Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

فعالة وقابلة للتمايز الموجهة متوافقة سريرياً القرنية حوفي طلائي الخلايا الجذعية من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

Published: October 24, 2018 doi: 10.3791/58279
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere
* These authors contributed equally

Summary

ويدخل هذا البروتوكول أسلوب خطوتين بسيطة لتمييز الخلايا الجذعية الظهارية حوفي القرنية من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية تحت ظروف خالية من خلية ثقافة كرة-وتغذية. أساليب الثقافة الخلية المعروضة هنا تمكين إنتاج خلايا نوعية السريرية المنطبق على خلية القرنية العلاج باستخدام فعالة من حيث التكلفة، وعلى نطاق واسع.

Abstract

القرنية حوفي طلائي الخلايا الجذعية () المسؤولة عن تجديد ظهارة القرنية باستمرار، وثم المحافظة على التوازن القرنية والوضوح البصري. الخلية الجذعية pluripotent البشرية (هبسك)-المشتقة توفير مصدر خلية واعدة للعلاج باستبدال الخلايا القرنية. شروط الثقافة والتمايز غير معرف، إكسينوجينيك يؤدي التباين في نتائج البحث وتعوق ترجمة المستمدة من هبسك المداواة السريرية. يوفر هذا البروتوكول أسلوب قابل لإعادة الإنتاج والكفاءة للتمايز هبسك تحت ظروف خالية من خلية كرة-والتغذية. أولاً، ثقافة أحادي الطبقة هبسك غير متمايزة في المؤتلف laminin-521 (LN-521) والمتوسطة هبسك محددة بمثابة أساس لإنتاج قوية انطلاق المواد عالية الجودة للاختلاف. وثانيا، أسلوب المفاضلة هبسك سريعة وبسيطة غلة السكان ليسك في 24 يوما فقط. ويشمل هذا الأسلوب التعريفي الأدمة سطحية أربعة أيام في تعليق مع جزيئات صغيرة، تليها مرحلة الثقافة ملتصقة رابعا LN-521/الكولاجين تركيبة المصفوفة في متوسطة التمايز الظهارة القرنية محددة. كريوستورينج والتمايز الموسعة كذلك ينقي السكان الخلية وتمكن المصارف الخلايا بكميات كبيرة لخلية العلاج بمنتجات. هبسك-عالية الجودة الناتجة عن تقديم استراتيجية علاج رواية محتملة لإعادة بناء سطح القرنية لعلاج نقص الخلايا الجذعية حوفي (جلبتين).

Introduction

يسمح للضوء بالدخول الشبكية القرنية شفافة على سطح العين وتوفر معظم القوة الانكسارية للعين. يتم إعادة إنشاء الطبقة الأبعد، ظهارة القرنية الطبقية، بشكل مستمر بالخلايا الجذعية حوفي الظهارية (). الموجودة في الطبقة القاعدية لمنافذ حوفي1،مفرق كورنيوسكليرال2. ليسكس تفتقر إلى علامات محددة وفريدة من نوعها، حيث هويتهم يتطلب إجراء تحليل أكثر شمولاً لمجموعة من علامات المفترضة. P63 عامل النسخ الظهارية، ولا سيما ن لا شفاء منها مبتوراً نسخة عن isoform ألفا من p63 (ΔNp63α)، وقد اقترح كذات صلة إيجابية ليس علامة3،4. شعبة غير متماثلة من ليسكس يسمح لهم بتجديد نفسها، ولكن أيضا إنتاج ذرية التي تهاجر سينتريبيتالي والأسفل. كما الخلايا تقدم نحو سطح القرنية أنهم تدريجيا تفقد بهم ستيمنيس وأخيراً لا شفاء منها التفريق للخلايا الحرشفية السطحية التي فقدت بشكل مستمر من سطح القرنية.

الأضرار بأي من طبقات القرنية يمكن أن يؤدي إلى إعاقة بصرية شديدة، وعيوب القرنية وبالتالي واحدة من الأسباب الرئيسية لفقدان البصر في جميع أنحاء العالم. في عوز الخلايا الجذعية حوفي (جلبتين)، ليمبوس دمرها المرض أو الصدمة مما يؤدي إلى كونجونكتيفاليزيشن وعتامه سطح القرنية وفقدان الرؤية5،6لاحقاً. ويقدم العلاج استبدال الخلية باستخدام الطعوم حوفي ذاتي أو متمكنة استراتيجية علاج للمرضى الذين يعانون من جلبتين4،7،،من89. بيد أن حصاد ترقيع ذاتي يحمل خطر المضاعفات على العين السليمة والأنسجة المانحة هو نقص في المعروض. يمكن أن الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس)، على وجه التحديد في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسكس) والخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس)، بمثابة مصدر غير محدود من أنواع الخلايا سريرياً ذات الصلة، بما في ذلك الخلايا الظهارية القرنية. ولذلك، المستمدة من هبسك (هبسك-) تمثل مصدرا خلية جديدة جذابة للعلاج باستبدال خلايا العين.

تقليديا، قد اعتمدت أساليب الثقافة هبسك غير متمايزة وبروتوكوليها التمايز إلى ليسكس على استخدام خلايا تغذية غير معرف أو الأمصال الحيوانية، وسائل الإعلام مشروطة أو أغشية السلي10،11، 12 , 13 , 14 , 15-في الآونة الأخيرة، أدت الجهود المبذولة في اتجاه أكثر أماناً خلية العلاج بمنتجات البحث عن بروتوكولات موحدة وخالية من كرة الثقافة والتمايز أكثر. نتيجة لذلك عدة أساليب محددة وخالية من كرة لثقافة طويلة الأجل من هبسكس غير متمايزة هي الآن متوفرة تجارياً16،،من1718. كسلسلة متصلة، توجيه التمايز بروتوكولات الاعتماد على الرموز الجزيئية لتوجيه هبسكس إلى مصير الظهارة القرنية وقد تم مؤخرا عرض19،،من2021،22، 23. بعد العديد من هذه البروتوكولات المستخدمة أما هبسكس تغذية على أساس غير محدد، كابتداء من مواد، أو زجاجات المعقدة، إكسينوجينيك عامل النمو للتمايز.

والغرض من هذا البروتوكول توفير كرة قوية، محسن،-وأسلوب ثقافة خالية من تغذية هبسك والتمايز اللاحقة إلى القرنية. ثقافة أحادي الطبقة هبسكس pluripotent laminin-521 (LN-521) المصفوفة في هبسك محددة وخالية من الزلال المتوسطة (8 تحديداً الأساسية فليكس) يسمح للإنتاج السريع لمادة انطلاق متجانسة للاختلاف. بعد ذلك أدلة بسيطة، استراتيجية التمايز خطوتين هبسكس تجاه مصير الأدمة السطحية في التعليق، متبوعاً بتمايز ملتصقة على ليسكس. يتم الحصول على عدد سكان خلية حيث أعرب > 65% ΔNp63α خلال 24 يوما. تم اختبار البروتوكول خالية كرة والتغذية مع عدة خطوط هبسك (هيسكس وهيبسكس)، دون أي اشتراط للخلية خط التحسين المحددة. تمكين بروتوكولات phenotyping الصيانة، باساجينج، كريوستورينج وهبسك خالية من عطلة نهاية الأسبوع هنا ووصف إنتاج دفعات كبيرة من عالية الجودة السريرية أو لأغراض البحث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جامعة تامبيري يحظى بموافقة "السلطة الوطنية" للشؤون ميديكوليجال فنلندا (دنرو 1426/32/300/05) لإجراء البحوث على الأجنة البشرية. ويضم المعهد أيضا البيانات الداعمة "اللجنة الأخلاقية" لمنطقة مستشفى بيركانما لاشتقاق، الثقافة، والتفريق بين خطوط هيس (سكوتمان/R05116) واستخدام خطوط هيبسك في أبحاث العيون (سكوتمان/R14023). لا توجد خطوط الخلية الجديدة استمدت هذه الدراسة.

ملاحظة: يستند البروتوكول وصف هبسك محددة والمتاحة تجارياً وظهاره القرنية التمايز وسائط الإعلام. يرجى الرجوع إلى الجدول للمواد اللازمة لإعداد المعلومات والكتالوجات الصانع/المورد.

1-إنشاء هبسك خالية كرة وتغذية ثقافة

  1. الأعمال التحضيرية
    1. معطف لوحات 24-جيدا مع laminin الماشوب البشري-521 (LN-521). لمرور أول (FF) خالية من علبة التغذية بالورق، استخدم LN-521 في تركيز من 1.09 ميكروغرام/سم2، وعند 0.55 ميكروغرام/سم2 للمقاطع التالية. تركيزات LN-521 المقترح بمثابة نقطة انطلاق لنجاح فرنك فرنسي الثقافة، لكن يمكن تخفيضها.
      1. ذوبان الجليد قنينة LN-521 ببطء في 4 درجات مئوية حسب تعليمات الشركة المصنعة.
        ملاحظة: يمكن تخزين التعامل معها على نحو مناسب LN-521 الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر بعد ذوبان الجليد.
      2. إعداد الحل الطلاء، إضعاف المبلغ المناسب لحل الأسهم LN-521 مع فوسفاتيبوفيريد المالحة (دببس دولبيكو س 1 في) التي تحتوي على Ca2 + و Mg2 + لإجمالي حجم 300 ميليلتر كل بئر.
      3. بيبيت الحل الطلاء للآبار، ختم اللوحة جيدا مع بارافيلم، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. قد يتم تخزين الألواح المغلفة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
        (اختياري): بدلاً من ذلك، لبروتوكول طلاء سريع، احتضان لوحات جيدا بمحلول طلاء ح 2 في 37 درجة مئوية، 5% CO2.
    2. إعداد هبسك الثقافة المتوسطة (8 تحديداً الأساسية فليكس) باستكمال متوسطة القاعدية بتكملة المقدمة، حسب تعليمات الشركة المصنعة. إضافة 50 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين. لاحظ أن وضع حساس للضوء وارتفاع درجات الحرارة. ذوبان الجليد في الملحق والدافئة وسائل الإعلام في درجة حرارة الغرفة (RT)، محمية من الضوء. استخدام المتوسط هبسك تستكمل خلال أسبوعين من تاريخ مكملات.
  2. نقل هبسك للثقافة فرنك فرنسي على LN-521
    1. قبل الحارة كل المواد اللازمة والمواد الكاشفة ل RT في هود الاندفاق الصفحي.
    2. هبسكس المرور من نظام الثقافة القياسية في تغذية طبقات (مثل القلفة البشرية المعطل (الأكايمية) أو الليفية الجنينية الماوس)، أو غيرها من النظم الثقافة فرنك فرنسي باستخدام منهجية موحدة. على سبيل المثال، يمكن تشريح المستعمرات هبسك مثقف في الأكايمية علبة تغذية الخلايا إلى قطع صغيرة مع مشرط والقطع ثم فصل مع طرف إبرة. PSCs البشرية المزروعة باستخدام نظم الثقافة FF يمكن نقلها باستخدام الكتلة باساجينج الأسلوب مع أو بدون علاج الإنزيم السابقة.
    3. إزالة الحل طلاء LN-521 من 24-الآبار وإضافة 1 مل هبسك قبل حرارة متوسطة كل بئر.
      ملاحظة: لا تسمح الآبار الجافة كما سيتم إلغاء تنشيط LN-521 عند التجفيف.
    4. نقل مجموعات القطع/خلية مستعمرة LN-521 المغلفة 24-آبار في المتوسطة هبسك مع ماصة. نقل 20 – 30 مستعمرة قطعة في البئر، تجنب الاكتظاظ الآبار.
    5. استبدال المتوسطة مع 1 مل متوسطة هبسك اليوم بعد نقل وكل يوم بعد ذلك. الثقافات على استعداد باساجينج 3 – 4 أيام في وقت لاحق كما نمت هبسكس خارجاً للمستعمرات مع مورفولوجيا غير متمايز، على نحو سلس. للإشارة، انظر الشكل 1 باء (الصورة الأولى). لمرور FF الأول، المستعمرات لا ينبغي أن تنمو إلى أحادي الطبقة المتلاقية تماما، ولكن ينبغي أن تكون باساجيد الثقافات عندما تصل إلى المستعمرات حجم تقريبي ل 1 مم.
  3. باساجينج والحفاظ على ثقافة هبسك فرنك فرنسي
    1. قبل الحارة كل المواد اللازمة والمواد الكاشفة ل RT في هود الاندفاق الصفحي.
    2. من الثانية مرور FF فصاعدا، ممر هبسكس FF عندما وصلت الثقافة كونفلوينسي 80-100%. مرور هبسكس فرنك فرنسي لقانون الجنسية الجديد-521 مغلفة بألواح 24-جيدا باستخدام خلية واحدة باساجينج مرتين في أسبوع (الاثنين والخميس) للحفاظ على الثقافات ذات جودة عالية مع مورفولوجيا غير متمايزة وتحقيق نظام تغذية خالية من عطلة نهاية الأسبوع. لمزيد من التفاصيل، يرجى الرجوع إلى18،،من2425.
      1. شطف هبسكس FF مرتين مع 1 مل x DPBS 1 دون Ca2 + و Mg2 +.
      2. فصل هبسكس فرنك فرنسي مع خالية من كرة التربسين-يدتا (على وجه التحديد تريبل حدد إنزيم) قبل تحضين ميليلتر 500 كل بئر في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. مدة الحضانة المثلى، تسمح للخلايا التقريب ولكن ليس إلى فصل. وهذا عادة ما يستغرق 3 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 (لا تتجاوز 5 دقائق).
      3. إزالة خالية من كرة التربسين-يدتا وفورا إضافة 500 ميليلتر كل من مثبطات التربسين محددة جيدا.
      4. فصل هبسكس فرنك فرنسي بالدقيق، ولكن شامل بيبيتينج للحصول على تعليق خلية مفردة. نقل تعليق هبسك فرنك فرنسي من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل يحتوي على هبسك قبل حرارة متوسطة.
      5. غسل الآبار مع 1 مل متوسطة هبسك وإضافة المتوسطة الغسيل للأنبوبة المخروطية أجهزة الطرد المركزي 15 مل.
      6. الطرد المركزي من تعليق خلية واحدة فقط لمدة 5 دقائق في 300 x ز ونضح بيليه الخلايا وريسوسبيند في 1 مل هبسك قبل حرارة متوسطة.
      7. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير أو العداد الآلي الخلية.
      8. إزالة الحل طلاء LN-521 (0.55 ميكروغرام/سم2) من 24-الآبار وإضافة هبسك المتوسطة كما هو الحال في 1.2.3.
      9. لوحة هبسكس فرنك فرنسي على 0.55 ميكروغرام/سم2 LN-521 المغلفة 24-الآبار في كثافة خلية 40,000 – 50,000 الخلايا/سم2.
      10. استبدال المتوسطة المتوسطة هبسك الطازجة في اليوم بعد باساجينج، وكل يوم بعد ذلك باستثناء أيام الأحد.
    3. الخلايا على استعداد لاستخدامها للتمييز بين 3-4 أيام بعد باساجينج، عندما وصلت إلى الثقافة > كونفلوينسي 85%. لضمان الجودة العالية هبسكس، أرجع إلى توصيف الطرق الموضحة بالتفصيل في السابق يعمل18،،من2425. من المستحسن إلا ثقافة هبسكس حتى مستوى مرور 15 في نظام FF استخدام خلية واحدة باساجينج لتجنب التغييرات كاريوتيبيك. فقط استخدام هبسكس عالية الجودة، وغير متمايزة كابتداء من المواد للاختلاف.

2-توجيه التمايز ونعد من المستمدة من هبسك

  1. الأعمال التحضيرية
    1. إعداد التعريفي خالية من كرة القاعدية المتوسطة (المتوسطة التعريفي القاعدية): تعديل "الملحق دولبيكو" المتوسطة النسر (تحديداً خروج المغلوب دميم) مع استبدال المصل خالية من كرة 15% (سبيسيفيكالي CTS "خروج المغلوب" ريال إكسينوفري)، 2 مم ل الجلوتامين، 0.1 مم 2- ميركابتوثانول والأحماض الأمينية غير الأساسية 1% U/mL 50 البنسلين-ستربتوميسين. استخدام وسيلة التعريفي القاعدية خلال أسبوعين.
    2. تعد وسائل الإعلام لتحريض القرنية في ثقافة الوقف.
      1. يوم 1: الملحق التعريفي القاعدية المتوسطة مع 5 ميكرومترات بليبيستاتين.
      2. يوم 2: تكملة التعريفي القاعدية المتوسطة مع 10 ميكرون SB-505124 و 50 نانوغرام/مل تنتجها الخلايا الليفية الأساسية البشرية عامل النمو (بفجف).
      3. يوم 3-4: الملحق التعريفي القاعدية المتوسطة مع عظم نانوغرام/مل 25 البروتين morphogenetic 4 (BMP-4).
    3. إعداد ظهارة القرنية التمايز المتوسطة (متوسط التمايز، على وجه التحديد المركز الوطني للاستشعار-30) للثقافة ملتصقة: إضافة المكملات الغذائية إلى متوسطة القاعدية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة وإضافة 50 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين.
      ملاحظة: وضع متوسطة التمايز حساسة للضوء. استخدام وسيلة تمايز تستكمل في غضون 6 أسابيع تاريخ مكملات.
    4. معطف 100 مم للتمايز ملتصقة أطباق زراعة الأنسجة (راجع الخطوة 2، 3) مع خليط من 5 ميكروغرام/سم2 الكولاجين المشيمة البشرية النوع الرابع (العمود الرابع) و 0.5 ميكروغرام/سم2 LN-521 المخفف في x DPBS 1 التي تحتوي على Ca2 + و Mg2 +، في مجموعة طلاء حجم 5 مل كل طبق. تحضير وتخزين الطلاء مع العقيد الرابع و LN-521، كما هو موضح في 1.1.1.3.
  2. الخطوة الأولى: الاستقراء القرنية في الثقافة تعليق
    1. قبل الحارة كل المواد اللازمة والمواد الكاشفة ل RT في هود الاندفاق الصفحي.
    2. فصل هبسكس فرنك فرنسي إلى تعليق خلية مفردة مع التربسين-يدتا خالية من كرة كما هو موضح في الخطوات 1.3.2.1–1.3.2.6. عد الخلايا، وتوزيع 2-3 × 106 خلايا كل مرفق منخفضة لوحة 6-جيدا جيدا، في إجمالي حجم 3 مل من تحريض القاعدية المتوسطة وتستكمل مع 5 ميكرومترات بليبيستاتين للحث على تشكيل المجلس التنفيذي بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO2 (1 يوم).
    3. في اليوم التالي (اليوم 2)، إزالة المتوسطة واستبدال مع 3 مل من تحريض القاعدية المتوسطة وتستكمل مع 10 ميكرون SB-505124 و 50 نانوغرام/مل بفجف.
    4. في ما يلي يومين (3 – 4 أيام)، إزالة المتوسطة واستبدال مع 3 مل متوسطة التعريفي القاعدية وتستكمل مع 25 نانوغرام/مليلتر BMP--4.
  3. الخطوة الثانية: تمايز القرنية في الثقافة ملتصقة
    1. قبل الحارة كل المواد اللازمة والمواد الكاشفة ل RT في هود الاندفاق الصفحي.
    2. في يوم 5، لوحة الحديدية أسفل على أطباق زراعة الأنسجة 100 ملم المغلفة مع 5 ميكروغرام/سم2 العمود الرابع و 0.5 ميكروغرام/سم2 LN-521.
      1. إزالة الحل الطلاء من أطباق زراعة الأنسجة 100 مم وإضافة 10 مل متوسطة التمييز المعالجون مسبقاً للطبق الواحد.
        ملاحظة: لا تسمح الصحون لتجف كما سيتم إلغاء تنشيط LN-521 عند التجفيف.
      2. نقل الحديدية من لوح واحد 6-جيدا جيدا إلى اثنين إلى ثلاثة أطباق زراعة الأنسجة 100 مم (حوالي 50 الحديدية كل سم2) قبل بيبيتينج. توزيع الحديدية بالتساوي بالهز لطيف.
    3. الحفاظ على الخلايا في ثقافة ملتصقة على 37 درجة مئوية، 5% CO2، الاستعاضة عن المتوسط مع 10 مل من التمايز الطازجة المتوسطة ثلاث مرات في الأسبوع (يوم الاثنين والأربعاء والجمعة) 2.5-3 خلال الأسابيع المقبلة. فحص الخلايا بانتظام لظهور مورفولوجيا الظهارية الصحيح باستخدام مجهر تباين المرحلة.
  4. الخطوة الثالثة: Cryo-المصرفي المستمدة من هبسك
    1. قبل الحارة كل المواد اللازمة والمواد الكاشفة ل RT في هود الاندفاق الصفحي، باستثناء المتوسطة للواسمات التي ينبغي أن تكون مبردة مسبقاً.
    2. فصل المستمدة من هبسك مع التربسين-يدتا خالية من كرة وعد الخلايا، كما أوعز هبسكس فرنك فرنسي في 1.3.2.1–1.3.2.6 الخطوات، ولكن استخدام متوسطة التمايز.
      ملاحظة: لاشتقاق هبسك، وقت الحضانة المثلى مع التربسين-يدتا خالية من كرة أطول (حوالي 5 دقائق). استخدام 3 مل خالية من كرة التربسين-يدتا ومثبط التربسين محددة كل طبق 100 مم.
    3. بعد عد الخلايا، وتكرار استخدام الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز 300 x، نضح المتوسطة وريسوسبيند بيليه خلية في المتوسط للواسمات هبسك برود مسبقاً، خالية من كرة. بيبيت الوحيدة الخلية تعليق في كريوتوبيس حيث يحتوي كل كريوتوبي 0.5 إلى 1 × 106 خلايا في 1 مل للواسمات المتوسطة.
    4. ضع الأنابيب في تجميد الحاويات ونقل مباشرة (في غضون 5 دقائق) إلى-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    5. اليوم التالي، نقل الأنابيب للنتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
  5. الخطوة الرابعة: ذوبان cryopreserved هبسك-
    1. قبل ذوبان الجليد، معطف لوحات الأطباق/جيدا مع 5 ميكروغرام/سم2 العمود الرابع و 0.5 ميكروغرام/سم2 LN-521.
    2. قبل الحارة كل المواد اللازمة والمواد الكاشفة ل RT في هود الاندفاق الصفحي.
    3. إزالة الحل الطلاء من الأطباق/الآبار وإضافة الحجم المناسب للمتوسطة التمييز المعالجون مسبقاً.
      ملاحظة: لا تسمح الصحون لتجف كما سيتم إلغاء تنشيط LN-521 عند التجفيف.
    4. ذوبان الجليد في الخلايا بسرعة في الرايت ونقل على الفور بتعليق خلية لأنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل يحتوي على 5 مل متوسطة التمييز المعالجون مسبقاً.
    5. الطرد المركزي بتعليق خلية لمدة 5 دقائق في 300 س ز، نضح، وريسوسبيند بيليه في متوسطة التمايز لإزالة أي وسيط للواسمات.
    6. لوحة الخلايا على الأطباق/الآبار المغلفة مع 5 ميكروغرام/سم2 العمود الرابع و 0.5 ميكروغرام/سم2 LN-521، في متوسطة التمايز في كثافة 40,000 – 50,000 الخلايا/سم2. الحفاظ على الخلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO2، الاستعاضة عن متوسطة التمايز ثلاث مرات في أسبوع.

3-فينوتيبينج المستمدة من هبسك

  1. التحليل النوعي الفلورة
    1. الفلورة، معطف 24-12 جيدا أو لوحة الآبار مع 5 ميكروغرام/سم2 العمود الرابع و 0.5 ميكروغرام/سم2 LN-521 ولوحة/ذوبان هبسك-في متوسطة التمايز في كثافة 40 000 000 – 50 خلايا/سم2.
    2. عندما وصلت الثقافات كونفلوينسي، إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% (PFA): يغسل الآبار مرتين مع x DPBS 1 دون Ca2 + و Mg2 +واحتضان 15-20 دقيقة مع 4% منهاج عمل بيجين في الرايت وبعد ذلك يغسل مرتين مع x DPBS 1 لإزالة أي بقايا منهاج عمل بيجين. استخدام 0.5-1 مل من حلول كل بئر.
      ملاحظة: الخلايا الثابتة قد تكون مخزنة في x DPBS 1 عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل التلوين.
      تنبيه: منهاج عمل بيجين السامة والمسببة للتآكل. التعامل مع منهاج عمل بيجين في غطاء دخان وارتداء الملابس الواقية وحماية العين، والقفازات.
    3. نضح 1 x DPBS وبيرميبيليزي أغشية الخلية بحضانة لمدة 10-15 دقيقة مع 0.1% X-100 تريتون في 1 x DPBS.
    4. نضح 0.1% تريتون X-100 وكتلة جسم غير محدد مواقع الربط التي تفرخ ح 1 مع 3% البقري ألبومين المصل (BSA) في x DPBS 1 في تخفيف جسم الابتدائي تحضير الرايت في جيش صرب البوسنة 0.5% في 1 x DPBS.
      ملاحظة: انظر الجدول 1 للأجسام المضادة الأولية الموصى بها.
    5. نضح 3% جيش صرب البوسنة، واحتضان مع جسم الابتدائي على النحو المناسب المخفف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    6. غسل الآبار 3 x لمدة 5 دقائق مع 1 x DPBS. إعداد تخفيف جسم الثانوية في جيش صرب البوسنة 0.5% في 1 x DPBS.
      ملاحظة: انظر الجدول 1 للأجسام المضادة الثانوية الموصى بها.
    7. نضح 1 x DPBS واحتضان مع جسم الثانوي مناسبة، على النحو المناسب المخفف ح 1 في الرايت، محمية من الضوء.
      ملاحظة: من هذه الخطوة، تبقى العينات محمية من الضوء للحيلولة دون تﻻشى الأصباغ الفلورية.
    8. غسل الآبار 3 x 5 دقائق مع 1 x DPBS، وأخيراً نواة كونتيرستاين مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) وجبل مع الأسفار تركيب وسائط. ويمكن استخدامها بشكل منفصل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة DAPI أو المدرجة في الأجلين المتوسط وتصاعد. مكان الجولة كوفيرسليبس (قطرها 19 و 13 ملم للبئر 12 و 24 لوحات، على التوالي) في كل بئر. اتبع إرشادات الشركة المصنعة فيما يتعلق بتجفيف وتخزين العينات التي تم تحميلها.
    9. صورة الخلايا الملون مع مجهر فلوري.
  2. تحليل كمي الفلورة
    1. إعداد عينات سيتوسبين من هبسك مستمدة في كائن النظارات.
      1. فصل المستمدة من هبسك مع التربسين-يدتا خالية من كرة وعد الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 2.4.2.
      2. بعد فرز الأصوات، إضافة x DPBS 1 مبردة مسبقاً والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في غ. س 300 ضبط حجم العينة وتركيز الخلية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة من سيتوسينتريفوجي معينة، مثل الخلايا 50,000 – 100,000 في وحدة تخزين عينة من 150 ميليلتر.
      3. تدور الخلايا وصولاً إلى نظارات الكائن مع سيتوسينتريفوجي مثلاً 5 دقيقة في 28 س ز وإصلاح فورا عن 15-20 دقيقة مع 4% الأرجنتينية في x DPBS 1 في الرايت للوقت الموصى به للغزل والسرعة، أرجع إلى دليل التعليمات من سيتوسينتريفوجي معينة.
    2. المضي قدما إلى تلطيخ عينات سيتوسبين كما هو موضح في الخطوات 3.1.3–3.1.8 استخدام مانع السائل القلم لتطويق العينات مع دائرة مسعور والقيام تلطيخ في معالجة تجميعية للممارسة الاقتصادية. ويمكن تنفيذ يغسل في حاويات مع أصحاب الشريحة، بغية ضمان كفاءة إزالة الأجسام المضادة الزائدة وتلوين خلفية الحد الأدنى. كونتيرستين الأنوية مع DAPI وجبل العينات ملطخة بالأسفار تركيب وسائط، تغطي مع كوفيرسليبس. اتبع إرشادات الشركة المصنعة فيما يتعلق بتجفيف وتخزين العينات التي تم تحميلها.
    3. التقاط الصور 5-10 كل عينة من مواقع مختارة عشوائياً باستخدام مثلاً 10 X التكبير مجهر الأسفار.
    4. تقدير النسبة المئوية للخلايا الملون إيجابيا فيما يتعلق بمجموع (DAPI الإيجابية) الخلايا، مثل أدوات البرمجيات (https://imagej.nih.gov/ij/) إيماجيج معالجة الصور وتحليلها. يفضل أن يكون تحليل > الخلايا 500 كل عينة.
      1. فتح الصورة ليتم تحليلها في برنامج إيماجيج. تكرار الصورة وتصفية مع التمويه الضبابي الافتراضي لإزالة الضوضاء.
      2. إنشاء عتبة. ضبط قيم العتبة للتحديد الأمثل من نواة خلية إيجابيا الملون، وتطبيقها. يتم تحويل الصورة تتكرر الآن إلى طريقة عرض ثنائي.
      3. أدوات عملية صورة ثنائية مع تجهيز ثنائي "ملء الثقوب" و "مستجمعات المياه"، التي سوف تفصل تلقائياً المجالات المدمجة يمثلون نواة واحدة.
      4. استخدم أداة "تحليل الجزيئات" تلقائياً قائمة في مناطق المصالح (رويس) إلى إطار إدارة العائد على الاستثمار، مما سيفتح عند تطبيق الأمر. قم بإغلاق الصورة الثنائية.
      5. تصور رويس في الصورة الأصلية عن طريق اختيار "إظهار الكل" في إدارة العائد على الاستثمار. تأكيد التحديد الصحيح لنواة الخلية الملون، وإذا لزم الأمر، إزالة يدوياً وإضافة الاختيارات الفردية.
  3. تحليل التدفق الخلوي
    1. للتأكد من أن مستويات التعبير p63α، وصمة عار الخلايا للتدفق الخلوي.
      1. فصل المستمدة من هبسك مع التربسين-يدتا خالية من كرة وعد الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 2.4.2.
      2. أغسل الخلايا مرتين مع 1 مل يبرد قبل 1 x DPBS والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x زاي الإصلاح وبيرميبيليزي مع الحلول الجاهزة للاستخدام التثبيت/بيرميبيليزيشن لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. بعد ذلك يغسل مبردة الخلايا مرتين مع 1 مل قبل 1 × بيرميبيليزينج المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
        ملاحظة: من هذه الخطوة على إبقاء الخلايا عند 4 درجة مئوية أو على الجليد، ما لم يشر إلى خلاف ذلك.
      3. تنبيه: يتضمن حل التثبيت/permeabilization فورمالدهايد 4.2 في المائة. التعامل مع الحل الخطرة في غطاء دخان وارتداء الملابس الواقية وحماية العين، والقفازات.
      4. تقسيم العينات إلى أنابيب البولي بروبلين 5 مل. ينبغي أن تحتوي كل عينة على خلايا 100,000 – 200,000 وينبغي تعديل حجم العينة إلى حوالي 100 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
      5. إضافة 2 ميليلتر من fluorochrome مترافق p63-α جسم نظام مراقبة الأصول الميدانية (لجسم الموصى به، انظر الجدول للمعدات والمواد) في أنابيب العينة. إجازة أونستاينيد عينة واحدة لتكون بمثابة مراقبة سلبية. دوامة العينات واحتضانها ح 1 في الرايت، محمية من الضوء.
      6. تغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من قبل المثلجة 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، وأخيراً، ريسوسبيند الكريات مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت. تخزين الأنابيب على الجليد، ومحمية من الضوء.
    2. تحليل العينات مع سيتوميتير تدفق. استخدام نموذج المراقبة السلبية أونستينيد النابضة للسكان الخلية الصحيحة، واستبعاد الإشارات الخلفية الفلورية. تحليل الحد أدنى من 10,000 p63-α-الملون الخلايا. لتنفيذ التقنية المفصلة، يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم ل cytometer تدفق معين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من هبسكس إلى هبسك-

وتستغرق العملية برمتها من الذي يحفز تمايز هبسكس فرنك فرنسي إلى كريوستورينج هبسك-حوالي 3.5 أسابيع. نظرة عامة التخطيطي أسلوب المفاضلة تسليط الضوء على خطواتها الرئيسية ترد في الشكل 1A. ويبين الشكل 1B مورفولوجيس نموذجية من السكان خلية في مراحل مختلفة من البروتوكول. يتم الحصول على البيانات المقدمة مع Regea08/017 هيس الخط والخط هيبسك UTA.04607.WT، سواء المشتقة وتتميز في جامعة تامبيري، فنلندا، كما هو موضح سابقا26،،من2728.

في قانون الجنسية-521 في المتوسط هبسك، تشكل هبسكس فرنك فرنسي عالية الجودة وغير متمايزة أولاً المستعمرات متميزة مع حواف حادة، الذي دمج إلى مونولاييرس متجانسة عند التقاء (الشكل 1B، الصورة الأولى). عدة خطوط هيسك وهيبسك المشتقة منفردة ومتميزة وراثيا بنجاح ومثقف مع هذا النظام. ضرب السكان هبسك فرنك فرنسي تقريبا 3-fold داخل كل مرور، توفير وسائل قوية لتوليد كرة-وتغذية خالية ابتداء من المواد للاختلاف25. عادة ما تنتج التعريفي 24 ساعة في المتوسط EB تعليق الحديدية العادية، وضيق ذات أحجام مختلفة (الشكل 1B، الصورة الثانية). خلال تحريض الأدمة السطحية في التعليق (اليوم 2-4)، يجب عدم تغيير مورفولوجية EB جذريا. يظهر ثمرة المستعمرة قريبا بعد يتم مطلي الحديدية على العقيد رابعا/LN-521 تركيبة المصفوفة في متوسطة التمايز (الشكل 1B، الصور الثالثة والرابعة)، وفي غضون 21 – 25 يوما تمايز الخلايا تشكل طبقات متجانسة المتلاقية مع مضلع مورفولوجيا نموذجية للخلايا الظهارية (الشكل 1B، الصورة الخامسة). قد تكون الخلايا ثم كريوستوريد لاستخدامها في وقت لاحق. البقاء ومورفولوجيا يتم الحفاظ عليها جيدا بعد ذوبان الجليد هبسك-(الشكل 1B، الصورة الأخيرة).

عادة، تؤدي 3 × 106 فرنك فرنسي هبسكس مطلي بصفيحة 6-بئر واحدة الحديدية ما يكفي يكون مطلي للثقافة ملتصقة في 2 – 3 خلية ثقافة الأطباق (100 ملم). من كل طبق 100 مم، يجوز أن تحصد 1 إلى 1.5 x 106 خلايا كريوبانكينج يوم 22 – 25 من التفريق. في المتوسط، يولد كل هبسك فرنك فرنسي غير متمايزة خلايا 0.7 يوم 25 (الشكل 2).

التحقق من صحة المستمدة من هبسك

نظراً لغياب محددة ليس علامة البروتينات، يؤكد النمط الظاهري الخلية الصحيحة مع مجموعة من العلامات التي تثبت النقصان في التعبير بلوريبوتينسي المرتبطة البروتينات وزيادة التعبير عن علامات ليس معترف بها. في يوم 24 من التمايز، مربع الغالبية العظمى من الزوجي صريح ليسكس المستمدة من هبسك البروتين PAX6 (PAX6)، الجهة الرئيسية للتنمية العين، فضلا عن p63α، علامة ليسك المعترف بها على نطاق واسع. ΔNp63 isoform p63 مبتوراً أعرب عن المشاركة في معظم الخلايا p63α-إيجابية، مما يؤكد النمط الظاهري خلية ΔNp63α إيجابية محددة القرنية أكثر. علامات الظهارية القاعدية والمفترضة ليس علامات سيتوكيراتين (كورونا)-15 وكورونا-14 يتم التعبير عنها في جزء منه، بينما pluripotent الخلايا الجذعية علامة OCT3/4 وناضجة القرنية الظهارية ماركر كورونا-12 لا يمكن اكتشافها في هذه المرحلة. وهذا يشير إلى التفريق بين هبسكس فرنك فرنسي نحو المتكفل الظهارية حوفي أونيبوتينت، ولكن لا المحطة الطرفية بعد التمايز في الخلايا الظهارية القرنية ناضجة. (الشكل 3 أ) هبسك-بنجاح الإبقاء على النمط الظاهري بعد الشفاء من كريوستوراجي (بيانات قابلة للمقارنة الشكل 3A).

بعد 24 يوما تمايز، أعرب ΔNp63 66.2 في المائة (n = 33, SD 9.3 في المائة) Regea08/017 هيسك-، وفي 65.7 في المائة (n = 10، SD 4.1%) UTA.04607.WT هيبسك-(كمية من عينات سيتوسبين، الشكل 3). بعد الشفاء من كريوستوراجي، 82.2 في المائة (n = 10، SD 5.7 في المائة) هيس-و 90.5 في المائة (n = 10, SD=3.7%) هيبسك-أعرب عن ΔNp63 (كمياً من لوحات جيدا في يوم 26 – 28، الرقم 3).

وأكد كذلك التعبير p63α مع تحليل التدفق الخلوي هيسك-Regea08/017. في يوم 25 من التمايز، 62% من هبسك-طازجة المتباينة كانت إيجابية بالنسبة p63α. يومين بعد الشفاء من كريوستوراجي (المجموع اليوم في 28) كانت 81% الخلايا p63α-إيجابية (الشكل 3).

Figure 1
رقم 1: لاحظ الرسم التوضيحي التخطيطي هبسك-التمايز البروتوكول (A) والخلية النموذجية مورفولوجيس في مراحل مختلفة من العملية (ب)- الحديدية تتشكل من تعليق خلية واحدة عالية الجودة، غير متمايزة هبسكس خلال استحثاث جزيء صغير 24 h. ثلاثة أيام الأولى نحو الأديم الظاهر السطحية في التعليق هو تليها مرحلة التمايز ملتصقة. يوم 24 من التمايز، تظهر معظم الخلايا نموذجي ليسك تشبه مورفولوجيا. الممثل الصور المعروضة لخط هيس Regea08/017 قبل وأثناء التفريق. أسود مقياس بار = 200 ميكرومتر، صالحة لكل الصور في لوحة. المختصرات: بليب.: بليبيستاتين، س. ب: مثبط جزيء صغير SB-505124، بفجف: عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية، BMP-4: العظام morphogenetic البروتين 4، LN-521: laminin الماشوب البشري 521، العمود الرابع: نوع الكولاجين المشيمة البشرية الرابع، هبسك: pluripotent البشرية الخلايا الجذعية، اجتماع المجلس التنفيذي: امبريويد الجسم، ليسك: حوفي الخلايا الظهارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: العائد المتوقع من الخلية. بوكسبلوتس عرض عدد الخلايا التي تم الحصول عليها كريوستورينج في يوم 22-25 من التمايز، مقسوماً على عدد غير متمايزة هبسكس مطلي لخطوة تشكيل المجلس التنفيذي في اليوم 0. في 0.72 متوسط (SD 0.4) أنتجت خلايا من كل pluripotent هيسك Regea08/017، بينما 0.78 (SD 0.67) أنتجت خلايا من كل هيبسك UTA.04607.WT. n: عدد من التجارب التمايز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. المتوقع أن النمط الظاهري لاشتقاق هبسك- واقترح جسم الفلورة وسم (أ) إظهار التعبير موحدة من العين تطوير منظم PAX6 وليس معترف بها علامات p63α وبه إيسوفورم ΔNp63، فضلا عن اثنين آخرين ليس علامات-CK15 و 14. بلوريبوتينسي علامة OCT3/4 وناضجة القرنية الظهارية ماركر كورونا-12 سلبية. الممثل الصور إذا أظهرت هيسك Regea08/017-في يوم 24 من التفريق. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. (ب) خلية ΔNp63 عد من طازجة متباينة وكريوستوريد هبسك-يوضح أن الخلايا لا تحتفظ فقط، ولكن إظهار التعبير ΔNp63 زيادة بعد كريوستوراجي. عد الخلايا يؤدي إلى إظهار > 65% من هبسك-طازجة متمايزة الملون إيجابية بالنسبة ΔNp63 قبل الإجراء كريوبانكينج، و > 80% بعد استرداد ناجحة. n = عدد من التجارب تمييز منفصلة (الحد أدنى خلايا 600 عد كل عينة و > 1600 الخلايا كل نقطة الوقت) التحليل الخلوي تدفق (ج) عرض 62% من هبسك-طازجة متمايزة و 81 في المائة من الخلايا المذابة إيجابية بالنسبة p63α، وإذ تؤكد الخلية فرز النتائج لخط Regea08/017. * ب-ج تشير إلى الخلايا المذابة. الأحمر المدرج التكراري لنماذج إيجابية والأسود لسلبية العينة (أونستاينيد). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

جسم مضاد المضيف تمييع
الأجسام المضادة الأولية إذا
PAX6 الأرنب 1: 200
p63α الماوس 1: 200
ΔNp63α الأرنب 1: 200
كورونا-15 الماوس 1: 200
كورونا-14 الماوس 1: 200
كورونا-12 ماعز 1: 200
OCT3/4 ماعز 1: 200
الأجسام المضادة الثانوية إذا
568 فلور أليكسا الماعز المضادة المفتش العام حمار 1:800
568 فلور أليكسا الماوس المضادة المفتش العام حمار 1:800
488 فلور أليكسا المضادة أرنب Ig حمار 1:800
488 فلور أليكسا الماوس المضادة المفتش العام حمار 1:800

الجدول 1: أوصى الابتدائي والثانوي من الأجسام المضادة المستخدمة الفلورة (إذا) وسم لاشتقاق هبسك- انظر الجدول للمواد المصنعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

والنتيجة المتوقعة من هذا البروتوكول هو توليد ليسكس ناجحة وقوية من تعليق خلية مفردة هبسك فرنك فرنسي خلال أسبوعين تقريبا 3.5. كما يطور ظهارة القرنية من الأديم الظاهر السطحية29، تهدف الخطوة الأولى من البروتوكول التوجيهي هبسكس تجاه هذه النسب. وتستخدم تحريض ح 24 قصيرة مع تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β) خصم SB-505124، وبفجف للحث على التفريق بين الأدمة، تليها جديلة BMP-4 ميسوديرمال ح 48 دفع الخلايا نحو الأديم الظاهر السطحي. الخطوة التالية من التمايز ملتصقة العقيد رابعا/LN-521 تركيبة المصفوفة جنبا إلى جنب مع متوسطة التمايز محددة كيميائيا يستخدم لمواصلة توجيه التمايز تجاه ليسكس.

عالية الجودة لانطلاق المواد (هبسكس فرنك فرنسي) أمر حاسم لنجاح التمايز. ينبغي أن تستخدم فقط FF هبسك الثقافات بالقرب من التقاء وما يقرب من 100 ٪ من النمط الظاهري غير متمايزة. كاريوتيبينج هبسك العادية المستحسن، كما باساجينج خلية مفردة يمكن أن يؤهب هبسكس إلى تشوهات كاريوتيبيك التي تؤدي إلى النمو والتمايز مزايا30. يمكن أن يسبب التعرض المطول التربسين كفاية EB تشكيل أو هبسك الموت. تم اختبار البروتوكول مع خمسة المشتقة على حدة وخطوط هبسك وراثيا متميزة، وخطوط هيس وهيبسك. ليست هناك حاجة لإجراء تعديلات محددة خط الخلية إلى تركيزات جزيء صغير أو إضعاف التعريفي. بيد أثناء التحسين الأولى من البروتوكول، وموت الخلايا المفرط أو مظهر الخلايا مع مورفولوجيا الليفية أو العصبية أو غيرها أشار إلى التمايز بالانساب غير مرغوب فيها. وفي هذه الحالة، قد تتطلب الطريقة صقل. تنسيقات سفينة الثقافة توفر نقطة انطلاق، ويمكن رفع درجة من أحجام الموصى بها.

يتم تعريف بروتوكول كامل من الثقافة هبسك ليس التمايز ونعد، تتيح الانتقال السهل إلى جيدة التصنيع الممارسة (GMP) لإنتاج خلية منتجات العلاج. كما الإعلام التجاري والكاشفات الخضوع للتنمية القوية وصنعها وإجراءات مراقبة الجودة، أنها توفر منبرا متسقة وموحدة لثقافة هبسك والاختلاف. شروط محددة بتقليل التباين دفعة بدفعه، مما يوفر ميزة على القائمة هبسك-التمايز البروتوكولات10،11،،من1213،14، 20 , 22 , 23-وينص البروتوكول على سريعة وبسيطة نسبيا أيضا ميزة على أورجانويدس القرنية ثلاثية الأبعاد التي يصعب على توحيد عبر خطوط الخلايا، والمختبرات، وتتطلب أساليب قوية لتنقية الخلايا المطلوب أنواع31 ،32. بالإضافة إلى ذلك، ينص البروتوكول على كفاءة عالية وسيلة قوية لإنتاج ليسكس لأغراض البحوث، مثل مرض النمذجة، والهندسة الوراثية، وفحص المخدرات، واختبار السمية. وعلاوة على ذلك، المنصة يمكن ضبطها بسهولة للتفريق بين أنواع الخلايا الظهارية العين الأخرى مثل صبغة الشبكية الخلايا الظهارية (الخلايا RPE)25.

العلاج استبدال خلية حوفي الناجح يتطلب فقط بضعة آلاف p63-إيجابية ليسكس4، في العين، ولكن يتطلب ضمان الجودة السكان خلية إضافية والإنتاج على نطاق كبير لذلك. يسمح كريوبانكينج إعداد مخزون الخلية متاحة بسهولة للزرع، فضلا عن نوعية وسلامة الاختبار. علاوة على ذلك، نقاء هبسك-يحسن بعد كريوستورينج، وكذلك بعد باساجينج والمطول الثقافة25، كما اقترح زيادة ΔNp63 التعبير.

وباختصار، ينشئ هذا الأسلوب قوية ΔNp63α-إيجابية الخلايا من هبسكس في غضون أسابيع 3.5 تحت ظروف خالية من خلية ثقافة كرة-وتغذية. أساليب الثقافة الخلية المعروضة هنا تمكين إنتاج استخدام العلاج المطبقة على العين الخلية ليسكس عالية الجودة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

أيده الدراسة أكاديمية فنلندا (رقم المنحة 297886)، وبرنامج قطع الغيار البشرية Tekes، وتمويل الوكالة الفنلندية للتكنولوجيا والابتكار، ومؤسسة مصرف الأنسجة والعين الفنلندية والمؤسسة الثقافية الفنلندية. يشكر المؤلفون فنيي المختبرات الطبية ميلين أوتي وحنا بيكانين فيكشتات أيما هيكيلا أوتي للمساعدة التقنية الممتازة والمساهمة في ثقافة الخلية. أستاذ كاترينا الفأر ألتو-Setälä المسلم لتوفير مرفق "بيوميديتيتش التصوير الأساسية" والخط هيبسك المستخدمة لتوفير المعدات اللازمة للتصوير بالأسفار.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material/Reagent
1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ Gibco #14040-091
1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ Lonza #17-512F/12
100 mm cell culture dish Corning CellBIND #3296 Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation
12-well plate Corning CellBIND #3336 Culture vessel format for IF samples
24-well plate Corning CellBIND #3337 Culture vessel format for IF samples
2-mercaptoethanol Gibco #31350-010
6-well plate, Ultra-Low attachment Corning Costar #3471 Culture vessel format for induction in suspension culture
Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig ThermoFisher Scientific #A-21202 Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig ThermoFisher Scientific #A-21206 Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-goat Ig ThermoFisher Scientific #A-11057 Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig ThermoFisher Scientific #A-10037 Secondary antibody for IF
Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) PeproTech Inc. #AF-100-18B Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution BD Biosciences #554722 Fixation and permeabilization solution for flow cytometry
BD Perm/Wash Buffer BD Biosciences #554723 Washing buffer for flow cytometry
Blebbistatin Sigma-Aldrich #B0560
Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) PeproTech Inc. #120-05A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #A8022-100G
Cytokeratin 12 antibody Santa Cruz Biotechnology #SC-17099 Primary antibody for IF
Cytokeratin 14 antibody R&D Systems #MAB3164 Primary antibody for IF
Cytokeratin 15 antibody ThermoFisher Scientific #MS-1068-P Primary antibody for IF
CnT-30 CELLnTEC Advanced Cell Systems AG #Cnt-30 Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation
Collagen type IV (human) Sigma-Aldrich #C5533 Human placental collagen type IV
CoolCell LX Freezing Container Sigma-Aldrich #BCS-405
CryoPure tubes Sarsted #72.380 1.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation
Defined Trypsin Inhibitor Gibco #R-007-100
Essential 8 Flex Medium Kit Thermo Fisher Scientific #A2858501
GlutaMAX Gibco #35050061
Laminin 521 Biolamina #Ln521 Human recombinant laminin 521
ΔNp63α antibody BioCare Medical #4892 Primary antibody for IF
OCT3/4 antibody R&D Systems #AF1759 Primary antibody for IF
p63α antibody Cell Signaling Technology #ACI3066A Primary antibody for IF
p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) Cell Signaling Technology #56687 p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry
PAX6 antibody Sigma-Aldrich #HPA030775 Primary antibody for IF
Penicillin/Streptomycin Lonza #17-602E
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich #158127 Cell fixative for IF
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific #P36931 DAPI mountant for hard mounting for IF
PSC Cryopreservation Kit Thermo Fisher Scientific #A2644601
TrypLE Select Enzyme Gibco #12563-011
KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco #10829018
KnockOut SR XenoFree CTS Gibco #10828028
MEM non-essential amino acids Gibco #11140050
SB-505124 Sigma-Aldrich #S4696
Triton X-100 Sigma-Aldrich #T8787 Permeabilization agent for IF
VectaShield Vector Laboratories #H-1200 DAPI mountant for liquid mounting for IF
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II Tharmac
Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 BD Biosciences
Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 Olympus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
  3. Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
  4. Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
  5. Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
  6. Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
  7. Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
  8. Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
  9. Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
  10. Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
  11. Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
  12. Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435 (2012).
  13. Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
  14. Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
  15. Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
  16. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  19. Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
  20. Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
  21. Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303 (2017).
  22. Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913 (2017).
  23. Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
  24. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
  25. Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4 (2017).
  26. Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
  27. Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39 (2014).
  28. Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792 (2016).
  29. Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
  30. International Stem Cell Initiative,, et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  31. Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286 (2017).
  32. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Tags

الإنمائية البيولوجيا، العدد 140، الإنسان الخلايا الجذعية الجنينية، التي يتسبب فيها الإنسان الخلايا الجذعية pluripotent، والخلايا الجذعية الظهارية حوفي القرنية، خالية من كرة، خالية من علبة التغذية بالورق، جزيء صغير التعريفي، توجيه التمايز القرنية
فعالة وقابلة للتمايز الموجهة متوافقة سريرياً القرنية حوفي طلائي الخلايا الجذعية من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hongisto, H., Vattulainen, M.,… More

Hongisto, H., Vattulainen, M., Ilmarinen, T., Mikhailova, A., Skottman, H. Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (140), e58279, doi:10.3791/58279 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter