Summary
ここでは、パラフィン切片を改善するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、切断と従来の方法に必要な転送処理を避けるために簡単な恒温室を使用して浮動小数点を兼ね備えています。その結果、そのままパラフィン切片数と効率が大幅に向上。
Abstract
組織学や病理学のパラフィン包埋組織の断面が使用されています。ただし、それは面倒です。この方法を改善するためにいくつかの民間企業は、液体の水を使用して複雑な部分転送システムを考案しています。この技術を簡素化し、我々 はカットとシンプルな恒温室; 内フローティングを組み合わせた自家製の機器を使用して単純なメソッドを作成したがって、セクションは自動的に水表面における水の風呂を入力します。アダルト ゼブラフィッシュ目マウス萌芽期の脳、成体マウス腎臓成体マウス脳海馬は、比較のため従来のパラフィン切片と提案手法の両方を使用して切られました。統計分析は、我々 の改良法時間を保存したし、高い品質のセクションを示しています。さらに、短時間で全体の標本のパラフィン切片ジュニア演算子の簡単です。
Introduction
形態学的研究は、生物学の研究が重要です。新技術は、全体の組織または生物1,2,3、薄い部分に試料を切断から直接彼らの目標は続いて染色を観察する研究者を許可しているが、プライマリのまま法者は唯一組織形態も組織に直接ターゲット蛋白質。光学顕微鏡を使用して、3 つのセクション タイプ: パラフィン、冷凍、およびグリコールメタクリル。セクショニングは共通組織抗原性を保護するため、試料の準備は簡単です、保有組織形態が悪いと薄い断面4,5には不向き。パラフィン切片は、保存状態の良い形態を展示するため最もよく使用される方法です。標本は完全に脱水し、ワックスに埋め込まれた、パラフィン ブロックに無期限に格納できます。また、パラフィン切片さらに実験の生物学的プローブ アクセスを改善し、Z 方向に細胞層オーバーレイを削減する薄いセクションを生成します。
しかし、従来のパラフィン切片がかかり、オペレーターのスキルを要求します。パラフィン切片を固定、脱水、埋め込み、切り取り、およびフローティング受けます。重要なは、風呂の水にナイフ ホルダーからセクション リボンを転送するは、ジュニアのオペレーターのためには必要なは難しいです。乾いた空気で特にセクション リボン静電気によるねじれが、暖かい水面に展開しにくい。セクションを改善するために品質、氷の水でそれらを浸すことまたはミクロトーム近く加湿器で湿度を上げるワックス ブロックを冷却のミクロトーム刃パス間公開される組織表面を潤し、6、7をお勧めします.ハイブリッド パラフィン包埋、セクショニング8、および商業部門転送システム支援9パラフィン切片を改善するための新しいメソッドが含まれます。これらのメソッドは、部分的にパラフィンを向上させる彼らははるかに厄介な断面を作る、商務部搬送システムは高価なセクショニング速度と品質。
このプロトコルでは、簡単、安価で柔軟な装置ステップバイ ステップ、回転式ミクロトームのナイフ ホルダーに接続することができますを作成する方法を示します。この装置は、温度検出スイッチ付きのヒーター、水風呂セクション チャネルで構成されます。切断した後、セクションの数十はセクション チャネルに流れるし、風呂の水、直接このように自動的に展開を入力します。これはパラフィン切片の効率が向上し、この技術をより便利になります。このメソッドよりアダルト マウス海馬セクション、成体マウス腎臓セクション、胚 15.5 日齢 (E15.5) マウスの脳のセクション、およびセクションを短い時間で収穫し、形態学的によりそのまま残った大人ゼブラフィッシュ眼を使用します。このメソッドは、加速されたパラフィン セクション区別の喪失を回避しながら断面を必要とする他の組織サンプルの使用もできます。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、動物のケアと使用南昌大学委員会によって承認されています。
1. 機器をアセンブルし、ミクロトームを接続
- 要件 (補助図 1) あたりパラメーターを設計します。
- アクリル板を製造するローカル工場にパラメーターを送信します。
- シーケンスのすべての部品を組み立てる: クロロホルムを使用してタンクに 7 商業アクリル板を組み合わせてセクション チャネルと水お風呂 (図 1)。
注意: 光と酸素を満たしているとき、クロロホルムは有毒物質を生成します。ヒューム フードの装置を組み立てます。 - アクリル板 #1 (図 2 a,矢印) に穴を介して管状電気加熱要素をインストールします。
- 温度コント ローラーをインストールするのには、電気ドリルを使用して #2 アクリル板に小さな穴を作成し、温度検出器 (図 2 a,矢印) をインストールします。タンク (図 2 a) にデジタル サーモスタットをインストールします。
注: 温度検出器は水面下 1 cm 以内にする必要があります。 - 電源アクセスを提供するために、機器の電源を入れる前に 24 V 以下の電圧を調整します。
- ミクロトームから切片屑トレーを取り外します。
- 中立的なシリコーン ・ シーラント (図 2 b) ミクロトーム ナイフ ホルダーを含むセクション チャネルにリンクします。
注: 刃の上の上の中立シリコーン ・ シーラント中傷されず古い刃は簡単に交換できるようにします。 - クロロホルムと固化する中立的なシリコン シール剤の時間を許可するために一晩乾燥させます。
- ブレード ホルダーに刃をインストールします。(図 2) 風呂の水に水を注ぐ。水表面だけブレード (図 2 D,アロー ・ ヘッド) の上部に触れる必要があります。
2. パラフィン切片
注: 破片は、多くの場合ワックスのブロックと水の表面の上下端に蓄積します。この残骸は、定期的にクリアする必要があります。
-
従来のパラフィン切片10を実行します。
- 回転式ミクロトームのパラフィン包埋標本をクランプし、ブレード ホルダーにブレードを配置します。
- ハンド ホイールを切り、標本をセクションします。
- パラフィン切片のリボンを 38.5 ° C の温水浴に転送します。
- 顕微鏡にセクションを展開した後の水面からスライドをピックアップします。
- 42 ° C のオーブンでスライドを一晩乾かします。
-
改良されたパラフィン切片 (図 3)
- 機器の電源を。
- 温度検出スイッチでヒーターを開き、40.0 ° C 1 時間事前に水を暖めるために 38.0 ° C 間ターゲットの温度を設定します。
- パラフィン包埋にしたパラフィン ブロックを変更します。ミクロトームのカセット クランプにパラフィン ブロックを配置し、それをロックします。
注意: パラフィン ブロックの優れたと劣るボーダーは、円弧を形成し、狭いセクション チャネルを通過することができないからセクション リボンを防ぐために水平方向に変更ください。 - 切断より厚いセクションでサンプルの迅速なアプローチします。
- 適切なセクションの厚さ (成体マウスの脳、成体マウス腎臓、胎児マウスの脳に 10 μ m、ゼブラフィッシュの目 4 μ m) を調整します。ハンド ホイールを切り、セクションは、セクション チャネルと風呂に自動的に入力されます。
- ゆっくりと均一な切断ストローク (図 3 a) で標本をセクションします。
注: ハンド ホイールが数分間停止した後の最初のセクションが変更されます。セクションは連続した傷がある場合、替刃を置き換える必要があります。 - ライン (図 3 b、3 C) で浮かぶ風呂室にセクションをガイドします。
注: 場合は head セクションは、チャンバー壁に準拠して、浮いた状態を保つにブラシ ガイドを使用します。 - 顕微鏡スライド上にセクションを遵守します。セクションの後完全に風呂の水、ピンセットで別のいくつかのセクションで展開します。顕微鏡のスライド (図 3 D) に風呂の水からそれらをピックアップします。
注: セクションする必要がありますピックアップする水のバスの後方からセクション チャネルと水お風呂の前のそれらがまだできないので完全に展開。 - 一晩 42 ° C のオーブンでそれらを配置することによって、スライドを乾燥します。スライドは、無期限に室温で格納されることができます。
- ヘマトキシリン ・ エオジン (HE) 染色法の改良8の評価のために使用します。
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Representative Results
改善方法は、そのままパラフィン セクションの数を高めた。成体マウス海馬組織、成体マウス腎臓、マウス萌芽期の脳、ゼブラフィッシュの目のこの新しいメソッドをテストしました。タンクに水を追加し、40.0 ° c. に 38.0 ° C 水の温度に維持されました。準備した後、順次組織サンプル、切断され、従来区分と比較しています。新しいメソッドは、断面欠損を回避し、成体マウス海馬、成体マウス腎臓、E15.5 マウスの脳は、成人ゼブラフィッシュ目 (図 4 a、4 C、4 e、4 G) でそのままセクションの割合を増加します。結論として、本手法は断面欠損を回避しよりそのままセクションごとに試料を採取して断面を改善しました。
法の改善には、1 試料当りの時間が減少しました。従来法と私たちの改良法の間に撮影時間を比較すると、全シリーズが成体マウス海馬、成体マウス腎臓、E15.5 マウスの脳は、大人の断面 (器官の最後のセクションを最初のセクション) から行ったゼブラフィッシュの目。改良法がセクショニング速度すべてのテストされたサンプル (図 4 b、4 D、4 f、4 H) にパラフィンを加速したことが示唆されました。一般的に、私たちのメソッドは、高速高品質パラフィン切片のできました。
ゼブラフィッシュ視神経網膜のシリーズ セクションは、H ・ E 染色で観察されました。シリーズは、ゼブラフィッシュの網膜の視神経乳頭のセグメントのセクショニングのため法の改善から収穫されるセクションが優れていた従来のパラフィン切片作製法 (図 5 a, 5 b) からのそれらよりもより良い整合性を持ちます。最も収穫セクション (図 5、5 D) の品質に関するこれらの 2 つの方法間に有意差はありませんでした。時折、従来から収穫の品質が比較的低い (図 5E5 階)。
図 1: タンクに 7 商業アクリル板を組み立てるためのプロセスです。(A) 7 アクリル板の全般的な眺め。(B G)#7 ボード基板 # 1 からタンクの段階的なアセンブリ。(H) アセンブリ後主タンク。(I) 一般的な水槽のサイズ;タンク表面の保護膜は、さらにインストールの削除されました。L = 400 mm、L' = 220 mm、H = 122 mm、W = 200 ミリメートルこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 2: 適切に組み立てられた装置の使用の準備ができています。(A) そのまま装置、回転式ミクロトームに接続されている後。矢印表示、温度検出器は、電気ドリルで小さな穴がインストールされます。#1 掲示板の穴に通して矢印ヘッド、ヒーター (電気要素) を設置します。(B) のミクロトーム刃ホルダーとセクション チャネル間の接続、機能の増幅された破線領域。矢印の頭、ブレード ホルダー、セクション チャネルは、中立シリコーンの密封剤によって接続されます。(C) B の水と同じ注ぎ、ブレードにインストールされています。(D) C. 矢印破線部側面図、水面はブレードの端に近い。VT: 変圧器;WB: 湯せん;DT: デジタル サーモスタットです。B: ブレード;BH: ブレード ホルダー;SC: セクション チャネル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: セクショニング プロセス改良されたパラフィン。左下にある数字は、それぞれ A ~ D の増幅の破線エリアです。矢印表示、最初のセクション。(A、A')セクションは、セクション チャンネルすぐにおよび直接後切削を入力します。(B、B')セクション リボンは、セクション チャネルと水のお風呂の間の国境を越えた。(C, C')セクションで水浴の後にフロートし、十分に折られました。(D、D')セクションは顕微鏡のスライドによってピックアップ、彼らは水のバスの後部に達するし、十分に折られたとき。SC: セクション チャネル;WB、水浴。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 改良断面法全体シリーズのセクションの大幅効率や歩留まり率の改善します。歩留まり率すべてカット セクションでそのままセクションの割合に匹敵します。データは、平均 ± SEM で表示され、同じ演算子が取得した.(A, C, E, G)化防止成体マウス海馬の断面欠損 (91.04 ± 1.429% N 3、対97.63 ± 0.4864 %n = = 3, p = 0.0120)、大人マウスの腎臓 (92.30 ± 0.5689% N 3、対95.99 ± 0.7055 %n = = 3, p = 0.0153)、E15.5 マウス脳 (90.67 ± 1.549%、N = 3対97.01 ± 0.2816%、N = 3, p = 0.0158) と大人のゼブラフィッシュ目 (91.27 ± 0.9734 %n = 4対96.32 ± 0.7217 %n = 4、p = 0.0059)。(B、D、F、H)保存法の改良に、成体マウス海馬の従来法と比較 (126.0 ± 3.606 分対79.67 ± 1.856 分、N = 3, p = 0.0003)、アダルト マウスの腎臓 (66・67 ± 1.764 分対41.33 ± 2.186 分、N = 3, p = 0.0008)、E15.5 マウス brアイン (99.67 ± 3.480 分対52.33 ± 4.333 分、N = 3, p = 0.0010) と大人のゼブラフィッシュ目 (48.00 ± 2.160 分対30.75 ± 1.797 分、N = 4、p = 0.0009)。* P < 0.05、* * P < 0.01、* * * P < 0.005。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: H ・ E 染色同じ演算子によるゼブラフィッシュ目従来の方法から取得し、パラフィン切片を改善の視神経乳頭のセグメントの全体シリーズ セクションが比較されます。(A) 従来パラフィン切片作製 (21 セクション)。(B) 改良されたパラフィン断面 (24 節)。(C) A6 の破線の領域。(D) B7 の破線の領域。(E) A17 の破線の領域。(F) B19 の破線の領域。アスタリスク、比較的貧しい品質のセクション。矢印の先端は視神経乳頭。矢印、網膜組織の深刻な涙。スケール バー = 200 μ m (A と B)。スケールバー = 50 μ m (C、D、E、F) です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: 7 の市販のアクリル板の寸法パラメーター 。数は、対応するボードの余白の長さを表します。単位: ミリメートルファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください。 。
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Discussion
パラフィン セクション形態を改善し、従来のパラフィン切片中の無駄な時間の問題を解決するには、改良されたパラフィン切片作製法切削と展開を組み合わせたを作成しました。この改良法は、セクション チャネル、水浴と温度検出スイッチとヒーターで構成されるシンプルな機器に依存します。セクション リボン セクション チャネルを介して水の風呂に入るし、自動的に切削しながら展開します。したがって、このメソッドは、パラフィン切片作製の品質と効率性は、成体マウス海馬、成体マウス腎臓、E15.5 マウスの脳は、大人のゼブラフィッシュ目のパラフィン切片によって確認されたを向上します。
従来のパラフィン切片作製中にカーリングのセクションを避けるためには、多くの調整を行った組織表面を潤し、ワックスのブロックを冷却、湿度を増やすこと、セクショニング6,7を組み合わせることなど 8;ただし、これらの調整、パラフィン切片より退屈です。液体の水に依存する商業セクション転送システムより成功しています。このシステムでセクションが刈取直後後水表面を接触し、電気モーター駆動の水の流れは、低温水バス9ブレード ホルダーからセクションを転送します。その機構により静電気は、改善された断面品質断面を阻害しません。さらに、このシステムは、風呂の水にナイフ ホルダーからのセクションを手動で転送を回避と壊れやすいセクションを簡単に傷つけることができます高品質の薄いセクションを取得するのに。
私たちの改善された方法と簡単な装置をいくつかの利点を持つ商業セクション転送システムの経験を描画します。まず、装置は安く、開発途上地域の研究所でこのメソッドを普及できるし、商務部転送システムを補完することがあります。第二に、装置の水は静的であり、決して薄いセクションを取得するセクションを妨げます。我々 は連続して改善法を用いた 2 μ m の厚みのゼブラフィッシュ目を断面と高品質の取得セクション。第三に、大きい風呂水槽は少なくとも 40 のセクションを展開し、協力する 2 つの演算子をできるようにフローティングを可能にする機器で使用されます。一人は継続的に組織標本を切ることができるし、他のセクションを魚することができます直接。これには、展開するセクションを待っている時間が短縮されます。制服切断ストロークで連続切削もセクションの品質が向上します。
構造と私たちの単純な装置の外観の改善が必要です。たとえば、ようにこの装置をより積分とポータブル電源、ヒーター、温度コント ローラーなどのコンポーネントを統合できます。さらに、商業回転式ミクロトームは、異なるサイズを持っています。他のミクロトームに接続、この装置の高さと角度を調整する必要があります。神経生物学、組織形態、その他の研究フィールド11,12,13では、パラフィン切片他の分子の手法と組み合わせるが使用されています。潜在的に、このメソッドでは、臨床検査効率14,15とここで使用される 3 つの組織の種類を超えて他の生物的標本を向上できます。
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Disclosures
著者は、このデバイスの特許を持っているし、競争の興味を宣言しません。
Acknowledgments
この作品は中国の国家自然科学基金 (許可番号 31400936、31460260) によって支えられた、自然科学財団の江西省の中国 (20171BAB215020)。我々 はまた、この作業を支援する南昌大学とクイーン クイーンメアリー、ロンドン大学との共同プログラムを感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12 V 200 W) | |||
| Temperature controller(12 V 120 W) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
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