medium met meegeleverde aanvulling, volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 50 U/mL penicilline-streptomycine. Merk op dat de formulering gevoelig voor licht en hoge temperaturen is. Het supplement ontdooien en opwarmen van de media bij kamertemperatuur (RT), beschermd tegen licht. Gebruik het aangevuld hPSC medium binnen twee weken na de datum van de suppletie.
- Jas 24-Wells-platen met menselijke recombinante laminin-521 (LN-521). Gebruik voor de eerste feeder-gratis (FF) passage, LN-521 bij een concentratie van 1,09 µg/cm2, en op 0.55 µg/cm2 voor de volgende passages. De voorgestelde LN-521 concentraties dienen als uitgangspunt voor succesvolle FF cultuur maar kunnen worden verlaagd.
- Overdracht van de hPSC naar FF cultuur op LN-521
- Vooraf warm alle benodigde materialen en reagentia aan RT de laminaire flow Hood.
- Passage hPSCs van standaard cultuur systeem op feeder lagen (bijvoorbeeld geïnactiveerd menselijke voorhuid (hFF) of muis embryonale fibroblasten), of andere FF cultuur systemen met behulp van standaard methodologie. HPSC kolonies gekweekt op hFF feeder cellen kunnen bijvoorbeeld worden ontleed om kleine stukjes met een scalpel en de stukken dan los met een naald tip. Menselijke PSC's gekweekt met behulp van FF cultuur systemen kunnen worden overgedragen met behulp van de cluster passaging methode met of zonder voorafgaande enzym behandeling.
- Verwijder de LN-521 coating oplossing uit de 24-putjes en voeg 1 mL voorverwarmde hPSC medium per putje.
Opmerking: De putten te droog als LN-521 zal inactivering bij drogen niet toegestaan. - De kolonie stukken/cel clusters overbrengen in LN-521 gecoat 24-putten in hPSC medium met een pipet. Overdracht 20 – 30 kolonie stukken per putje, het vermijden van overbevolking van de putten.
- Het medium vervangen met 1 mL van hPSC medium, wordt de dag na de overdracht en elke andere dag daarna. De culturen zijn klaar voor passaging 3-4 dagen later als hPSCs uitgegroeid uit tot kolonies met een gladde, ongedifferentieerde morfologie. Ter referentie, Zie figuur 1B (eerste afbeelding). Voor de eerste passage van de FF, de koloniën niet mag groeien tot een volledig confluente enkelgelaagde, maar de culturen moeten worden gepasseerd wanneer kolonies een geschatte grootte van 1 mm bereiken.
- Passaging en onderhoud van FF hPSC cultuur
- Vooraf warm alle benodigde materialen en reagentia aan RT de laminaire flow Hood.
- Passage van de tweede FF passage vanaf het FF hPSCs wanneer de cultuur confluentie 80-100% heeft bereikt. Passage FF hPSCs naar nieuwe LN-521 gecoat 24-Wells-platen met eencellige passaging twee keer per week (op maandag en donderdag) om hoge kwaliteit culturen met ongedifferentieerde morfologie en om weekend-vrije voeding regime. Voor meer informatie, gelieve te verwijzen naar18,24,25.
- Spoel de FF hPSCs tweemaal met 1 mL van de 1 x DPBS zonder Ca2 + en Mg2 +.
- Loskoppelen FF hPSCs met xeno-vrije trypsine-EDTA (specifiek TrypLE Selecteer enzym) door drachtige 500 µL per putje bij 37 ° C, 5% CO2. Voor optimale incubatietijd, kunt u de cellen te ronden maar niet om los te maken. Dit duurt meestal 3 min bij 37 ° C, 5% CO2 (niet hoger dan 5 min).
- Verwijderen van xeno-vrije trypsine-EDTA en onmiddellijk vergroten met 500 µL per putje van gedefinieerde trypsine-remmer.
- Loskoppelen FF hPSCs door voorzichtig, maar grondig pipetteren om te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel. Spoel de FF hPSC suspensie door een zeef van 40 µm cel in een 15 mL conische centrifugebuis met voorverwarmde hPSC medium.
- Was de putjes met 1 mL van hPSC medium en wassen medium aan de conische centrifuge tube van 15 mL toevoegen.
- De eencellige schorsing gedurende 5 minuten bij 300 x g centrifugeren, gecombineerd de cel pellet en resuspendeer in 1 mL voorverwarmde hPSC medium.
- De cellen met de hemocytometer of teller van geautomatiseerde cel tellen.
- Verwijder de LN-521 coating oplossing (0.55 µg/cm2) uit de 24-putjes en voeg hPSC medium zoals 1.2.3.
- Plaat FF hPSCs op 0.55 µg/cm2 LN-521 gecoat 24-putten op een celdichtheid van 40.000-50.000 cellen/cm2.
- Medium vervangen door verse hPSC medium de dag na de passaging, en elke andere dag daarna met uitzondering van zondag.
- De cellen zijn klaar om te worden gebruikt voor differentiatie 3-4 dagen na passaging, wanneer de cultuur heeft bereikt > 85% confluentie. Om te zorgen voor de hoge kwaliteit van de hPSCs, verwijzen naar karakteriseringsmethoden in detail beschreven in eerdere werken18,24,25. Het is aanbevolen om alleen cultuur hPSCs tot celkarakteristieken 15 in het systeem van de FF met eencellige passaging om te voorkomen dat karyotypic veranderingen. Gebruik alleen hoge kwaliteit, ongedifferentieerde hPSCs als grondstof voor differentiaties.
2. gestuurde differentiatie en cryopreservatie van hPSC afkomstige LESCs
- Voorbereidingen
- Xeno-vrij basale inductie medium (basale inductie medium) bereiden: Supplement Dulbecco van Eagle's medium (specifiek KnockOut DMEM) bewerkt met 15% serum xeno-vrije vervanging (spesifically CTS KnockOut SR XenoFree), 2 mM L-glutamine, 0.1 mM 2 - mercaptoethanol, 1% niet-essentiële aminozuren en 50 U/mL penicilline-streptomycine. Gebruik de basale inductie medium binnen twee weken.
- Media voorbereiden hoornvlies inductie in de cultuur van de schorsing.
- Dag 1: Aanvulling basale inductie medium met 5 μM blebbistatin.
- Dag 2: Aanvulling basale inductie medium met 10 µM SB-505124 en 50 ng/mL menselijke fundamentele fibroblast groeifactor (bFGF).
- Dag 3-4: Supplement basale inductie medium met 25 ng/mL bot morfogenetische eiwit 4 (BMP-4).
- Hoornvlies epitheel differentiatie medium (differentiatie medium, specifiek CnT-30) voorbereiden aanhangend cultuur: supplementen aan basale medium volgens de instructies van de fabrikant toevoegt 50 U/mL penicilline-streptomycine en.
Opmerking: Differentiatie middellange formulering is gevoelig voor licht. Gebruik het medium aangevuld differentiatie binnen 6 weken na de datum van de suppletie. - Jas van 100 mm weefselkweek gerechten voor aanhangend differentiatie (zie stap 2.3) met een mengsel van 5 µg/cm2 menselijke placenta collageen type IV (col IV) en 0,5 µg/cm2 LN-521 verdund in 1 x DPBS met Ca2 + en Mg2 +, in een totaal coating van 5 mL per schotel. Bereiden en bewaar de coatings met col IV en LN-521 zoals beschreven in 1.1.1.3.
-
Stap I: hoornvlies inductie in schorsing cultuur
- Vooraf warm alle benodigde materialen en reagentia aan RT de laminaire flow Hood.
- Loskoppelen FF hPSCs eencellige schorsing met xeno-vrije trypsine-EDTA volgens de instructies in de stappen 1.3.2.1–1.3.2.6. Cellen tellen en distribueren van 2-3 x 106 cellen per laag bijlage 6-well plaat goed, in het totaal volume van 3 mL van basale inductie medium aangevuld met 5 μM blebbistatin ertoe EB vorming overnachting bij 37 ° C, 5% CO2 (dag 1).
- Verwijder het medium op de volgende dag (dag 2), en vervangen door 3 mL van basale inductie medium aangevuld met 10 µM SB-505124 en 50 ng/mL bFGF.
- Op de volgende twee dagen (3-4 dagen), verwijder het medium en vervang door 3 mL van basale inductie medium aangevuld met 25 ng/mL BMP-4.
- Stap II: Hoornvlies differentiatie in aanhangend cultuur
- Vooraf warm alle benodigde materialen en reagentia aan RT de laminaire flow Hood.
- Op dag 5, plaat de EBs neer op 100 mm weefselkweek gerechten bekleed met 5 µg/cm2 col IV en 0,5 µg/cm2 LN-521.
- Verwijder de coating oplossing uit 100 mm weefselkweek gerechten en voeg 10 mL van voorverwarmde differentiatie medium per schotel.
Opmerking: De gerechten te droog als LN-521 zal inactivering bij drogen niet toegestaan. - Overdracht van het EBs van één 6-well plaat goed naar twee tot drie 100 mm weefselkweek gerechten (ongeveer 50 EBs per cm2) door pipetteren. De EBs gelijkmatig verdelen door zacht te schudden.
- Verwijder de coating oplossing uit 100 mm weefselkweek gerechten en voeg 10 mL van voorverwarmde differentiatie medium per schotel.
- De cellen in aanhangend cultuur bij 37 ° C, 5% CO2, ter vervanging van het medium met 10 mL verse differentiatie voedingsbodem driemaal per week (op maandag, woensdag en vrijdag) voor de komende 2,5-3 weken te handhaven. Controleer de cellen regelmatig voor het ontstaan van juiste epitheliale morfologie met behulp van de fasecontrastmicroscoop.
- Stap III: Cryo-banking hPSC afkomstige LESCs
- Vooraf warm alle benodigde materialen en reagentia aan RT in de laminaire flow motorkap, met uitzondering van de cryopreservatie medium dat vooraf moet worden gekoeld.
- Ontkoppel hPSC afkomstige LESCs met xeno-vrije trypsine-EDTA en tellen van de cellen, zoals geïnstrueerdg voor FF hPSCs in stappen 1.3.2.1–1.3.2.6, maar met behulp van differentiatie medium.
Opmerking: Voor hPSC afkomstige LESCs, optimale incubatietijd met xeno-vrije trypsine-EDTA is langer (ongeveer 5 min). Gebruik 3 mL trypsine-EDTA xeno-vrije en gedefinieerde trypsine remmer per schotel van 100 mm. - Na het tellen van de cellen, herhaal centrifugeren gedurende 5 min. 300 x g gecombineerd medium en resuspendeer de pellet cel in vooraf gekoeld, xeno-vrije hPSC cryopreservatie medium. Pipetteer de single cell schorsing in cryotubes zodat elke cryotube bevat 0,5 tot 1 x 106 cellen in 1 mL cryopreservatie medium.
- Plaats de buizen in een bevriezing container en overdracht onmiddellijk (binnen 5 min) tot-80 ° C's nachts.
- De volgende dag, door de buizen te overbrengen in vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
- Stap IV: Ontdooien de cryopreserved hPSC-LESCs
- Jas voorafgaand aan ontdooien, de gerechten/Wells-platen met 5 µg/cm2 col IV en 0,5 µg/cm2 LN-521.
- Vooraf warm alle benodigde materialen en reagentia aan RT de laminaire flow Hood.
- Verwijder de coating oplossing uit gerechten/putten en toevoegen van de juiste hoeveelheid voorverwarmde differentiatie medium.
Opmerking: De gerechten te droog als LN-521 zal inactivering bij drogen niet toegestaan. - Ontdooi de cellen snel bij RT en onmiddellijk de celsuspensie overbrengen in een 15 mL conische centrifugebuis met 5 mL van voorverwarmde differentiatie medium.
- Centrifugeer de celsuspensie voor 5 min 300 x g gecombineerd en resuspendeer de pellet in differentiatie middellange tot elk cryopreservatie medium verwijderen.
- Plaat van de cellen op gerechten/putten bekleed met 5 µg/cm2 col IV en 0,5 µg/cm2 LN-521, in differentiatie medium bij een dichtheid van 40.000-50.000 cellen/cm2. Het handhaven van de cellen bij 37 ° C, 5% CO2, ter vervanging van de differentiatie gemiddeld drie keer per week.
3. fenotypering van hPSC afkomstige LESCs
- Kwalitatieve immunofluorescentie analyse
- Jas voor immunofluorescentie, 24 - of 12-well putjes van de plaat met 5 µg/cm2 col IV en 0,5 µg/cm2 LN-521 en plaat/dooi hPSC-LESCs in differentiatie medium bij een dichtheid van 40 000-50 000 cellen/cm2.
- Wanneer de culturen hebt bereikt confluentie, herstellen de cellen met de 4% paraformaldehyde (PFA): de putjes tweemaal met 1 x DPBS zonder Ca2 + en Mg2 +wassen en incubeer 15-20 min met 4% PFA op RT. Daarna wassen tweemaal met 1 x DPBS te verwijderen elke PFA-residuen. Gebruik 0,5-1 mL van de oplossingen per putje.
Opmerking: Vaste cellen kunnen worden opgeslagen in 1 x DPBS bij 4 ° C gedurende maximaal één week vóór de kleuring.
Let op: PFA is giftig en corrosief. PFA verwerken in een zuurkast en Draag beschermende kleding, handschoenen en oogbescherming. - Gecombineerd 1 x DPBS en permeabilize van celmembranen door Triton X-100 in 1 x DPBS voor 10-15 min met 0,1% het broeden.
- 0,1% Triton X-100 en blok niet-specifieke antilichaam bandplaatsen gecombineerd door broeden voor 1 h met 3% bovien serumalbumine (BSA) in 1 x DPBS op RT. voorbereiden primair antilichaam verdunningen in 0,5% BSA in 1 x DPBS.
Opmerking: Zie tabel 1 voor aanbevolen primaire antilichamen. - 3% BSA gecombineerd en incubeer met adequaat verdunde primair antilichaam 's nachts bij 4 ° C.
- Was de putjes goed 3 x voor 5 min met 1 x DPBS. Maak secundair antilichaam verdunningen in 0,5% BSA in 1 x DPBS.
Opmerking: Zie tabel 1 voor aanbevolen secundaire antilichamen. - 1 x DPBS gecombineerd en incubeer met passende, op de juiste manier verdunde secundair antilichaam voor 1 h op RT, beschermd tegen licht.
Opmerking: Vanaf deze stap op, houd de monsters beschermd tegen licht om te voorkomen dat vervagen van de fluorescente kleurstoffen. - Was de putjes goed 3 x voor 5 min met 1 x DPBS en tenslotte counterstain kernen met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en zware montering met fluorescentie montage media. DAPI kan afzonderlijk gebruikt volgens de aanwijzingen van de fabrikant of opgenomen in het medium van de montage. Plaats Ronde coverslips (diameter 19 mm en 13 mm voor 12 - en 24-well platen, respectievelijk) in elk putje. Volg de instructies van de fabrikant met betrekking tot het drogen en opslag van de gemonteerde monsters.
- Het imago van de gekleurde cellen met een fluorescente microscoop.
- Kwantitatieve immunofluorescentie analyse
- Cytospin monsters van hPSC afkomstige LESCs op object bril voor te bereiden.
- Ontkoppel hPSC afkomstige LESCs met xeno-vrije trypsine-EDTA en tellen van de cellen, volgens de instructies in stap 2.4.2.
- Na het tellen, vooraf gekoeld 1 x DPBS en centrifuge voor 5 min op 300 x g. aanpassen het monstervolume en cel-concentratie overeenkomstig de instructies van de fabrikant van de gegeven cytocentrifuge, bijvoorbeeld 50.000-100.000 cellen toevoegen in een monstervolume van 150 µL.
- Spin cellen tot object bril met een cytocentrifuge bijvoorbeeld 5 min op 28 x g en moeilijke situatie onmiddellijk voor 15-20 min met 4% PFA in 1 x DPBS op RT. Raadpleeg de handleiding van de gegeven cytocentrifuge voor de aanbevolen spinnen tijd en snelheid.
- Ga verder met de kleuring van de cytospin monsters, zoals beschreven in stappen 3.1.3–3.1.8 gebruik vloeibare blocker pen omringen de monsters met een hydrofobe cirkel te voeren de kleuring in een druppel voor de economische praktijk. Wast kunnen worden uitgevoerd in containers met de houders van de dia, met het oog op een efficiënt afvoeren van overtollig antilichamen en minimale achtergrondkleuring. Counterstain kernen met DAPI en monteer de gebeitst monsters met fluorescentie montage media, die betrekking hebben op met coverslips. Volg de instructies van de fabrikant van over drogen en opslag van de gemonteerde monsters.
- 5 – 10 opnamen per monster van willekeurig geselecteerde locaties met bijvoorbeeld 10 X vergroting van een fluorescentie Microscoop.
- Schat het percentage positief gekleurde cellen ten opzichte van de totale (DAPI positief) cellen, bijvoorbeeld met ImageJ Image Processing and Analysis softwaretools (https://imagej.nih.gov/ij/). Bij voorkeur analyseren > 500 cellen per monster.
- Open de afbeelding om te worden geanalyseerd in ImageJ software. Het dupliceren van het beeld en het filter met de Gaussian blur standaard verwijderen van ruis.
- Maak een drempel. Aanpassen van de drempelwaarden aan optimale selectie van positief gebeitst celkernen, en toe te passen. De gedupliceerde afbeelding wordt nu omgezet naar een binaire weergave.
- Proces de binaire image met binaire processing tools "Vul gaten" en "Stroomgebied" zal automatisch afzonderlijke samengevoegde gebieden vertegenwoordigen van enkele kernen.
- De "Analyze deeltjes" hulpprogramma gebruiken om automatisch lijst regio's van belangen (ROIs) naar de ROI manager venster, die wordt geopend bij het toepassen van de opdracht. Sluit de binaire beeldoverdracht.
- Visualiseer de ROI van de oorspronkelijke afbeelding door te kiezen voor "Toon alle" in de Manager van de ROI. Bevestigen van de juiste keuze van gebeitst celkernen en indien nodig handmatig verwijderen en toevoegen van afzonderlijke selecties.
- Cytospin monsters van hPSC afkomstige LESCs op object bril voor te bereiden.
- Stroom cytometry analyse
- Om te bevestigen de p63α expressie niveaus, vlek de cellen voor stroom cytometry.
- Ontkoppel hPSC afkomstige LESCs met xeno-vrije trypsine-EDTA en tellen van de cellen, volgens de instructies in stap 2.4.2.
- Wash de cellen tweemaal met 1 mL pre gekoeld 1 x DPBS en Centrifugeer gedurende 5 min op 300 x g. Fix en permeabilize met kant-en-klare fixatie/permeabilization oplossing voor 20 min bij 4 ° C. Daarna wassen de cellen tweemaal met 1 mL pre gekoeld 1 x wassen buffer permeabilizing.
Opmerking: Vanaf deze stap op, houd de cellen bij 4 ° C of op ijs, tenzij anders aangegeven. - Let op: Fixatie/permeabilization oplossing bevat 4,2% formaldehyde. Omgaan met de gevaarlijke oplossing in een zuurkast en Draag beschermende kleding, handschoenen en oogbescherming.
- Verdeel monsters in polypropyleen buizen van 5 mL. Elk monster moet bevatten 100.000-200.000 cellen en het monstervolume moet worden aangepast aan ongeveer 100 µL van het 1 x wassen buffer.
- Voeg 2 µL van fluorescerende geconjugeerd p63-α FACS antilichaam (Zie voor aanbevolen antilichaam, tabel van apparatuur en materiaal) in het monster buizen. Laat één monster onbevlekt om te dienen als negatieve controle. Vortex de monsters en incubeer gedurende 1 h op RT, beschermd tegen licht.
- Spoel de cellen tweemaal met 1 mL pre gekoeld 1 x wassen buffer en ten slotte resuspendeer de pellets met 300 µL van buffer. Bewaar de buizen op ijs, beschermd tegen licht.
- Analyseer de monsters met een stroom-cytometer. Het gebruik van het voorbeeld onbevlekt negatieve controle voor de juiste celpopulatie gating, en voor het uitsluiten van het fluorescerende achtergrond signaal. Analyseren van minimaal 10.000 p63-α-cellen gekleurd. Raadpleeg de gebruikershandleiding van de gegeven stroom cytometer voor gedetailleerde technische uitvoering.
- Om te bevestigen de p63α expressie niveaus, vlek de cellen voor stroom cytometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Van hPSCs naar hPSC-LESCs
Het hele proces van het inducerende differentiatie van FF hPSCs te cryostoring hPSC-LESCs duurt ongeveer 3,5 weken. Schematisch overzicht van de methode van de differentiatie markeren zijn belangrijke stappen is in figuur 1Agepresenteerd. Figuur 1B toont de typische morphologies van de cel populaties in verschillende fasen van het protocol. De gegevens worden verkregen met Regea08/017 hESC lijn en UTA.04607.WT hiPSC lijn, zowel afgeleid en gekarakteriseerd aan de Universiteit van Tampere, Finland, als eerder beschreven26,27,28.
Op LN-521 in hPSC medium vormen de ongedifferentieerde, hoge kwaliteit FF hPSCs eerst verschillende kolonies met scherpe randen, die naar homogene monolayers bij samenvloeiing (figuur 1B, eerste afbeelding samenvoegen). Verschillende individueel afgeleide en genetisch verschillende hESC en hiPSC lijnen werden met succes aangepast en gekweekt met dit systeem. De bevolking van FF hPSC vermenigvuldigen ongeveer 3 katernen binnen elke passage, voorzien in krachtige middelen voor het genereren van xeno- en feeder-gratis grondstof voor differentiaties25. De inductie van de 24 h in EB medium meestal produceert een suspensie van strakke, regelmatige EBs van verschillende grootte (figuur 1B, tweede afbeelding). Tijdens de oppervlakte ectodermal inductie in suspensie (dag 2 – 4), moet de morfologie EB niet drastisch wijzigen. Koloniale uitgroei verschijnt kort nadat de EBs zijn vergulde op col IV/LN-521 combinatie matrix in differentiatie medium (figuur 1B, derde en vierde beelden), en de cellen binnen 21 – 25 dagen van differentiatie confluente homogene lagen met vormen veelhoekige morfologie die typisch zijn voor epitheliale cellen (figuur 1B, vijfde beeld). De cellen kunnen dan worden cryostored voor later gebruik. Levensvatbaarheid en morfologie zijn goed bewaard gebleven na het ontdooien de hPSC-LESCs (figuur 1B, laatste afbeelding).
Meestal levert 3 x 106 FF hPSCs verguld aan een enkele plaat 6-well genoeg EBs te worden vergulde voor aanhangend cultuur in 2 – 3 cel cultuur gerechten (100 mm). Elke schotel van 100 mm, kunnen 1 tot 1.5 x 106 cellen worden geoogst voor cryobanking door dag 22 – 25 van differentiatie. Gemiddeld, genereert elke ongedifferentieerde FF hPSC 0.7 cellen per dag 25 (Figuur 2).
Validatie van hPSC afkomstige LESCs
Bij gebrek aan specifieke LESC marker proteïnen, is de juiste cel fenotype bevestigd met een aantal markeringen die aantonen dat de afname van de uitdrukking van de pluripotent geassocieerde eiwitten en verhoogde expressie van erkende LESC markers. Op dag 24 van differentiatie, de overgrote meerderheid van de uitdrukkelijke gepaarde hPSC afkomstige LESCs vak eiwit PAX6 (PAX6), de belangrijke regulator van de ontwikkeling van het oog, evenals de p63α, de bekende LESC markering. De afgeknotte p63-isovorm-ΔNp63 is mede uitgedrukt in de meeste van de p63α-positieve cellen, bevestigen de meest hoornvlies-specifieke ΔNp63α-positieve cel fenotype. Basale epitheliale markeringen en vermeende LESC markers cytokeratin (CK) -15 en CK-14 worden gedeeltelijk uitgedrukt overwegende dat pluripotente stamcel marker OCT3/4 en volwassen hoornvlies epitheliale marker CK-12 niet aantoonbaar op dit punt. Dit betekent differentiatie van FF hPSCs richting de unipotent limbal epitheliale progenitorcellen, maar niet nog terminal differentiatie in volwassen hoornvlies epitheliale cellen. (Figuur 3A) De hPSC-LESCs behouden met succes hun fenotype na herstel van cryostorage (gegevens vergelijkbaar met figuur 3A).
Na 24 dagen van differentiatie, ΔNp63 werd uitgedrukt in 66,2% (n = 33, SD 9,3%) van Regea08/017 hESC-LESCs, en met 65,7% (n = 10, SD 4,1%) UTA.04607.WT hiPSC-LESCs (gekwantificeerd van cytospin monsters, figuur 3B). Na herstel van cryostorage, 82,2% (n = 10, SD 5,7%) van hESC-LESCs en 90,5% (n = 10, SD=3.7%) van hiPSC-LESCs uitgedrukt ΔNp63 (gekwantificeerd aan goed platen op dag 26 – 28: figuur 3B).
De expressie p63α werd verder bevestigd met stroom cytometry analyse voor Regea08/017 hESC-LESCs. Op dag 25 van differentiatie waren 62% van de vers gedifferentieerde hPSC-LESCs positief voor p63α. Twee dagen na herstel van cryostorage (dag 28 in totaal), waren 81% van de cellen p63α-positieve (Figuur 3 c).
Figuur 1: Schematische afbeelding van het protocol van de differentiatie hPSC-LESC (A) en de typische cel morphologies waargenomen in verschillende fasen van het proces (B). EBs worden gevormd door een enkele celsuspensie van hoge kwaliteit, ongedifferentieerde hPSCs tijdens de eerste 24 h. drie-daagse klein molecuul inductie naar oppervlakte ectoderm in suspensie wordt gevolgd door aanhangend differentiatie fase. Dag 24 van differentiatie Toon de meerderheid van de cellen typische LESC-achtige morfologie. Representatieve beelden getoond voor Regea08/017 hESC lijn vóór en tijdens de differentiatie. Zwarte schaal bar = 200 µm, geldig voor alle afbeeldingen in het deelvenster. Afkortingen: Blebb.: blebbistatin, SB: SB-505124 klein molecuul remmers, bFGF: fundamentele fibroblast groeifactor, BMP-4: bone morfogenetische eiwit 4, LN-521: menselijke recombinante laminin 521, col IV: menselijke placenta collageen type IV, hPSC: menselijke pluripotente de cel van de stam, EB: embryoid lichaam, LESC: limbal epitheliale cellen van de stam. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: verwachte cel opbrengst. Boxplots weergegeven: het aantal cellen verkregen voor cryostoring op dag 22-25 van differentiatie, gedeeld door aantal ongedifferentieerde hPSCs vergulde voor EB vorming stap op dag 0. Op gemiddelde 0.72 (SD 0.4) cellen werden geproduceerd van elke pluripotente Regea08/017 hESC, terwijl 0.78 (SD 0.67) cellen werden geproduceerd van elke UTA.04607.WT hiPSC. n: aantal differentiatie experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Verwacht fenotype van hPSC afkomstige LESCs. Immunofluorescentie antilichaam labeling (A) weergegeven: uniforme expressie van oog ontwikkeling regulator PAX6 en erkende LESC markers p63α en haar ΔNp63 isovorm, evenals de twee andere voorgestelde LESC markeringen - CK15 en 14. Pluripotent marker OCT3/4 en volwassen hoornvlies epitheliale marker CK-12 zijn negatief. Vertegenwoordiger als afbeeldingen weergegeven voor Regea08/017 hESC-LESCs op dag 24 van differentiatie. Schaal bars = 100 µm. (B) ΔNp63 cel geteld vanaf vers gedifferentieerd en cryostored hPSC-LESCs toont aan dat de cellen niet alleen behouden, maar tonen verhoogde ΔNp63 expressie na cryostorage. Cel tellen Toon resultaten > 65% van de vers gedifferentieerde hPSC-LESCs positief voor ΔNp63 vóór de cryobanking procedure, gekleurd en > 80% na succesvol herstel. n = aantal aparte differentiatie experimenten (minimaal 600 cellen geteld per steekproef en > 1600 cellen per tijdstip) (C) stroom cytometry analyse waaruit blijkt dat 62% van de vers gedifferentieerde hPSC-LESCs en 81% van de ontdooide cellen positief voor p63α, bevestiging van de cel tellen resultaten voor lijn Regea08/017. * geven in B-C aan ontdooide cellen. Rode histogram voor positief monster en zwart voor negatief (onbevlekt) monster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Antilichaam | Host | Verdunning |
| Primaire antilichamen voor als | ||
| PAX6 | konijn | 1:200 |
| p63α | muis | 1:200 |
| ΔNp63α | konijn | 1:200 |
| CK-15 | muis | 1:200 |
| CK-14 | muis | 1:200 |
| CK-12 | geit | 1:200 |
| OCT3/4 | geit | 1:200 |
| Secundaire antilichamen voor als | ||
| Alexa Fluor 568 anti-geit Ig | ezel | 1:800 |
| Alexa Fluor 568-antimuis Ig | ezel | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 anti-konijn Ig | ezel | 1:800 |
| Alexa Fluor 488-antimuis Ig | ezel | 1:800 |
Tabel 1: aanbevolen van primaire en secundaire antilichamen gebruikt voor immunofluorescentie (IF) etikettering van hPSC afkomstige LESCs. Zie Tabel van materialen voor fabrikanten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het verwachte resultaat van dit protocol is de generatie van het succesvolle en robuuste van LESCs uit een enkele celsuspensie van FF hPSC binnen ongeveer 3,5 weken. Zoals hoornvlies epitheel oppervlakte ectoderm €29 ontwikkelt, wordt de eerste stap van het protocol bedoeld om sturing van hPSCs naar deze bloedlijn. Een korte 24u inductie met transformeren groeifactor bèta (TGF-β) antagonist SB-505124, en bFGF worden gebruikt voor het opwekken van ectodermale differentiatie, gevolgd door 48 h mesodermal BMP-4 cue om te duwen van de cellen naar oppervlakte ectoderm. De volgende stap van het aanhangend differentiatie op col IV/LN-521 combinatie matrix samen met chemisch gedefinieerde differentiatie medium wordt gebruikt om verdere differentiatie naar LESCs.
Hoge kwaliteit van de grondstof (de FF hPSCs) is essentieel voor succesvolle differentiatie. Alleen FF hPSC culturen met in de buurt van de samenvloeiing en bijna 100% van de ongedifferentieerde fenotype moeten worden gebruikt. Regelmatige hPSC karyotypering wordt aanbevolen, omdat eencellige passaging hPSCs kan predisponeren tot karyotypic afwijkingen die tot groei en differentiatie voordelen30 leiden. Langdurige blootstelling aan trypsine kan leiden tot onvoldoende EB vorming of hPSC dood. Het protocol werd getest met vijf individueel afgeleid en genetisch verschillende hPSC lijnen, zowel hESC als hiPSC lijnen. Er was geen noodzaak voor cel lijn specifieke wijzigingen in de klein molecuul concentraties of inductie tijden. Echter, tijdens de eerste optimalisatie van het protocol, buitensporige celdood of het uiterlijk van cellen met een fibroblastic, neuronale of andere morfologie aangegeven differentiatie aan ongewenste lineages. In een dergelijk geval kan de methode vereist "fine-tuning". De cultuur vaartuig indelingen vormen een uitgangspunt en opgeschaalde kunnen worden van de aanbevolen grootte.
Het gehele protocol uit hPSC cultuur bij LESC differentiatie en cryopreservatie wordt gedefinieerd, waardoor gemakkelijk overgang naar Good Manufacturing Practice (GMP) voor de productie van cel therapie producten. Zoals de commerciële media en reagentia ondergaan robuuste ontwikkeling, fabricage en kwaliteitscontroleprocedures, bieden ze een consistente, uniforme kwaliteit platform voor hPSC cultuur en differentiaties. De gedefinieerde voorwaarden minimaliseren-charges-variatie, die een voordeel ten opzichte van bestaande hPSC-LESC differentiatie protocollen10,11,12,13,14, biedt 20 , 22 , 23. het snelle en relatief eenvoudige protocol biedt ook een voordeel ten opzichte van driedimensionale hoornvlies organoids die moeilijk te standaardiseren in cellijnen en laboratoria, en vereisen krachtige methoden voor het zuiveren van de gewenste celtypes31 ,-32. Daarnaast biedt het zeer efficiënte protocol robuuste middelen voor de productie van LESCs voor onderzoeksdoeleinden, bijvoorbeeld ziekte modellering, genetische manipulatie, drug screening en toxicologische testen. Bovendien kan het platform worden gemakkelijk verfijnd voor differentiatie van andere soorten oogbeschadigingen en/of epitheliale cellen zoals retinale pigment epitheliale cellen (RPE cellen)25.
Succesvolle limbal cel substitutietherapie vereist slechts een paar duizend p63-positieve LESCs4, per oog, maar kwaliteitsborging vereist extra-cel populaties en daarom grootschalige productie. Cryobanking kunt voorbereiding van voorraden beschikbaar cel voor transplantatie, alsook voor de kwaliteit en veiligheidstesten. Verder, de zuiverheid hPSC-LESC verbetert na het cryostoring, en verder na passaging en langdurige cultuur25, zoals voorgesteld door de verhoogde ΔNp63 expressie.
Kortom, deze robuuste methode genereert ΔNp63α-positieve cellen van hPSCs binnen 3,5 weken xeno- en voorwaarden feeder cel-vrije cultuur. De cel kweekmethoden gepresenteerde inschakelen productie van kwalitatief hoogwaardige LESCs voor oogbeschadigingen en/of mobiele therapie te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De studie werd ondersteund door de Academie van Finland (subsidie nummer 297886), het programma van de menselijke reserveonderdelen van Tekes, het Fins financiering agentschap voor technologie en innovatie, het Finse oog en weefsel Bank Foundation en de Finse Cultural Foundation. De auteurs bedanken het biomedische laboratorium technici Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt en Outi Heikkilä voor uitstekende technische bijstand en de bijdrage aan de celcultuur. Professor Katriina Aalto-Setälä is erkend voor het verstrekken van de gebruikte hiPSC-lijn en de BioMediTech Imaging Core faciliteit voor het verstrekken van uitrusting voor fluorescentie imaging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
- Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
- Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
- Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
- Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
- Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
- Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
- Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
- Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
- Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
- Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).
- Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
- Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
- Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
- Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
- Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).
- Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).
- Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4 (2017).
- Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
- Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).
- Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).
- Ali, R. R., Sowden, J. C.
- International Stem Cell Initiative,, et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286 (2017).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
