Summary
在这里, 我们提出了一个改进石蜡切片的协议。这种方法结合切割和浮动使用一个简单的恒温室, 以避免转让过程中所需的传统方法。结果表明, 石蜡切片的效率和数量均有显著提高。
Abstract
石蜡嵌入组织切片被广泛应用于组织学和病理学。然而, 这是乏味的。为了改进这种方法, 几家商业公司利用流体水设计了复杂的断面传输系统。为了简化这项技术, 我们创建了一个简单的方法, 使用自制的设备, 结合切割和浮动在一个简单的恒温室;因此, 各部分自动进入水浴在水面上。用常规石蜡切片和所提出的方法进行比较, 对成年小鼠脑、成年小鼠肾脏、胚胎小鼠大脑和成年斑马鱼眼的海马体进行切割。统计分析表明, 改进后的方法节省了时间, 产生了较高的质量剖面。此外, 在短时间内石蜡切片的整个标本是容易的初级操作者。
Introduction
形态学研究在生物研究中具有重要意义。虽然新技术允许研究人员直接从整个组织或有机体观察他们的目标1,2,3, 切割标本成薄切片, 其次是染色, 仍然是主要的方法 fornot 组织形态学, 也可直接在组织中进行蛋白靶向。光镜使用三切片类型: 石蜡, 冷冻和半薄切片。虽然 cryosectioning 是常见的保护组织抗原性, 标本准备是简单的, 保留组织形态学较差, 不适合薄切片4,5。石蜡切片是展示保存完好的形态学最常用的方法。由于试样完全脱水, 并嵌入蜡, 石蜡块可以无限期储存。此外, 石蜡切片产生薄切片, 以改善生物探针进入进一步的实验和减少细胞层叠加在 Z 方向。
然而, 传统的石蜡切片是繁琐的, 需要操作员的技能。石蜡切片经过固定, 脱水, 嵌入, 切割和漂浮。重要的是, 将节带从刀座转移到水浴是必要的, 但对于初级操作者来说是困难的。特别是在干燥的空气中, 节带会由于静电而扭曲, 在温暖的水面上很难展开。为提高切片质量, 在切片刀片通过后, 将所暴露的组织表面湿润, 将蜡块浸泡在冰水中, 或者在切片附近用加湿器提高湿度, 建议6、7.改进石蜡切片的新方法包括混合石蜡嵌入, cryosectioning8和商业部分转移系统协助9。虽然这些方法部分提高了石蜡切片的速度和质量, 但它们使切片变得更加繁琐, 商业剖面转移系统是昂贵的。
在本协议中, 我们演示如何逐步创建简单, 廉价和灵活的设备, 这可以连接到旋转切片的刀片持有人。该设备由截面通道、水浴和带有温度检测开关的加热器组成。切割后, 大量的断面流进断面通道, 直接进入水浴, 从而自动展开。这提高了石蜡切片的效率, 使该技术更方便。使用这种方法, 更多的成年小鼠海马切片, 成年小鼠肾脏切片, 胚胎15.5 天老 (E15.5) 小鼠脑切片, 和成年斑马鱼眼切片被收获在较少的时间, 并保持更完整的形态。这种方法也可以用于其他组织样品, 需要加速石蜡切片, 同时避免损失的部分区分。
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Protocol
这里介绍的所有方法均经南昌大学动物保育委员会批准。
1. 装配设备并连接切片
- 根据要求设计参数 (补充图 1)。
- 将参数提交当地工厂生产丙烯酸板。
- 按顺序装配所有部件: 使用氯仿将7个商业丙烯酸板组合成一个带有截面通道和水浴的水箱 (图 1)。
注意: 氯仿在遇到光和氧时会产生有毒物质。把器具装配在通风罩里。 - 将管状电热元件通过压克力板 #1 (图 2A、箭头) 安装在孔中。
- 要安装温度控制器, 请使用电钻在 #2 丙烯酸板上创建一个小孔, 并安装温度检测器 (图 2A、箭头)。在水箱上安装数字恒温器 (图 2A)。
注: 温度探测器应在水面以下1厘米以内。 - 要提供电源接入, 请在打开设备前调整电压低于 24 V。
- 从切片中移除剖面废物托盘。
- 用中性硅胶密封胶将截面通道与切片刀片架连接 (图 2B)。
注: 请勿涂抹在刀片顶部上方的中性硅胶密封胶, 使旧刀片易于更换。 - 夜间干燥, 允许氯仿和中性硅酮密封胶时间固化。
- 将刀片式服务器安装到刀片式服务器上。将水倒入水浴中 (图 2C)。水面应该只是触摸刀片的顶部 (图 2D,箭头头)。
2. 石蜡切片
注: 碎屑经常堆积在蜡块和水面的上缘或下边缘。这些碎片应定期清除。
-
执行常规石蜡切片10。
- 将石蜡嵌入试样夹在旋转切片上, 将刀片置于刀片夹持器中。
- 转动手轮和切片试样。
- 将石蜡切片的丝带转移到38.5 摄氏度温水浴。
- 展开后, 从水面上的显微镜上把切片捡起来。
- 将烤箱中的幻灯片干燥42摄氏度。
-
改进石蜡切片 (图 3)
- 打开设备。
- 打开加热器与温度检测开关, 并设置目标温度之间的38.0 °c 到40.0 °c, 提前1小时, 以温暖的水。
- 修改石蜡嵌段获得的石蜡块;然后把石蜡块放在切片的卡带钳上, 然后锁上。
注: 应水平调整石蜡块的上、下边界, 防止截面带状形成弧形, 无法流经狭窄断面通道。 - 通过剪切较厚的部分快速接近样品。
- 调整到合适的断面厚度 (10 µm 成年小鼠大脑, 成年小鼠肾脏, 胚胎小鼠大脑, 4 µm 为斑马鱼的眼睛)。转动手轮, 各部分将自动进入截面通道和浴缸。
- 切片的标本在一个缓慢和均匀的切割冲程 (图 3A)。
注: 第一节的 Thethickness 将在手轮停止几分钟后改变。当切片有连续划痕时, 应更换一次性刀片。 - 将各部分引导至浴腔内以直线浮动 (图 3B、3C)。
注: 如果头部部分附着在腔壁上, 请使用画笔导轨使其浮动。 - 将部分粘贴到显微镜幻灯片上。在水浴中充分展开部分后, 用镊子分隔几个部分。然后将它们从水浴中接上显微镜幻灯片 (图 3D)。
注: 应从水浴后部拾起部分, 因为部分通道和水浴的前部仍未完全展开。 - 把这些幻灯片放在一个42摄氏度的烤箱里过夜。然后可以无限期地将幻灯片存储在室温下。
- 应用苏木精-伊红 (he) 染色, 以评价改进方法8。
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Representative Results
改进后的方法增加了完整石蜡切片的数量。我们对成年小鼠海马组织、成年小鼠肾脏、胚胎小鼠大脑和斑马鱼的眼睛进行了新的检测。水被增加到坦克, 并且水温保持在38.0 °c 之间到40.0 °c。在连续制备组织样品后, 切片并与常规切片进行比较。该方法避免了切片丢失, 增加了成年小鼠海马、成年小鼠肾脏、E15.5 鼠脑和成年斑马鱼眼中完整切片的比例 (图 4A、4C、4E、4G)。最后, 我们的方法改进了切片, 防止切片损失和收获更完整的切片每标本。
改进后的方法减少了试样的花费时间。在比较常规方法和改进方法之间的时间时, 我们对成年小鼠海马、成年小鼠肾脏、E15.5 鼠脑和成人进行了全系列切片 (从第一节到器官的最后一节)。斑马鱼的眼睛。结果表明, 改进后的方法在所有测试样品中加速了石蜡切片速度 (图 4B、4D、4F、4H)。一般而言, 我们的方法允许更快的高质量石蜡切片。
用 H 和 E 染色观察了斑马鱼视网膜的一系列切片。对于斑马鱼视网膜的视神经盘段的序列切片, 从改良方法中提取的切片比常规石蜡切片法更好的完整性 (图 5A、5B)。这两种方法对大多数收获部分的质量没有显著差异 (图 5C、5D)。有时, 从传统方法中收获的部分的质量相对较低 (图 5E、5F)。
图 1: 将7个商业丙烯酸板组装成罐体的过程.(一) 7 个亚克力板的整体看法。(B G)从1号板到板 #7 的水箱逐步组装。(H) 装配后的主水箱。(一) 一般水箱尺寸;卸下罐面上的保护膜进行进一步安装。l = 400 毫米, l ' = 220 毫米, H = 122 毫米, W = 200 毫米.请单击此处查看此图的较大版本。
图 2: 适当组装好的设备, 供使用.(A) 连接到旋转切片后的完好设备。箭头指示, 温度探测器通过电钻安装在小孔上。箭头头, 加热器 (管式电热元件) 安装在板孔 #1。(B) 放大的虚线区域, 切片刀片持有者与剖面通道之间的连接特征。箭头头, 刀片持有人和部分渠道连接的中性硅胶密封剂。(C) 与 B 相同, 浇水和刀片安装。(D) 在 c 箭头头的虚线区域的侧面视图, 水面接近刀片边缘。: 电压互感器;世界银行: 水浴;DT: 数字恒温器;B: 刀片;BH: 刀片持有人;SC: 节频道。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 改进石蜡切片工艺.位于左下角的数字分别为放大的虚线区域。箭头指示, 第一个部分。(a、a)截割后立即直接进入剖面通道。(b、b)节带穿过剖面通道和水浴之间的边界。(c、c)剖面漂浮到水浴的后部, 并充分展开。(d、d)当它们到达水浴的后部并充分展开时, 这些切片会被显微镜下的幻灯片所拾取。SC: 区段渠道;世界银行, 水浴。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 改进的切片方法提高了全系列断面的效率和成品率.屈服率相当于所有切口部分完整截面的比例。数据显示为均值电子扫描电镜并由同一操作者获取。(A、C、E、G)改进的方法防止了成年小鼠海马段的丢失 (91.04 1.429% N = 3, vs 97.63, 0.4864% N = 3, p = 0.0120), 成年小鼠肾脏 (92.30 @ 0.5689% n = 3, vs 95.99) 0.7055% n = 3, p = 0.0153), E15.5 鼠脑 (90.67 @ 1.549%, N = 3 vs 97.01 0.2816%, N = 3, p = 0.0158), 和成年斑马鱼眼睛 (91.27 @ 0.9734% n = 4 vs 96.32, 0.7217% n = 4, p = 0.0059)。(B、D、F、H)改进的方法节省时间与常规方法相比, 成年小鼠海马 (126.0 @ 3.606 分钟vs 79.67 @ 1.856 分钟, N = 3, p = 0.0003), 成年小鼠肾脏 (66.67 @ 1.764 分钟vs 41.33 * 2.186 分钟, N = 3, p = 0.0008), E15.5 鼠标 br第 (99.67) 3.480 分钟vs 52.33 @ 4.333 分钟, N = 3, p = 0.0010), 和成年斑马鱼眼睛 (48.00 @ 2.160 分钟vs 30.75, 1.797 分钟, N = 4, p = 0.0009)。* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.005。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 对从常规方法获得的斑马鱼眼中的全系列部分的 H 和 E 染色进行比较, 并对同一操作者的石蜡切片进行改进.(A) 常规石蜡切片 (21 节)。(B) 改进石蜡切片 (24 节)。(C) A6 的虚线区域。(D) B7 的虚线区域。(E) A17 的虚线区域。(F) B19 的虚线区域。星号, 部分质量相对较差。箭头头, 视盘;箭, 视网膜组织的严重撕裂。刻度条 = 200 µm (A 和 B);刻度条 = 50 µm (C、D、E、F)。请单击此处查看此图的较大版本.
补充图 1: 7 商业丙烯酸板的尺寸参数.该数字表示相应板边距的长度。单位: mm,请点击这里下载此文件.
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Discussion
为改善石蜡切片形貌, 解决常规石蜡切片过程中的浪费时间问题, 我们建立了一种改进的石蜡切片方法, 结合切割和展开。这种改进的方法依赖于简单的设备, 包括剖面通道, 水浴和加热器与温度检测开关。节带通过剖面通道进入水浴, 并在切割时自动展开。因此, 该方法提高了石蜡切片的质量和效率, 这是通过石蜡切片的成年小鼠海马, 成年小鼠肾脏, E15.5 小鼠的大脑, 和成年斑马鱼眼睛验证。
为了避免在常规石蜡切片期间卷曲, 许多调整, 如滋润组织表面, 冷却蜡块, 增加湿度, 并结合 cryosectioning6,7, 8;然而, 这些调整使石蜡切片更繁琐。一个依赖于流体水的商业部门转移系统更加成功。在该系统中, 该剖面在切割后立即接触到水面, 电机驱动的水流将截面从刀片持有者转移到下温水浴9。由于其机理, 静电不会抑制切片, 从而提高断面质量。此外, 由于该系统避免手动将部分从刀片持有人转移到水浴, 容易损坏易碎的部分, 它也有助于获得高品质的更薄的部分。
通过改进的方法, 简单的设备借鉴了商业断面传输系统的经验, 具有一定的优越性。首先, 设备比较便宜, 可以在开发区域的实验室推广这种方法, 可以补充商业部门的转移系统。第二, 设备中的水是静止的, 不会干扰部分, 从而可以获得较薄的部分。采用改进的方法, 对斑马鱼的2µm 厚度进行了连续切片, 获得的切片质量较高。第三, 在设备中使用较大的水浴水箱, 允许至少40节同时展开和浮动, 允许两个操作者进行合作。一人可以连续切下组织标本, 另一种可以直接将切片钓上来。这样可以减少等待节展开的时间。连续切割与均匀切削冲程也改善剖面质量。
我们的简单设备的结构和外观需要改进。例如, 组件 (如电源、加热器和温度控制器) 可以集成, 以使此设备更加完整和便携。此外, 商用旋转 microtomes 有不同的大小。要连接到其他 microtomes, 应调整该设备的角度和高度。石蜡切片结合其他分子技术广泛应用于神经生物学、组织形态学等研究领域11、12、13。这种方法有可能提高临床检查效率14,15和其他生物标本超过三种组织类型在这里使用。
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Disclosures
作者在这一设备上有专利, 并且声明没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金 (31400936、31460260号赠款) 和江西省自然科学基金 (20171BAB215020) 的支持。我们还感谢南昌大学与伦敦玛丽大学的联合项目支持这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12 V 200 W) | |||
| Temperature controller(12 V 120 W) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
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