Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Verbesserung der Paraffin-Schnitt. Diese Methode verbindet schneiden und schweben mit einer einfachen thermostatischen Kammer, um den Transfer-Prozess erforderlich, nach der herkömmlichen Methode zu vermeiden. Infolgedessen wurden die Effizienz und die Anzahl der intakten Paraffin Abschnitte erheblich verbessert.
Abstract
Histologie und Pathologie ist das Schneiden von Paraffin-eingebetteten Gewebe verbreitet. Jedoch ist es langweilig. Um diese Methode zu verbessern, haben mehrere Handelsgesellschaften komplexer Abschnitt Transfersysteme mit fließenden Wasser entwickelt. Um diese Technologie zu vereinfachen, haben wir eine einfache Methode mit hausgemachten Ausrüstung, die schneiden und schwimmend in einem einfachen thermostatischen vereint; Geben Sie deshalb die Abschnitte automatisch das Wasserbad auf der Wasseroberfläche. Im Hippocampus von Erwachsenen mäusegehirnen, Erwachsenen Maus Nieren und embryonalen mäusegehirnen Erwachsenen Zebrafisch Augen wurden mit konventioneller Paraffin-Schnitt und die vorgestellte Methode zum Vergleich geschnitten. Statistische Analyse zeigt, dass unsere verbesserte Methode Zeitersparnis und höhere Qualität Teile produziert. Darüber hinaus ist es einfach für junior Operatoren, Paraffin-Schnitt einer ganzen Probe in kurzer Zeit.
Introduction
Morphologische Studie ist wichtig in der biologischen Forschung. Obwohl neuer Technologie Forscher beobachten ihre Ziele direkt aus dem gesamten Gewebe oder Organismen1,2,3, schneiden die Probe in Dünnschliffen, gefolgt von Färbung erlaubt hat, bleibt die primäre Methode Fornot nur Gewebe Morphologie, sondern auch Protein targeting direkt im Gewebe. Lichtmikroskopie verwendet drei Schnitttypen: Paraffin, gefrorene und Ansät. Obwohl Kryoschneiden üblich ist, dass Gewebe Antigenität zu schützen und die Probenvorbereitung einfach ist, ist die einbehaltene Gewebe Morphologie Arm und ungeeignet für dünne Stationspunkte4,5. Paraffin-Schnitt ist die am häufigsten verwendeten Methode für die Ausstellung von gut erhaltenen Morphologie. Die Exemplare sind völlig dehydriert und in Wachs eingebettet, können der Paraffin-Blöcke auf unbestimmte Zeit gespeichert werden. Darüber hinaus produziert die Paraffin-Schnitt dünne Abschnitte, die Verbesserung der biologischen Sonde Zugang in weiteren Experimenten und reduzieren Zelle Schicht Overlay in Z-Richtung.
Doch herkömmliche Paraffin-Schnitt ist mühsam und erfordert Betreiber können. Paraffin-Abschnitte durchlaufen Fixierung, Austrocknung, einbetten, schneiden und schweben. Wichtiger ist Abschnitt Bänder aus dem Messerhalter auf dem Wasserbad zu übertragen notwendig, aber schwierig für junior-Betreiber. Besonders bei trockener Luft die Abschnitt-Bänder werden durch statische Elektrizität drehen und sind schwierig, auf dem warmen Wasser entfalten. Zur Verbesserung der Abschnitt sind Qualität, Befeuchtung der exponierten Gewebeoberfläche zwischen Mikrotom Klinge Pässe, die Wachs-Blöcke, Eintauchen in eiskaltes Wasser, oder erhöht die Luftfeuchtigkeit mit einem Luftbefeuchter in der Nähe von Mikrotom Kühlung6,7 empfohlen. . Neuere Methoden zur Verbesserung der Paraffin-Schnitt gehören Hybrid Paraffin einbetten, Kryoschneiden8und Handelsabteilung Transfer System Hilfe9. Obwohl diese Methoden teilweise Paraffin verbessern schneiden, Geschwindigkeit und Qualität, sie schneiden machen viel schwerfälliger und Handelsabteilung Transfersysteme sind teuer.
In diesem Protokoll führen wir flexible, einfache und billige Geräte Schritt für Schritt zu schaffen, die an den Klingenhalter ein rotary Mikrotom angeschlossen werden können. Dieses Gerät umfasst einen Abschnitt-Kanal, ein Wasserbad und eine Heizung mit Erkennung Temperaturschalter. Nach dem Schneiden, Dutzende von Abschnitte fließen in den Abschnitt Kanal und geben Sie das Wasserbad direkt, damit automatisch entfaltet. Dies verbessert die Effizienz der Paraffin-Schnitt und macht diese Technologie noch komfortabler. Mit Hilfe dieser Methode, mehr Erwachsene Maus hippocampal Abschnitte, Erwachsenen Maus Niere Abschnitte, embryonale 15,5 Tage alte (E15.5) Maus Gehirn Abschnitte und Erwachsenen Zebrafisch Auge Abschnitte wurden geerntet in kürzerer Zeit und morphologisch mehr intakt geblieben. Diese Methode kann auch für andere Gewebeproben, die erfordern beschleunigte Paraffin-Schnitt und verhindern, dass der Abschnitt Unterscheidung verwendet werden.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Animal Care und Nutzung Ausschuss von Nanchang University genehmigt.
1. Montieren Sie das Gerät und schließen Sie das Mikrotom
- Entwerfen Sie den Parameter gemäß den Anforderungen (ergänzende Abbildung 1).
- Einreichen des Parameters zu einer Fabrik zur Herstellung von Acryl-Boards.
- Montieren Sie alle Teile in der Reihenfolge: Verwenden Sie Chloroform, um 7 gewerbliche Acryl Boards in einen Tank mit einem Abschnitt Kanal und Wasser Bad (Abbildung 1) zu kombinieren.
Achtung: Chloroform produziert giftige Substanzen trifft es Licht und Sauerstoff. Montieren Sie das Gerät in einer Dampfhaube. - Installieren Sie die röhrenförmigen elektrisches Heizelement durch das Loch in Acryl Board #1 (Abbildung 2A, Pfeilspitze).
- Um die Temperatur-Controller zu installieren, erstellen Sie ein kleines Loch auf der #2 Acryl Board mit einer elektrischen Bohrmaschine, und installieren Sie den Temperatur-Detektor (Abbildung 2A, Pfeil). Installieren Sie ein digitales Thermostat auf dem Tank (Abbildung 2A).
Hinweis: Die Temperatur-Detektor sollte innerhalb 1 cm unterhalb der Wasseroberfläche liegen. - Um Kraft zugreifen, passen Sie die Spannung unter 24 V bevor Sie das Gerät einschalten.
- Entfernen Sie die Schnittabfallwanne aus Mikrotom.
- Verknüpfen Sie die Abschnitte-Kanal mit dem Mikrotom-Klingenhalter mit neutraler Silikondichtstoff (Abb. 2 b).
Hinweis: Schmieren Sie jede neutrale Silikon-Dichtstoff über der Spitze des Messers nicht, so dass die alte Klinge leicht ersetzt wird. - Trocknen Sie über Nacht um die Chloroform und neutral Silikon-Dichtstoff Zeit zu erstarren lassen.
- Installieren Sie die Klinge auf der Klingenhalter. Gießen Sie Wasser in das Wasserbad (Abbildung 2). Die Wasseroberfläche sollte nur den oberen Bereich des Blatts (Abb. 2D, Pfeilspitze) berühren.
(2) Paraffin-Schnitt
Hinweis: Trümmer oft an den oberen oder unteren Kanten des Wachs-Blocks und der Wasseroberfläche ansammeln. Diese Ablagerungen sollten regelmäßig gelöscht werden.
-
Durchführen Sie herkömmliche Paraffin10-Schnitt.
- Klemmen Sie das Paraffin-eingebetteten Exemplar auf einer rotierenden Mikrotom und setzen Sie das Messer in einem Messerhalter.
- Drehen Sie das Handrad und Abschnitt der Probekörpers.
- Übertragen Sie das Paraffin geschnittene Band auf 38,5 ° C warmen Wasserbad.
- Holen Sie ab, die in den Abschnitten auf das Mikroskop von der Wasseroberfläche nach Entfaltung zu schieben.
- Trocknen Sie die Folien in einem Ofen bei 42 ° C über Nacht.
-
Verbesserte Paraffin-Schnitt (Abb. 3)
- Schliessen Sie das Gerät.
- Öffnen Sie das Heizgerät mit Temperaturschalter Erkennung und stellen Sie gezielte Temperatur zwischen 38,0 ° C bis 40,0 ° C für 1 h im voraus, um das Wasser warm ein.
- Ändern Sie den paraffinblock erworben durch das Paraffin einbetten; dann das Mikrotom Kassette Klemme der paraffinblock aufsetzen und einrasten.
Hinweis: Die superior und inferior Grenzen der paraffinblock sollten horizontal geändert werden, um zu verhindern, dass die Abschnitt Multifunktionsleiste aus bilden einen Bogen und nicht mehr durch den schmalen Abschnitten Kanal fließen. - Schnell Ansatz der Probenmaterials durch Schneiden dicker Abschnitte.
- Passen Sie auf eine geeignete Schnittdicke (10 µm Erwachsener Mäuse Köpfe, Erwachsenen Maus Nieren und Embryo mäusegehirnen, 4 µm für Zebrafisch Augen). Drehen Sie das Handrad und die Abschnitten treten automatisch die Abschnitte Kanal und Bad.
- Abschnitt der Probe in eine langsame und gleichmäßige schneiden Schlaganfall (Abb. 3A).
Hinweis: Thethickness des ersten Abschnitts wird geändert werden, nachdem das Handrad für ein paar Minuten gestoppt wurde. Die klingen sollten ersetzt werden, wenn die Abschnitte in Folge Kratzer haben. - Führen Sie die Abschnitte in die Badewanne Kammer in einer Linie (Abb. 3 b, 3 C) zu schweben.
Hinweis: Wenn das Kopfteil an der Kammerwand hält, verwenden Sie eine Bürste Anleitung schwimmend weiterhin. - Abschnitte auf Objektträger zu halten. Entfalten Sie nach den Abschnitten voll im Wasserbad, separate mehrere Abschnitte mit einer Pinzette. Dann holen sie aus dem Wasserbad auf den Objektträger (Abbildung 3D).
Hinweis: Abschnitte sollten aus dem Hinterteil des Wasserbades, abgeholt werden wie in den Abschnitten-Kanal und der vorderen des Wasserbades noch nicht voll entfaltet werden. - Trocknen Sie die Folien werden, indem sie in einem 42 ° C Ofen über Nacht. Die Folien können dann auf unbestimmte Zeit bei Raumtemperatur gelagert werden.
- Verwenden Sie Färbung Hämatoxylin-Eosin (HE) aus Gründen der Bewertung der verbesserten Methode8.
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Representative Results
Die verbesserte Methode stieg die Zahl der intakten Paraffin Abschnitte. Wir haben diese neue Methode auf Erwachsenen Maus hippocampal Gewebe, Erwachsenen Maus Nieren und embryonalen mäusegehirnen Zebrafisch Augen getestet. Wasser wurde hinzugefügt, um den Tank, und die Wassertemperatur war zwischen 38,0 ° C bis 40,0 ° c gehalten Sie waren nach einem seriell Vorbereitung der Gewebeproben, geschnitten und im Vergleich zu herkömmlichen schneiden. Die neue Methode Abschnitt Verlust zu vermeiden und erhöht den Anteil der intakten Abschnitte in den Erwachsenen Maus Hippocampus, Erwachsenen Maus Nieren, E15.5 mäusegehirnen und Erwachsenen Zebrafisch Augen (Abbildung 4A4 C, 4E, 4 G). Zusammenfassend, verbessert unsere Methode der Schnitt durch die Verhinderung Abschnitt Verlust und Ernte mehr intakte Abschnitte pro Probe.
Die verbesserte Methode verringert den Zeitaufwand pro Probe. Bei einem Vergleich den Zeitaufwand zwischen der herkömmlichen Methode und unsere verbesserte Methode, führten wir ganze Serie schneiden (aus dem ersten Abschnitt zum letzten Abschnitt eines Organs) auf die Erwachsenen Maus Hippocampus, Erwachsenen Maus Nieren E15.5 mäusegehirnen und Erwachsenen Zebrafisch Augen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die verbesserte Methode das Paraffin Schnitt Geschwindigkeit in allen getesteten Proben beschleunigt (Abbildung 4 b4D, 4F, 4 H). Unsere Methode erlaubt für schneller hochwertige Paraffin-Schnitt.
Serie Abschnitte der Zebrafisch faseroptische Netzhaut war von H und E Färbung beobachtet. Für Serie Schneiden des Segments Papille der Zebrafisch Netzhaut, waren die Abschnitte von der verbesserten Methode geerntet besser hat bessere Integrität als jene aus der konventionellen Paraffin-Schnitt Methode (Abbildung 5A, 5 b). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen diesen beiden Methoden bezüglich der Qualität der meisten geernteten Abschnitte (Abbildung 5, 5 D). Gelegentlich, die Qualität der Teile aus der konventionellen Methode geerntet wurden relativ niedrig (Abb. 5E, 5F).
Abbildung 1: der Prozess für die Montage der 7 kommerziellen Acryl-Boards in einem Tank. (A) Gesamtansicht der 7 Acryl Boards. (B-G) Schrittweise Montage des Tanks vom Board # 1 Board #7. (H) primäre Tank nach der Montage. (I) Allgemeine Tankgröße; die Schutzmembran auf der Tankoberfläche wurde für die weitere Installation entfernt. L = 400 mm, L' = 220 mm, H = 122 mm, B = 200 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: die entsprechend montierten Geräte einsatzbereit. (A) das intakte Geräte nach Verbindung zum rotary Mikrotom. Pfeil-Anzeige, Temperatur-Detektor wird durch das kleine Loch von Bohrmaschine installiert. Pfeilspitze, die Heizung (röhrenförmige elektrisches Heizelement) wird durch das Loch im Board #1 installiert. (B) die verstärkte gestrichelte Fläche A, die Funktion der Verbindung zwischen dem Mikrotom-Klingenhalter und Abschnitte Kanal. Pfeilspitze, Klingenhalter und Abschnitte Kanal sind durch neutrale Silikon-Dichtstoff verbunden. (C) identisch mit B, mit dem Wasser gegossen und Blade installiert. (D) Seitenansicht im gestrichelten Bereich C. Pfeilspitze, die Wasseroberfläche liegt in der Nähe der Schneide. VT: Spannungswandler; WB: Wasserbad; DT: digitaler Thermostat; B: Klinge; BH: Klingenhalter; SC: Abschnitte Kanal. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Prozess-Schnitt verbesserte Paraffin. Die Zahlen in der unteren linken Ecke befindet sich liegen die verstärkte gestrichelten Bereiche A-D. Pfeil-Indikationen, der erste Abschnitt. (A, A') Der Abschnitt betritt die Abschnitte Kanal sofort und direkt nach dem Schneiden. (B, B') Die Abschnitte Band überquert die Grenze zwischen den Abschnitten Kanal und Wasser-Bad. (C, C') In den Abschnitten zu den hinteren des Wasserbades schweben und sind voll entfaltet. (D, D') Die Abschnitte werden von Mikroskop-Objektträger abgeholt, wenn sie den hinteren des Wasserbads zu erreichen und sind voll entfaltet. SC: Abschnitte Kanal; WB, Wasserbad. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: die verbesserte Stationspunkte Methode verbessert die Effizienz und Ertrag Rate deutlich für die gesamte Serie Abschnitte. Die Ausbeute betrug den Anteil der intakten Abschnitte in alle Zuschnitte. Daten sind als Mittelwert ± SEM gezeigt und vom gleichen Betreiber erworben. (A, C, E, G) Die verbesserte Methode Abschnitt Verlust des Hippocampus Erwachsener Mäuse verhindert (91.04 ± 1.429 % N = 3, Vs 97,63 ± 0.4864 % N = 3, p = 0.0120), Erwachsene Maus Nieren (92.30 ± 0.5689 % N = 3, Vs 95.99 ± 0.7055 % N = 3, p = 0.0153), E15.5 Gehirn der Maus (90.67 ± 1,549 %, N = 3 Vs 97.01 ± 0.2816 %, N = 3, p = 0,0158), und Erwachsene Zebrafisch Augen (91.27 ± 0.9734 % N = 4 Vs 96.32 ± 0.7217 % N = 4, p = 0.0059). (B, D, F, H) Die verbesserte Methode gespeichert Zeit verglichen mit der konventionellen Methode für die Erwachsenen Maus Hippocampus (126.0 ± 3,606 min Vs 79.67 ± 1,856 min, N = 3, p = 0,0003), Erwachsene Maus Nieren (66.67 ± 1,764 min Vs 41.33 ± 2,186 min, N = 3, p = 0,0008), E15.5 Maus Br Ain (99,67 ± 3,480 min Vs 52.33 ± 4,333 min, N = 3, p = 0.0010), und Erwachsene Zebrafisch Augen (48,00 ± 2,160 min Vs 30.75 ± 1,797 min, N = 4, p = 0,0009). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,005. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: H und E Färbung der ganzen Serie Abschnitte des Segments Papille der Zebrafisch Augen erworben von den herkömmlichen Methoden und verbesserte Paraffin-Schnitt vom selben Betreiber verglichen werden. (A) konventioneller Paraffin-Schnitt (21 Teile). (B) verbesserte paraffin Stationspunkte (24 Teile). (C) im gestrichelten Bereich der A6. (D) im gestrichelten Bereich der B7. (E) im gestrichelten Bereich der A17. (F) im gestrichelten Bereich der B19. Sternchen, die Abschnitte mit relativ schlechter Qualität. Pfeilspitzen, Papille; Pfeile, schweren Verschleiß des retinalen Gewebes. Maßstabsleiste = 200 µm (A und B); Maßstabsleiste = 50 µm (C, D, E, F). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung1: der Dimensionsparameter der 7 kommerziellen Acryl Platten. Die Zahl gibt die Länge des entsprechenden Board Rands. Einheiten: mm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Zur Verbesserung von Paraffin Abschnitt Morphologie und lösen das Problem der verschwendete Zeit während konventioneller Paraffin-Schnitt, haben wir eine verbesserte Paraffin-Schnitt-Methode, die schneiden und Entfaltung verbindet. Diese verbesserte Methode beruht auf einfache Geräte, die einen Abschnitt-Kanal, ein Wasserbad und eine Heizung mit Erkennung Temperaturschalter umfasst. Der Abschnitt Band betritt das Wasserbad durch den Abschnitt Kanal und entfaltet sich automatisch beim Schneiden. Daher verbessert diese Methode Paraffin Schnitt, Qualität und Effizienz, die durch Paraffin-Schnitt der Erwachsenen Maus Hippocampus, Erwachsenen Maus Nieren, E15.5 mäusegehirnen und Erwachsenen Zebrafisch Augen geprüft wurden.
Zur Vermeidung von Sektion Eisstockschießen bei konventioneller Paraffin-Schnitt wurden viele Anpassungen vorgenommen wie Befeuchtung der Gewebeoberfläche, Kühlung des Wachs-Blocks, erhöhen die Luftfeuchtigkeit und kombiniert Kryoschneiden6,7, 8; aber machen diese Anpassungen Paraffin-Schnitt langweiliger. Eine Handelsabteilung-Transfer-System stützt sich auf flüssige Wasser ist erfolgreicher gewesen. In diesem System im Abschnitt Kontakte der Wasseroberfläche sofort nach dem Schneiden und Elektromotor angetriebene Wasserstrom überträgt die Abschnitte aus dem Klingenhalter mit dem niedrigeren Warmwasser Bad9. Statische Elektrizität hemmt durch seine Mechanismus nicht, die schneiden, wodurch verbesserte Schnittqualität. Zusätzlich, da dieses System manuell Abschnitte aus dem Klingenhalter auf dem Wasserbad übertragen vermeidet, hilft leicht zerbrechliche Teile beschädigen es auch beim Erwerb von qualitativ hochwertigen dünneren Bereiche.
Mit unserer verbesserten Methode zeichnet die einfache Ausstattung auf die Erfahrung des Transfersystems Handelsabteilung mit einigen Vorteilen. Erstens ist die Ausrüstung billiger, die könnte diese Methode in den Labors in Entwicklungsregionen zu popularisieren und die Handelsabteilung-Transfer-System ergänzen kann. Zweitens: das Wasser im Gerät ist statisch und niemals stört die Abschnitte, die es ermöglichen, die dünneren Bereiche erwerben. Wir nacheinander geschnittene Zebrafisch Augen 2 µm Dicke mit der verbesserten Methode, und die erworbene Abschnitte waren von höherer Qualität. Drittens dient ein größeren Wassertank Bad in der Ausstattung, die erlaubt mindestens 40 Abschnitte zu entfalten und gleichzeitig zu schweben, so dass zwei Betreiber kooperieren. Eine Person kann die Gewebeprobe kontinuierlich geschnitten und zum anderen kann direkt in den Abschnitten angelt. Dies reduziert die Wartezeit für die Abschnitte zu entfalten. Aufeinander folgenden Schneiden mit einem einheitlichen Schnitt verbessert auch die Schnittqualität.
Die Struktur und das Aussehen unserer einfachen Ausrüstung erfordert Verbesserung. Beispielsweise können die Komponenten wie die Kraft, eine Heizung und ein Temperaturregler integriert werden, um dieses Gerät integraler und tragbar zu machen. Darüber hinaus haben kommerzielle rotary Mikrotome verschiedene Größen. Zum Herstellen einer anderen Mikrotome sollte den Winkel und die Höhe dieser Geräte angepasst werden. Paraffin-Schnitt in Kombination mit anderen Verfahren der molekularen ist Neurobiologie, Morphologie der Gewebe und andere Forschung Felder11,12,13verbreitet. Diese Methode kann möglicherweise, klinische Untersuchung Effizienz14,15 und anderen biologischen Proben jenseits der drei Gewebetypen, die hier verwendeten verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben ein Patent auf dieses Gerät und keine Interessenskonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 31400936, 31460260) und der naturwissenschaftlichen Grundlage der Jiangxi Provinz in China (20171BAB215020). Wir danken auch das gemeinsame Programm zwischen Nanchang University und Queen Mary University of London für diese Arbeit zu unterstützen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12 V 200 W) | |||
| Temperature controller(12 V 120 W) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
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