Summary
이 프로토콜은 이종-및 피더 세포 무료 문화 조건 하에서 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 각 막 limbal 상피 줄기 세포를 분화 하는 간단한 2 단계 방법을 소개 합니다. 여기에 제시 된 셀 문화 방법 각 막 세포 치료 이용에 적용 가능한 임상 질 세포의 비용 효율적인, 대규모 생산 가능
Abstract
상피 각 막 limbal 줄기 세포 (LESCs)는 각 막 상피를 지속적으로 갱신 하 고 따라서 각 막 항상성 및 시각적 선명도 유지 합니다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)-각 막 세포 대체 요법에 대 한 유망한 셀 소스를 제공 하는 파생 된 LESCs. 정의 되지 않은, xenogeneic 문화와 차별화 조건 연구 결과에서 변형 원인과 hPSC 유래 치료제의 임상 번역을 방해. 이 프로토콜 hPSC LESC 차별화 이종-및 피더 세포 무료 조건 하에서 재현 하 고 효율적인 방법을 제공합니다. 첫째, 단층 문화 undifferentiated hPSC 재조합 laminin-521 (LN-521)에 정의 된 hPSC 매체의 차별점에 대 한 높은-품질 시작 물자의 강력한 생산 위한 기초 역할을 합니다. 둘째, 신속 하 고 간단한 hPSC LESC 차별화 방법 24 일만에 LESC 인구를 생성합니다. 이 방법은 작은 분자로, 정의 된 각 막 상피 분화 매체에 LN-521/콜라겐 IV 조합 매트릭스에 부착 문화 단계 다음에 4 일간 표면 ectodermal 유도 포함 합니다. Cryostoring와 확장된 차별화 더 세포 인구를 정화 하 고 대량 세포 치료 제품에 대 한 셀의 은행 수 있습니다. 결과 높은 품질 hPSC LESCs 치료 limbal 줄기 세포 결핍 (LSCD) 각 막 표면 재건을 위한 잠재적인 새로운 치료 전략을 제공 합니다.
Introduction
안구 표면에 투명 한 각 막 빛이 망막을 입력을 허용 하 고 눈의 굴절 힘의 대부분을 제공 합니다. 바깥쪽 레이어 층 화 각 막 상피를 지속적으로 limbal 상피 줄기 세포 (LESCs)에 의해 다시 생성 됩니다. LESCs corneoscleral 접속점1,2limbal 틈새의 기저 레이어에 상주합니다. LESCs 부족 구체적이 고 독특한 마커, 그래서 그들의 식별 putative 마커 집합의 더 광범위 한 분석을 요구 한다. 상피 녹음 방송 요인 p63, 및 특히 N 말기 잘린 p63의 알파 isoform의 (ΔNp63α), 관련 긍정적인 LESC 마커3,4으로 제안 되었습니다. LESCs의 비대칭과 자기 갱신, 하지만 또한 centripetally 및 anteriorly 마이그레이션하는 자손을 생산 수 있습니다. 세포 막 표면으로 진행 그들은 점차적으로 그들의 stemness 잃게 되 고 마지막으로 지속적으로 각 막 표면에서 손실 표면 편평 세포에 분화 말기.
각 막 층의 손상이 심각한 시각 장애, 이어질 수 있습니다 그리고 각 막 결함은 이렇게 전세계 시각 손실의 주요 원인 중 하나. Limbal 줄기 세포 결핍 (LSCD)는 limbus 질병 또는 conjunctivalization, 비전5,6의 후속 손실과 각 막 표면의 opacification 외상에 의해 소멸 됩니다. 세포 대체 요법 사용 헌 또는 수용자 limbal 이식 LSCD4,7,,89환자에 대 한 치료 전략을 제공 합니다. 그러나, 그리고 건강 한 눈에 합병증의 위험 곰 수확 자가 이식 기증자 조직 공급 부족 이다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs), 특히 인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 임상 관련 종류의 세포, 각 막 상피 세포를 포함 하 여 무제한 원천이 될 수 있습니다. 따라서, hPSC에서 파생 된 LESCs (hPSC-LESCs) 안구 세포 대체 요법에 대 한 매력적인 새로운 셀 소스를 나타냅니다.
전통적으로, undifferentiated hPSC 문화 메서드 및 LESCs 그들의 분화 프로토콜 정의 되지 않은 피더 세포, 동물 세라, 바른된 미디어 또는 양수 막10,11, 의 사용에 의존 해야 12 , 13 , 14 , 15. 최근, 노력 더 안전한 세포 치료 제품으로 표준화 하 고 이종 문화 및 분화 프로토콜에 대 한 검색 하 라는 메시지가 있다. 그 결과, undifferentiated hPSCs의 장기 문화에 대 한 여러 가지 정의 및 이종 무료 방법을 상용16,,1718지금 있다. 연속체, 각 막 상피 운명에 hPSCs 가이드 분자 신호에 의존 하는 프로토콜은 최근 되었습니다 감독된 차별화 도입19,20,,2122, 23. 아직 이러한 프로토콜의 많은 소재, 또는 차별화에 대 한 복잡 한, xenogeneic 증가율 칵테일을 시작으로 중 정의 되지 않은, 피더 기반으로 hPSCs를 사용.
이 프로토콜의 목적은 제공 하는 강력 하 고, 최적화, 이종 하-급지대 무료 hPSC 문화 방법 및 각 막 LESCs에 후속 차별화. 단층 문화 정의 알 부 민 무료 hPSC 매체 (특히 필수 8 플렉스)에 laminin-521 (LN-521) 매트릭스에 만능 hPSCs의 차별점에 대 한 균질 시작 물자의 급속 한 생산을 허용 한다. 그 후, 간단한 2 단계 차별화 전략 hPSCs 서 스 펜 션, 부착 차별화 LESCs 뒤에 표면 ectodermal 운명 향해 가이드. 24 일 이내 > 65% ΔNp63α를 표현 하는 세포 인구를 얻을 수 있습니다. Xeno 급지대 무료 프로토콜 셀 라인 특정 최적화에 대 한 어떤 요구 든 지 없이 여러 hPSC 라인 (hESCs 및 hiPSCs), 테스트 되었습니다. 주말 무료 유지 보수, 뿌리고, cryostoring 및 hPSC LESC 형질 여기 설명에 대 한 프로토콜 사용에 대 한 높은-품질 LESCs의 큰 배치의 생산 임상 또는 연구 목적.
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Protocol
탐 페 레 대학의 인간 배아에 대 한 연구를 수행 하 핀란드 (Dnro 1426/32/300/05) 법의학 담당 국가 기관의 승인이 있다. 연구소는 또한 파생, 문화, 및 hESC 라인 (Skottman/R05116)를 차별화 하 고 안과 연구 (Skottman/R14023)에서 hiPSC 라인을 사용 하는 Pirkanmaa 병원의 윤리 위원회의 지원 문이 있다. 아니 새로운 셀 라인은이 연구에 대 한 파생 되었다.
참고: 설명 프로토콜 기반으로 특정, 상용 hPSC 및 각 막 상피 분화 미디어 합니다. 제조 업체/공급 업체 정보 및 카탈로그 번호 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
1. 이종 급지대 무료 hPSC 문화 구축
- 준비
- 인간의 재조합 laminin-521 (LN-521)와 코트 24-잘 접시. 첫 번째 급지대 무료 (FF) 통과 위해 사용 하 여 LN-521 1.09 µ g/c m2의 농도에 그리고 0.55 µ g/c m2 에서 다음과 같은 구절에 대 한. 제안 된 LN-521 농도 성공적인 FF 문화에 대 한 시작 지점으로 제공 하지만 낮아질 수 있습니다.
- LN-521 유리병 제조 업체에 의해 지시 대로 4 ° C에서 천천히 녹여
참고: 적절 하 게 처리 LN-521 솔루션 저장 됩니다 4 ° C에 녹고 후 최대 3 개월. - 코팅 솔루션을 준비 하려면 희석 LN-521 재고 솔루션의 적절 한 금액으로 1 x Dulbecco의 Phosphate-Buffered 염 분 (DPBS) 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 잘 당 300 µ L의 총 볼륨을 포함 하.
- 피펫으로 웰 스, 코팅 솔루션 parafilm, 함께 잘 플레이트 및 4 ° c.에서 밤새 품 어 코팅된 판 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장할 수 있습니다.
(선택 사항): 또는 빠른 코팅 프로토콜에 대 한 37 ° C, 5% CO2에서 2 시간을 위한 코팅 솔루션 잘 접시를 품 어.
- LN-521 유리병 제조 업체에 의해 지시 대로 4 ° C에서 천천히 녹여
- 제조업체에서 지시 제공된 보완과 기저 매체를 보완 하 여 hPSC 문화 매체 (특히 필수 8 플렉스)를 준비 합니다. 추가 50 U/mL 페니실린-스. 정립은 빛과 높은 온도에 민감한 note. 보충을 해 동 하 고 따뜻한 실내 온도 (RT), 미디어 빛 으로부터 보호. 보충된 hPSC 매체를 사용 하 여 보충 날짜 로부터 2 주 이내.
- 인간의 재조합 laminin-521 (LN-521)와 코트 24-잘 접시. 첫 번째 급지대 무료 (FF) 통과 위해 사용 하 여 LN-521 1.09 µ g/c m2의 농도에 그리고 0.55 µ g/c m2 에서 다음과 같은 구절에 대 한. 제안 된 LN-521 농도 성공적인 FF 문화에 대 한 시작 지점으로 제공 하지만 낮아질 수 있습니다.
- LN-521에 FF 문화는 hPSC 전송
- 사전에 모든 필요한 재료와 층 류 두건에 rt 시 약 따뜻한.
- 급지대 레이어 (예: 사 인간의 포 피 (hFF) 또는 마우스 미 발달 섬유 아 세포)에 표준 문화 시스템 또는 표준 방법론을 사용 하 여 다른 FF 문화 시스템에서 통로 hPSCs. 예를 들어 hPSC 식민지 hFF 피더 세포에 교양 메스와 작은 조각과 조각 다음 바늘 팁과 분리 하는 해 부 수 있습니다. 인간의 PSCs FF 문화 시스템을 사용 하 여 양식 메서드 또는 사전 효소 치료 없이 뿌리고 클러스터를 사용 하 여 전송할 수 있습니다.
- 24-우물에서 LN-521 코팅 솔루션을 제거 하 고 잘 당 1 mL 미리 데워 진된 hPSC 매체를 추가.
참고: LN-521 건조 시 비활성화 것으로 건조 우물을 허용 하지 않습니다. - LN-521 코팅 24-웰 스는 피 펫과 hPSC 매체에 식민지 조각/셀 클러스터를 전송 합니다. 잘, 우물과 밀 피하 당 20-30 식민지 조각 전송 합니다.
- 대체 매체 hPSC 매체의 1 mL 하루 전송 및 매일 그 후 후. 문화 뿌리고 3-4 일 후 hPSCs 부드러운, undifferentiated 형태와 식민지를 밖으로 성장에 대 한 준비가 되었습니다. 참고로, 그림 1B 를 참조 (첫번째 이미지). 첫 번째 FF 통과 위해 완전히 confluent 단층 성장 식민지 수 없다는 하지만 문화는 식민지는 1 m m의 대략적인 크기를 도달 하는 때 passaged 한다.
- 뿌리고 및 FF hPSC 문화의 유지 보수
- 사전에 모든 필요한 재료와 층 류 두건에 rt 시 약 따뜻한.
- 두 번째 FF 통과 이후,에서 문화는 80-100 %confluency 도달 했습니다 때 FF hPSCs 통로. 새로운 LN-521에 통로 FF hPSCs 24-잘 접시 undifferentiated 형태와 높은 품질 문화를 유지 하 고 달성 먹이 처방 주말 무료 단일 셀 뿌리고 (월요일과 목요일)에 일주일에 두 번을 사용 하 여 코팅. 자세한 내용은,18,,2425를 참조 하십시오.
- 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +없이 1 x DPBS의 1 mL로 두 번 FF hPSCs 린스.
- 37 ° C, 5% CO2에서 잘 당 500 µ L 잠복기 FF hPSCs 이종 무료 트립 신-EDTA (특히 TrypLE 선택 효소)와 분리 합니다. 않을 최적의 부 화 시간에 대 한 셀을 모아만 분리 하지 수 있습니다. 이 보통 37 ° C, 5% CO2 에서 3 분 소요 (5 분을 초과 하지 않는).
- Xeno 무료 트립 신-EDTA를 제거 하 고 잘 정의 된 트립 신 억제제의 당 500 µ L를 즉시 추가.
- 주의 아직 철저 한 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 pipetting FF hPSCs을 분리 합니다. 미리 데워 진된 hPSC 매체를 포함 하는 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브로 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 FF hPSC 정지를 전송.
- HPSC 매체의 1 mL와 함께 우물을 세척 하 고 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브를 세척 매체를 추가.
- 300 x g에 5 분에 대 한 단일 세포 현 탁 액을 원심 셀 펠 릿을 발음 하 고, 1 mL 미리 데워 진된 hPSC 매체에 resuspend.
- Hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터 셀을 계산 합니다.
- 24-우물에서 LN-521 코팅 솔루션 (0.55 µ g/c m2)를 제거 하 고 1.2.3에서 hPSC 매체를 추가.
- 플레이트 FF hPSCs 0.55 µ g/c m2 LN-521에 40000-50, 000 셀/c m2의 세포 조밀도에 24-웰 스 코팅.
- 보통을 신선한 hPSC 매체 뿌리고, 후 일 그 후 일요일을 제외한 매일 바꿉니다.
- 세포 감 별 법 문화에 도달 했습니다 때 뿌리고, 후 3-4 일 사용 준비가 > 85 %confluency. hPSCs의 높은 품질을 보장에 대 한 이전 작품18,,2425에 자세히 설명 된 특성화 방법을 참조 하십시오. 그것은 karyotypic 변경 되지 않도록 하려면 뿌리고 단일 셀을 사용 하 여 ff로 시스템에 통로 레벨 15까지 문화 hPSCs만을 권장. 만 높은-품질, undifferentiated hPSCs를 사용 하 여 차별점에 대 한 자료를 시작으로.
2. 감독 차별화 및 hPSC에서 파생 된 LESCs의 Cryopreservation
- 준비
- Xeno 무료 기저 유도 매체 (기저 유도 매체) 준비: 보충 Dulbecco의 15% 이종 무료 혈 청 대체가 글의 중간 (특히 녹아웃 DMEM) 수정 (spesifically CTS 녹아웃 SR XenoFree), 2 m m L-글루타민, 0.1 m m 2- mercaptoethanol, 1% 비 본질적인 아미노산, 고 50 U/mL 페니실린-스. 기저 유도 매체를 사용 하 여 2 주 이내.
- 현 탁 액 문화에서 각 막 유도 대 한 미디어를 준비 합니다.
- 제 1 일: 5 μ M blebbistatin와 기저 유도 중간 보충.
- 주 2: 10 µ M SB-505124 및 50 ng/mL 인간 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF)와 기저 유도 중간 보충.
- 하루 3-4: 25 ng/mL 뼈 morphogenetic 단백질 4 보충 기저 유도 매체 (BMP-4).
- 각 막 상피 분화 매체 (차별화 매체, 특히 CnT-30) 부착 문화에 대 한 준비: 제조업체의 지침에 따라 기저 중간에 보충을 추가 하 고 50 U/mL 페니실린-스 추가.
참고: 차별화 매체 정립은 빛에 민감합니다. 보충된 차별화 매체를 사용 하 여 보충 날짜 6 주 이내. - 100 m m 조직 문화 요리 부착 차별화 코트 (단계 2.3 참조) (열 IV) 5 µ g/c m2 인간의 태 반 콜라겐 유형 IV의 혼합물 및 0.5 µ g/c m2 LN-521 1 x DPBS 포함 하는 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 총에에 희석 접시 당 5 mL의 코팅 볼륨입니다. 준비 하 고 열 IV와 코팅 및 LN-521 1.1.1.3에 설명 된 대로 저장.
-
단계 i: 각 막 유도 현 탁 액 문화에서
- 사전에 모든 필요한 재료와 층 류 두건에 rt 시 약 따뜻한.
- 단계 1.3.2.1–1.3.2.6의 설명 대로 FF hPSCs 이종 무료 트립 신-EDTA와 단일 세포 현 탁 액을 분리 합니다. 셀, 그리고 2-3 배 낮은 첨부 6 잘 플레이트, 5 μ M blebbistatin EB 형성을 유도 하는 것으로 보충 하는 기저 유도 매체의 3 mL의 총 볼륨에서에서 하룻밤 37 ° C, 5% CO2 (주 1) 당 106 셀을 배포.
- 다음 날 (주 2), 매체를 제거 하 고 기저 유도 매체 10 µ M SB-505124 및 50 ng/mL bFGF와 보충의 3 mL을 바꿉니다.
- 다음에 2 일 (3-4 일), 매체를 제거 하 고 기저 유도 매체 25 ng/mL BMP-4 보충의 3 mL을 바꿉니다.
- 단계 II: 각 막 분화 부착 문화에
- 사전에 모든 필요한 재료와 층 류 두건에 rt 시 약 따뜻한.
- 5 일에 100 m m 조직 문화 요리 5 µ g/c m2 열 4 및 0.5 µ g/c m2 LN-521 코팅에 EBs 다운 접시.
- 100 m m 조직 문화에서에서 코팅 솔루션을 제거 하 고 접시 당 미리 따뜻하게 차별화 매체의 10 mL을 추가.
참고: 건조 LN-521 건조 시 비활성화 것으로 요리를 허용 하지 않습니다. - EBs에서에서 전송 한 6 잘 플레이트 잘 2 세 100 m m 조직 문화 요리 (약 50 c m2당 EBs) pipetting으로. 부드러운 진동으로 EBs를 균등 하 게 배포 합니다.
- 100 m m 조직 문화에서에서 코팅 솔루션을 제거 하 고 접시 당 미리 따뜻하게 차별화 매체의 10 mL을 추가.
- 37 ° C, 5% CO2, 대체 매체 10 mL 신선한 차별화 매체의 다음 2.5-3 주 (월요일, 수요일 및 금요일)에 주 당 세 번에 부착 문화에 세포를 유지 합니다. 단계 대조 현미경을 사용 하 여 올바른 상피 형태학의 출현에 대 한 정기적으로 셀을 확인 합니다.
- 단계 III: 곳을 알아내는-뱅킹 hPSC 파생 된 LESCs
- 사전에 모든 필요한 재료와 미리 냉장 해야 cryopreservation 매체를 제외 하 고 층 류 두건에 rt 시 약 따뜻한.
- Xeno 무료 트립 신-EDTA와 hPSC에서 파생 된 LESCs를 분리 하 고 단계 1.3.2.1–1.3.2.6, 하지만 차별화 매체를 사용 하 여 FF hPSCs에 대 한 지시는 셀의 개수.
참고: hPSC에서 파생 된 LESCs에 대 한 최적의 부 화 이종 무료 트립 신-EDTA와 시간은 오래 (약 5 분). Xeno 무료 트립 신-EDTA와 정의 된 트립 신 억제 물 3 mL를 사용 하 여 100 mm 접시 당. - 계산 후 셀, 300 x g에 5 분 동안 반복 원심 분리 매체를 발음 하 고 미리 냉장, 이종 무료 hPSC cryopreservation 매체에 셀 펠 릿 resuspend. 피펫으로 각 cryotube 1 mL cryopreservation 매체에 0.5 ~ 1 x 106 셀이 포함 되도록 단일 cryotubes에 정지를 셀.
- 냉동 컨테이너와 전송 즉시 (5 분) 이내-80 ° C에 하룻밤 튜브를 놓습니다.
- 다음 날, 장기 저장을 위한 액체 질소에 튜브를 전송 합니다.
- 단계 IV: 녹고 cryopreserved hPSC-LESCs
- 녹고, 이전 5 µ g/c m2 열 4 및 0.5 µ g/c m2 LN-521 요리/잘 플레이트 코트.
- 사전에 모든 필요한 재료와 층 류 두건에 rt 시 약 따뜻한.
- 요리/우물에서 코팅 솔루션을 제거 하 고 미리 따뜻하게 차별화 매체의 적절 한 볼륨을 추가.
참고: 건조 LN-521 건조 시 비활성화 것으로 요리를 허용 하지 않습니다. - RT에 신속 하 게 세포를 해 동 하 고 즉시 미리 따뜻하게 차별화 매체의 5 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
- 300 x g 5 분 발음, 그리고 차별화 매체 cryopreservation 매체를 제거 하는 펠 릿 resuspend 세포 현 탁 액을 원심.
- 요리/웰 스 5 µ g/c m2 열 4 및 0.5 µ g/c m2 LN-521, 40000-50, 000 셀/c m2의 조밀도에 차별화 매체에 코팅에 셀 접시 37 ° C, 5% CO2, 대체 차별화 중간 3 회에서 세포를 유지 합니다.
3입니다. hPSC에서 파생 된 LESCs의 형질
- 질적 면역 형광 분석
- 면역 형광 검사에 대 한 5 µ g/c m2 열 4 및 0.5 µ g/c m2 LN-521 및 플레이트/해 동 hPSC-LESCs 40의 밀도에서 차별화 매체에 24 또는 12 잘 플레이트 웰 스 코트 000-50 000 셀/c m2.
- 문화는 confluency에 도달, 4 %paraformaldehyde (PFA)와 셀 수정: 웰 스 없이 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +1 x DPBS로 두 번 세척 하 고 4 %15-20 분을 품 어 PFA 실시간에 그 후, 모든 PFA 잔류물을 제거 하려면 1 x DPBS 두 번 씻어. 잘 당 솔루션의 사용 0.5-1 mL.
참고: 고정 된 셀 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 1 x DPBS에 최대 1 주일 이전에 얼룩.
주의: PFA 유독 하 고 부식성 이다입니다. PFA 증기 두건에서 처리 하 고 보호, 눈 보호, 그리고 장갑 착용. - 1 x DPBS 발음 및 1 x DPBS에 Triton X-100 0.1%와 10-15 분 동안 배양 하 여 세포 막 permeabilize.
- 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 1 x DPBS에 0.5 %BSA 실시간 준비 1 차적인 항 체 희석에서 1 x DPBS에서 1 h를 위한 잠복기 하 여 0.1% 트라이 톤 X-100 및 블록 특이 항 체 바인딩 사이트를 발음.
참고: 권장 기본 항 체 표 1 을 참조 하십시오. - 3 %BSA 발음 및 4 ° c.에 하룻밤 적절히 희석된 1 차 항 체로 품 어
- 3 웰 스 워시 x 5 분 1 x DPBS. 1 x DPBS에 0.5 %BSA 이차 항 체 희석을 준비 합니다.
참고: 권장된 2 차 항 체에 대 한 표 1 을 참조 하십시오. - 1 x DPBS를 발음 하 고 빛 으로부터 보호 하는 RT에 1 시간을 위한 적당 한, 적절 하 게 희석 이차 항 체와 함께 품 어.
참고:이 단계에서 샘플 형광 염료의 퇴색을 방지 하기 위해 빛 으로부터 보호 유지. - 3 웰 스 워시 x 1 x DPBS와 5 분을 마지막으로 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 형광 미디어를 마운트 마운트 counterstain 핵. DAPI는 제조업체의 지침에 따라 별도로 사용 하거나 설치 매체에 포함 될 수 있습니다. 장소 라운드 coverslips (직경 19 m m와 13mm 대 12-24-잘 접시, 각각)에 각 잘. 건조 및 탑재 된 샘플의 저장에 관한 제조업체의 지침을 따릅니다.
- 형광 현미경으로 얼룩진된 셀을 이미지.
- 정량적 면역 형광 분석
- HPSC에서 파생 된 LESCs 개체 안경에의 cytospin 샘플을 준비 합니다.
- 이종 무료 트립 신-EDTA와 hPSC에서 파생 된 LESCs를 분리 하 고 단계 2.4.2에서에서 지시 하는 대로 셀을 카운트.
- 후, 미리 냉장된 1 x DPBS와 300 x g. 조정 샘플 볼륨에서 5 분 동안 원심 분리기와 주어진된 cytocentrifuge, 예를 들면 의 제조업체의 지침에 따라 세포 농도 50000-100000 셀 추가 150 µ L의 샘플 볼륨에서 합니다.
- 개체는 cytocentrifuge 예: 28 x g 및 즉시 4 %15-20 분에 대 한 수정 프로그램에서 5 분와 안경 아래로 셀 스핀 PFA 실시간에서 1 x DPBS에서 권장된 회전 시간과 속도 대 한 주어진된 cytocentrifuge의 설명서를 참조 하십시오.
- 소수 성 원 샘플을 둘러싸고 경제적인 연습에 대 한 작은 물방울에 얼룩 수행 하 고 단계 3.1.3–3.1.8 사용 액체 차단 펜에 설명 된 대로 cytospin 샘플을 얼룩이 지기를 진행 합니다. 세척 과잉 항 체와 최소한의 배경 얼룩의 효율적인 제거를 보장 하기 위해 슬라이드 홀더, 컨테이너에서 수행할 수 있습니다. DAPI와 핵 counterstain 그리고 형광 미디어, coverslips 커버 장착으로 얼룩진된 샘플을 탑재. 건조 및 탑재 된 샘플의 저장에 관한 제조업체의 지침을 따릅니다.
- 형광 현미경의 예를 들어 10 배 확대를 사용 하 여 무작위로 선택 된 위치에서 샘플 당 5-10 이미지를 캡처하십시오.
- 예: ImageJ 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/) 도구와 총 (DAPI 긍정적인) 셀에 관하여 긍정적으로 얼룩진된 세포의 백분율을 견적 한다. 선호 분석 > 샘플 당 500 셀.
- ImageJ 소프트웨어에서 분석할 이미지를 엽니다. 이미지와 잡음 제거를 기본 가우스 블러와 함께 필터를 중복.
- 임계값을 만듭니다. 긍정적으로 얼룩진된 세포 핵의 최적의 선택으로 임계값을 조정 하 고 적용. 중복된 이미지 이진 보기 이제 변환 됩니다.
- 프로세스 이진 처리로 바이너리 이미지 도구 "채우기 구멍"와 "분수령" 자동으로 단일 핵을 대표 하는 병합 된 영역을 별도 것입니다.
- "입자 분석" 도구를 사용 하 여 명령을 적용 시 열립니다 ROI 관리자 창 관심사 (ROIs)의 자동으로 목록 영역을. 바이너리 이미지를 닫습니다.
- "모두 표시" ROI 관리자에서 선택 하 여 원본 이미지에 ROIs를 시각화 합니다. 얼룩진된 세포 핵의 올바른 선택을 확인 하 고 필요한 경우 수동으로 제거 하 고 개별 선택 추가.
- HPSC에서 파생 된 LESCs 개체 안경에의 cytospin 샘플을 준비 합니다.
- 교류 cytometry 분석
- P63α 식 수준 확인, cytometry에 대 한 셀을 얼룩.
- 이종 무료 트립 신-EDTA와 hPSC에서 파생 된 LESCs를 분리 하 고 단계 2.4.2에서에서 지시 하는 대로 셀을 카운트.
- 워시 1 mL로 두 번 셀 300 x g. 수정에서 5 분 동안 원심 및 4 ° c.에 20 분에 대 한 준비-사용 고정/permeabilization 솔루션 permeabilize 미리 냉장 1 x DPBS 그 후 세척 1 mL로 두 번 셀은 미리 세척 버퍼 permeabilizing x 1 차게.
참고:이 단계에서 계속 셀 4 ° C에서 또는 얼음에 달리 명시 되지 않는 한. - 주의: 고정/permeabilization 솔루션은 4.2% 포름알데히드를 포함 되어 있습니다. 증기 두건에서 위험한 솔루션을 처리 하 고 보호, 눈 보호, 그리고 장갑 착용.
- 5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 샘플 나눕니다. 각 샘플은 100000-200, 000 셀 포함 되어야 하 고 워시 버퍼 x 1의 약 100 µ L를 샘플 볼륨을 조정 합니다.
- 형광 색소 활용 된 항 체를 FACS p63-α의 2 µ L 추가 (권장된 하는 항 체에 대 한 참조 테이블의 장비 및 재료) 샘플 튜브로. 하나의 샘플 흠 없는 부정적인 제어 역할을 남겨 주세요. 소용돌이 샘플 1 h RT, 빛 으로부터 보호에 대 한 품 어 고.
- 워시 버퍼 x 미리 냉장된 1의 1 mL로 두 번 셀을 세척 하 고 마지막으로, resuspend 버퍼의 300 µ L와 펠 릿. 튜브를 저장 얼음, 빛 으로부터 보호 합니다.
- 교류 cytometer와 샘플을 분석 합니다. 흠 없는 부정적인 컨트롤 샘플을 사용 하 여 올바른 세포 인구의 게이팅에 대 한 형광 배경 신호를 제외. 최소 10000 p63-α의 분석-셀 스테인드. 자세한 기술 구현에 대 한 주어진된 교류 cytometer의 사용자 설명서를 참조 하십시오.
- P63α 식 수준 확인, cytometry에 대 한 셀을 얼룩.
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Representative Results
HPSC-LESCs에 hPSCs에서
FF hPSCs cryostoring hPSC-LESCs로의 분화 유도에서 전체 프로세스는 약 3.5 주 걸립니다. 그것의 주요 단계를 강조 차별화 방법의 도식 개요 그림 1A에 제공 됩니다. 그림 1B 는 프로토콜의 여러 단계에서 세포 인구의 일반적인 형태학을 보여줍니다. 제공 된 데이터 Regea08/017 hESC 라인과 UTA.04607.WT hiPSC 선, 파생와 앞에서 설명한26,,2728탐 페 레, 핀란드의 대학에서 특징 모두 얻을 수 있습니다.
LN-521 hPSC 매체에,에 undifferentiated, 고품질 FF hPSCs 먼저 합류 (그림 1B, 첫 번째 이미지)에 따라 균질 monolayers 병합 날카로운 가장자리와 함께 독특한 식민지를 형성 합니다. 여러 가지 개별적으로 파생 하 고 유전으로 명료한 hESC 및 hiPSC 라인 성공적으로 적응 하 고이 체계로 경작 했다. FF hPSC 인구 곱하기 약 3-fold 각 통로에서 이종을 생성 하는 강력한 수단을 제공-급지대 무료 차별점25에 대 한 자료를 시작. EB 매체에 24 h 유도 일반적으로 (그림 1B, 두 번째 이미지) 다양 한 크기의, 일반 EBs의 중단을 생성합니다. (주 2-4)에 표면 ectodermal 유도 중 EB 형태학 극적으로 변경 하지 해야 합니다. EBs는 차별화 매체 (그림 1B, 세 번째 및 네 번째 이미지), 열 4/LN-521 조합 매트릭스에 도금 차별화의 21-25 일 이내 셀 confluent 균질 레이어를 형성 후에 곧 식민지 파생물이 나타납니다. 다각형 형태 전형적인 상피 세포 (그림 1B, 5 번째 이미지). 셀 다음 나중에 사용할 cryostored를 수 있습니다. HPSC-LESCs (그림 1B, 마지막 이미지) 녹고 후 생존 및 형태학 잘 보존 되어 있습니다.
일반적으로, 도금 단일 6 잘 플레이트에 3 x 106 FF hPSCs 충분 한 EBs 2-3 셀 문화 요리 (100 mm)에 부착 한 문화에 대 한 도금을 얻을 수 있습니다. 각 100 mm 접시에서 1 ~ 1.5 x 106 세포 분화의 하루 22-25에 의해 cryobanking에 대 한 수확 수 있습니다. 평균, 각 undifferentiated FF hPSC 하루 25 (그림 2) 0.7 셀을 생성합니다.
HPSC에서 파생 된 LESCs의 유효성 검사
특정 LESC 마커 단백질의 부재, 올바른 세포 표현 형 감소는 pluripotency의 표현에 관련 된 단백질 및 식 인정 LESC 마커의 증가 마커의 세트로 확인 된다. 차별화의 날 24, hPSC에서 파생 된 LESCs 익스프레스 쌍의 대부분 상자 단백질 PAX6 (PAX6), p63α, 널리 인정된 LESC 마커 뿐 아니라 눈 개발의 주요 레 귤 레이 터. 가장 각 막 관련 ΔNp63α-긍정적인 세포 표현 형을 확인 p63α-긍정적인 세포의 대부분 잘린된 p63-isoform ΔNp63을 공동 표현 이다. 기저 상피 마커 및 상 상속 LESC 마커 cytokeratin (CK)-15 및 CK-14는 표현 부분, pluripotent 줄기 세포 표식 OCT3/4 및 성숙한 각 막 상피 마커 CK-12이 시점에서 감지는 반면. Unipotent limbal 상피 창시자 향해 FF hPSCs의 하지만 아직 터미널 분화 성숙 각 막 상피 세포로 나타냅니다. (그림 3A) HPSC-LESCs는 성공적으로 cryostorage ( 그림 3A에 비해 데이터)에서 복구 후 그들의 표현 형을 유지합니다.
차별화의 24 일 후 ΔNp63 66.2%에 표현 되었다 (n = 33, SD 9.3%) Regea08/017 hESC-LESCs, 그리고 65.7%에서 (n = 10, SD 4.1%) UTA.04607.WT hiPSC-LESCs (cytospin 샘플, 그림 3B에서 정량). Cryostorage, 82.2%에서에서 회복 후 (n = 10, SD 5.7%) hESC LESCs의 90.5% (n = 10, SD=3.7%) hiPSC LESCs의 표현 (하루 26-28, 그림 3B에잘 접시에서 계량) ΔNp63.
P63α 식 교류 cytometry 분석 Regea08/017 hESC-LESCs에 대 한 추가 확인 됐다. 차별화의 하루 25, 갓 차별화 된 hPSC LESCs의 62 %p63α 대 한 긍정적인 했다. Cryostorage (하루 28 총)에서 복구 후에 2 일 81 %p63α 양성 (그림 3C) 했다.
그림 1: hPSC LESC 차별화 프로토콜 (A) 전형적인 세포 형태학의 개요 그림 (B) 프로세스의 여러 단계에서 관찰. EBs는 높은-품질의 단일 세포 현 탁 액에서 형성 된다, 동안에 표면 ectoderm 향해 첫 24 h. 3 일 작은 분자 유도 undifferentiated hPSCs 부착 차별화 단계 뒤. 차별화의 날 24, 대부분 세포의 일반적인 LESC 같은 형태 표시. 대표 이미지를 전과 차별화 중 Regea08/017 hESC 라인에 대 한 표시 합니다. 규모를 블랙 바 = 200 µ m, 모든 이미지는 패널에 대 한 유효한. 약어: Blebb.: blebbistatin, SB: SB 505124 작은 분자 억제 물, bFGF: 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자, BMP 4: 뼈 morphogenetic 단백질 4, LN-521: 인간의 재조합 laminin 521, col IV: 인간의 태 반 콜라겐 유형 IV, hPSC: 인간의 만능 줄기 세포, EB: embryoid 몸, LESC: limbal 상피 줄기 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 예상된 셀 항복. 셀의 수를 보여주는 Boxplots 하루 22-25 일 0에 EB 형성 단계에 대 한 도금 undifferentiated hPSCs의 수로 나눈 차별화의 cryostoring에 대 한 취득. On 평균 0.72 (SD 0.4) 세포 각 만능 0.78 (0.67 SD) 세포 각 UTA.04607.WT hiPSC에서 제작 하는 동안 Regea08/017 hESC에서에서 생산 되었다. n: 차별화 실험의 수입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. HPSC에서 파생 된 LESCs의 표현 형 예상. 면역 형광 항 체 라벨 2 뿐만 아니라 눈 개발 레 귤 레이 터 PAX6 (A) 보여주는 균일 한 식 및 인정된 LESC 마커 p63α 및 ΔNp63 isoform의 다른 LESC 마커를-CK15 및 14를 제안 했다. Pluripotency 마커 OCT3/4 및 성숙한 각 막 상피 마커 CK-12는 부정적 이다. 대표적인 경우 이미지 차별화의 날 24 Regea08/017 hESC-LESCs에 대 한 표시. 바 규모 = 100 µ m. (B) ΔNp63 세포에서 갓 세 분화와 cryostored hPSC-LESCs 셀만 유지 하지 않습니다 하지만 증가 ΔNp63 cryostorage 후 식 보기를 보여 줍니다. 셀 계산 결과 표시 > 갓 차별화 된 hPSC LESCs의 65 %cryobanking 절차 전에 ΔNp63에 대 한 긍정적인 스테인드과 > 복구 후 80%. n = 별도 차별화 실험의 수 (샘플 당 최소 600 셀의 계산 및 > 1600 시간 포인트 당 세포) (C) 흐름 cytometry 분석 p63α에 대 한 긍정적인 갓 차별화 된 hPSC LESCs의 62%, 해 동된 세포의 81%를 보여주는 확인 선 Regea08/017에 대 한 결과 계산 하는 셀입니다. * B C에 해 동된 셀을 나타냅니다. 긍정적인 샘플 및 부정적인 (흠 없는) 샘플에 대 한 블랙 레드 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 항 체 | 호스트 | 희석 |
| IF에 대 한 기본 항 체 | ||
| PAX6 | 토끼 | 1: 200 |
| p63α | 마우스 | 1: 200 |
| ΔNp63α | 토끼 | 1: 200 |
| CK-15 | 마우스 | 1: 200 |
| CK-14 | 마우스 | 1: 200 |
| CK-12 | 염소 | 1: 200 |
| OCT3/4 | 염소 | 1: 200 |
| IF에 대 한 2 차 항 체 | ||
| 알 렉 사 Fluor 568 안티 염소 Ig | 당나귀 | 1:800 |
| 알 렉 사 Fluor 568 반대로 마우스 Ig | 당나귀 | 1:800 |
| 알 렉 사 Fluor 488 안티 토끼 Ig | 당나귀 | 1:800 |
| 알 렉 사 Fluor 488 반대로 마우스 Ig | 당나귀 | 1:800 |
표 1: 1 차 및 이차 항 체 면역 형광 (경우) hPSC에서 파생 된 LESCs의 라벨 사용 권장. 제조 업체에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜의 예상된 결과 성공적이 고 강력한 세대 LESCs의 FF hPSC의 단일 세포 현 탁 액에서 약 3.5 주 이내. 각 막 상피 표면 ectoderm29에서 개발, 프로토콜의 첫 번째 단계는이 혈통으로 hPSCs을 운영 목표로 합니다. 성장 인자 (TGF-β) 베타 길 항 제 SB-505124과 bFGF와 짧은 24 h 유도 세포 표면 ectoderm 향해 밀어 48 h mesodermal BMP-4 큐 다음 ectodermal 차별화를 유도 하는 데 사용 됩니다. 화학적 정의 차별화 매체와 열 4/LN-521 조합 매트릭스에 다음 부착 분화 단계 추가 안내 LESCs로 차별화 하는 데 사용 됩니다.
시작 자료 (FF hPSCs)의 높은 품질은 성공적인 차별화 중요 합니다. 만 FF hPSC 문화 합류 근처 및 미 분화 형의 100%를 사용 한다. 일반 hPSC karyotyping은 권장, 성장과 감 별 법 이점30이어질 karyotypic 이상 하 hPSCs를 predispose 수 있습니다 단일 셀 뿌리고. 트립 신에 장기간된 노출 부족 EB 형성 또는 hPSC 죽음을 발생할 수 있습니다. 프로토콜은 개별적으로 파생 된 5 및 유전으로 명료한 hPSC 라인, hESC와 hiPSC 라인을 모두 테스트 했습니다. 작은 분자 농도 또는 유도 시간 셀 라인 특정 수정에 대 한 필요가 없었다. 그러나, 프로토콜의 초기 최적화 하는 동안 과도 한 세포 죽음 또는 fibroblastic, 신경 또는 다른 형태와 셀의 모양을 표시 원치 않는 계보를 차별화. 이러한 경우에는 메서드 조정 필요할 수 있습니다. 문화 배 형식 출발점을 제공 하 고 권장된 크기에서 upscaled 될 수 있습니다.
수 있도록 쉽게 전환 좋은 제조 관행 (GMP)을 세포의 생산을 위한 치료 제품 LESC 차별화 및 cryopreservation hPSC 문화에서 전체 프로토콜 정의 됩니다. 상업 미디어 및 시 약 강력한 개발, 제조 및 품질 관리 절차를 받 다, 그들은 hPSC 문화 및 차별점에 대 한 일관 되 고 균일 한 품질 플랫폼 제공. 정의 된 조건을 최소화 일괄 배치 변형, 기존 hPSC LESC 차별화 프로토콜10,11,12,,1314, 에 비해 우위를 제공 하 20 , 22 , 23. 신속 하 고 비교적 간단한 프로토콜 또한 세포 선 및 실험실, 표준화 하 고 원하는 세포 유형31 정화 강력한 방법이 필요로 하기 어려운 3 차원 각 막 organoids 이점을 제공 ,32. 또한, 매우 효율적인 프로토콜 연구 목적, 예를 들면 질병 모델링, 유전자 공학, 약물 검사, 및 독물학 테스트에 대 한 LESCs를 생산 하는 강력한 수단을 제공 합니다. 또한, 플랫폼 쉽게 망막 색소 상피 세포 (RPE)25등 다른 눈 상피 세포 유형의 차별화에 대 한 미세 조정 될 수 있습니다.
성공적인 limbal 세포 대체 요법만 몇 천 p63-긍정적인 LESCs4, 눈, 당 필요 하지만 품질 보증 추가 세포 인구 그리고 그러므로 대규모 생산. Cryobanking 이식, 뿐만 아니라 품질 및 안전 테스트에 대 한 쉽게 사용할 수 있는 셀 주식 준비를 수 있습니다. 또한, hPSC-LESC 순도 cryostoring, 후 향상과 뿌리고와 장기 문화25, 증가 ΔNp63 식으로 제안 후 추가.
요약 하자면,이 강력한 메서드 이종-및 피더 세포 무료 문화 조건 3.5 주 이내 hPSCs에서 ΔNp63α-긍정적인 세포 생성합니다. 여기에 제시 된 셀 문화 방법 높은 품질 LESCs 눈에 적용 가능 세포 치료 사용의 생산 가능
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
연구 기술 및 혁신, 핀란드 (부여 번호 297886)의 아카데미, 인간의 예비 부품 프로그램 Tekes, 핀란드 자금이 체 기구에 의해 지원 되었다 핀란드 눈 및 조직 은행 재단 및 핀란드 문화 재단. 저자는 생물 의학 실험실 기술자를 Outi Melin, 한 나 Pekkanen, 엠마 Vikstedt, 및 Outi Heikkilä 우수한 기술 지원 및 세포 배양에 기여 감사합니다. 교수 카트리나 Aalto-Setälä 형광 이미징 장비를 제공 하 고 사용 하는 hiPSC 라인 BioMediTech 이미징 핵심 시설 제공을 위한 인정 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Reagent | |||
| 1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+ | Gibco | #14040-091 | |
| 1x DPBS without Ca2+ and Mg2+ | Lonza | #17-512F/12 | |
| 100 mm cell culture dish | Corning CellBIND | #3296 | Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation |
| 12-well plate | Corning CellBIND | #3336 | Culture vessel format for IF samples |
| 24-well plate | Corning CellBIND | #3337 | Culture vessel format for IF samples |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | #31350-010 | |
| 6-well plate, Ultra-Low attachment | Corning Costar | #3471 | Culture vessel format for induction in suspension culture |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21202 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit Ig | ThermoFisher Scientific | #A-21206 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-goat Ig | ThermoFisher Scientific | #A-11057 | Secondary antibody for IF |
| Alexa Fluor 568 anti-mouse Ig | ThermoFisher Scientific | #A-10037 | Secondary antibody for IF |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF, human) | PeproTech Inc. | #AF-100-18B | Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution | BD Biosciences | #554722 | Fixation and permeabilization solution for flow cytometry |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | #554723 | Washing buffer for flow cytometry |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | #B0560 | |
| Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) | PeproTech Inc. | #120-05A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #A8022-100G | |
| Cytokeratin 12 antibody | Santa Cruz Biotechnology | #SC-17099 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 14 antibody | R&D Systems | #MAB3164 | Primary antibody for IF |
| Cytokeratin 15 antibody | ThermoFisher Scientific | #MS-1068-P | Primary antibody for IF |
| CnT-30 | CELLnTEC Advanced Cell Systems AG | #Cnt-30 | Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation |
| Collagen type IV (human) | Sigma-Aldrich | #C5533 | Human placental collagen type IV |
| CoolCell LX Freezing Container | Sigma-Aldrich | #BCS-405 | |
| CryoPure tubes | Sarsted | #72.380 | 1.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation |
| Defined Trypsin Inhibitor | Gibco | #R-007-100 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2858501 | |
| GlutaMAX | Gibco | #35050061 | |
| Laminin 521 | Biolamina | #Ln521 | Human recombinant laminin 521 |
| ΔNp63α antibody | BioCare Medical | #4892 | Primary antibody for IF |
| OCT3/4 antibody | R&D Systems | #AF1759 | Primary antibody for IF |
| p63α antibody | Cell Signaling Technology | #ACI3066A | Primary antibody for IF |
| p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate) | Cell Signaling Technology | #56687 | p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry |
| PAX6 antibody | Sigma-Aldrich | #HPA030775 | Primary antibody for IF |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | #17-602E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | #158127 | Cell fixative for IF |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | #P36931 | DAPI mountant for hard mounting for IF |
| PSC Cryopreservation Kit | Thermo Fisher Scientific | #A2644601 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | #12563-011 | |
| KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | #10829018 | |
| KnockOut SR XenoFree CTS | Gibco | #10828028 | |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | #11140050 | |
| SB-505124 | Sigma-Aldrich | #S4696 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | Permeabilization agent for IF |
| VectaShield | Vector Laboratories | #H-1200 | DAPI mountant for liquid mounting for IF |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II | Tharmac | ||
| Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51 | Olympus |
References
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