Summary
Aquí, presentamos un protocolo para mejorar la parafina secciones. Este método combina el corte y flotando con una cámara termostática simple para evitar el proceso de transferencia requerido por el método convencional. Como resultado, la eficacia y el número de secciones de la parafina intacto mejoraron grandemente.
Abstract
Secciones de tejido embebido en parafina es ampliamente utilizado en histología y patología. Sin embargo, es tedioso. Para mejorar este método, varias empresas han ideado sistemas de transferencia de sección compleja con fluido agua. Para simplificar esta tecnología, hemos creado un método sencillo usando equipos caseros que combina el corte y flotando dentro de una cámara termostática simple; por lo tanto, las secciones automáticamente entrar en el baño de agua en la superficie del agua. El hipocampo de cerebro de ratón adulto, los riñones de ratón adulto, cerebros embrionarios de ratón y ojos de pez cebra adulto fueron cortados usando secciones de parafina convencional y el método presentado para la comparación. El análisis estadístico muestra que nuestro método mejorado había ahorrado tiempo y produce perfiles de calidad superiores. Además, parafina de seccionamiento de la muestra entera en poco tiempo es fácil para los operadores junior.
Introduction
Estudio morfológico es importante en la investigación biológica. Aunque la nueva tecnología ha permitido a los investigadores a observar sus objetivos directamente en el tejido entero u organismos1,2,3, cortar al espécimen de secciones delgadas, seguido por la coloración, sigue siendo el principal morfología de tejido único método fornot sino directamente en el tejido de la proteína. La microscopia ligera utiliza tres tipos de sección: parafina, congelado y SEMIFINOS. Aunque cryosectioning es común para la protección de la antigenicidad del tejido, y la preparacion es simple, la morfología de tejido retenido es pobre e inadecuado para fina seccionamiento de4,5. Secciones de la parafina es el método más frecuentemente utilizado para exhibir bien preservada morfología. Ya que las muestras deshidratadas totalmente incrustadas en la cera, los bloques de parafina pueden ser almacenados indefinidamente. Además, secciones de la parafina produce secciones delgadas que mejoran el acceso de la sonda biológica en experimentos adicionales y reducen la superposición de capas de células en la dirección Z.
Sin embargo, secciones de la parafina convencional es tedioso y exige habilidad del operador. Secciones de la parafina se someten a la fijación, deshidratación, inclusión, corte y flotante. Lo importante, transferencia de cintas de la sección de soporte de la cuchilla en el baño de agua es necesaria pero difícil para los operadores junior. Especialmente en aire seco, las cintas de la sección se tuerza debido a la electricidad estática y son difíciles de desplegar en la superficie de agua caliente. Para mejorar la sección de calidad, humedecer la superficie de tejidos expuestos entre pasadas de cuchilla microtomo, enfriamiento los bloques de cera por inmersión en agua con hielo o aumentar la humedad con un humidificador cerca el micrótomo se recomienda6,7 . Nuevos métodos para mejorar la parafina secciones incluyen híbrido inclusión en parafina, cryosectioning8y sección comercial transferencia sistema asistencia9. Aunque estos métodos mejoran parcialmente parafina secciones velocidad y calidad, hacen secciones mucho más engorroso, y sistemas de transferencia de la sección comercial son caros.
En este protocolo, demostramos cómo crear simple, barato y flexible equipo paso a paso, que puede conectarse al sujetador de la cuchilla de un micrótomo rotatorio. Este equipo está compuesto por un canal de sección, un baño de agua y un calentador con un interruptor de detección de temperatura. Después del corte, docenas de secciones de flujo en el canal de sección y entrar en el baño de agua directamente, así se despliega automáticamente. Esto mejora la eficiencia de parafina de seccionamiento y hace que esta tecnología sea más conveniente. Usando este método, más adultas secciones de hipocampo de ratón, las secciones de riñón de ratón adulto, embrionario 15,5 días de edad (E15.5) ratón secciones del cerebro y ojo de pez cebra adulto secciones fueron cosechadas en menos tiempo e intacta más morfológicamente. Este método puede utilizarse también para otras muestras de tejidos que requieren acelerado parafina secciones evitando la pérdida de distinción de la sección.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y el Comité de uso de la Universidad de Nanchang.
1. monta el equipo y conecte el microtomo
- Diseño de los parámetros conforme a los requisitos (suplementario figura 1).
- Enviar el parámetro a una fábrica local para la fabricación de los tableros de acrílico.
- Montar todas las piezas en orden: utilizar cloroformo para combinar 7 comerciales tableros de acrílico en un tanque con un baño de agua y canal de sección (figura 1).
PRECAUCIÓN: El cloroformo produce sustancias tóxicas cuando encuentra con luz y al oxígeno. Montar el aparato en una campana de humos. - Instale el elemento de calefacción tubular a través del agujero en el tablero de acrílico #1 (punta de flecha de lafigura 2A, ).
- Para instalar el controlador de temperatura, crear un pequeño agujero en el tablero de acrílico #2 usando un taladro eléctrico e instale el detector de temperatura (flecha de lafigura 2A, ). Instalar un termostato digital en el tanque (figura 2A).
Nota: El detector de temperatura debe estar dentro de 1 cm por debajo de la superficie del agua. - Para proporcionar acceso a energía, ajustar la tensión inferior a 24 V antes de encender el equipo.
- Retire la bandeja de residuos de sección del microtomo.
- Enlace al canal de secciones con sujetador de la cuchilla de micrótomo con sellante neutral del silicón (figura 2B).
Nota: No borrón de transferencia cualquier sellante neutral del silicón sobre la parte superior de la hoja de manera que la hoja vieja se sustituye fácilmente. - Seco durante la noche para permitir que el cloroformo y el tiempo de sellador de silicona neutra para solidificar.
- Instalar la hoja en el portahoja. Vierta agua en el baño de agua (figura 2). La superficie del agua sólo debe tocar la parte superior de la hoja (Figura 2D, cabeza de flecha).
2. parafina de seccionamiento
Nota: Desechos a menudo se acumulan en los bordes superiores o inferiores de la manzana de cera y la superficie del agua. Esta basura debe ser limpiado regularmente.
-
Realizar la parafina convencional sección10.
- Fije a la muestra de parafina-encajado en un micrótomo rotatorio y coloque la cuchilla en un sujetador de la cuchilla.
- Gire el volante y la sección de la muestra.
- Transferencia de la cinta de parafina seccionado para el baño de agua caliente de 38,5 ° C.
- Pick up que las secciones en el microscopio se deslizarán de la superficie del agua después de desplegar.
- Seque el portaobjetos en un horno a 42 º C noche.
-
Secciones de parafina mejorada (figura 3)
- Encender el equipo.
- Abra el calentador con interruptor de detección de temperatura y temperatura específicas entre 38,0 ° C y 40,0 ° C durante 1 hora con antelación calentar el agua.
- Modificar el bloque de parafina adquirido por inclusión en parafina; luego coloque el bloque de parafina en abrazadera del cassette del microtomo y bloquéela.
Nota: Los límites superiores e inferiores del bloque de parafina deben modificarse horizontalmente para evitar que la cinta de la sección de formando un arco y ser capaz de fluir a través del canal de secciones estrechas. - Acercarse rápidamente a la muestra por secciones gruesas de corte.
- Ajuste a un espesor de sección adecuada (10 μm para cerebro de ratón adulto, ratón adulto riñones y cerebro de ratón embrión, 4 μm para los ojos de pez cebra). Gire el volante y las secciones entrará automáticamente en el canal de las secciones y el baño.
- Sección de la muestra en un movimiento lento y uniforme del corte (Figura 3A).
Nota: Thethickness del primer tramo se verá alterada tras el volante se ha detenido durante unos minutos. Las cuchillas desechables deben reemplazarse cuando las secciones tienen arañazos consecutivos. - Guía de las secciones en la cámara de baño flotan en una línea (figura 3B, 3C).
Nota: Si la parte de la cabeza se adhiere a la pared de la cámara, utilice a una guía cepillo para mantenerlo flotando. - Se adhieren a las secciones sobre portaobjetos. Después de las secciones completamente se despliegan en el baño de agua, varias secciones con pinzas. Luego recogerlos desde el baño de agua sobre el portaobjetos (figura 3D).
Nota: Secciones deben recogidas en la parte posterior de la bañera de agua, como los del canal de las secciones y la parte anterior de la bañera de agua no todavía completamente desplegados. - Seque las diapositivas colocándolas en un horno de 42 ° C durante la noche. Las diapositivas entonces pueden ser almacenadas a temperatura ambiente indefinidamente.
- Utilizar la tinción de hematoxilina-eosina (HE) para la evaluación del método mejorado8.
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Representative Results
El método mejorado aumentó el número de secciones de la parafina intacto. Probamos este nuevo método en tejido de hipocampo de ratón adulto, los riñones de ratón adulto, cerebros embrionarios de ratón y ojos de pez cebra. Se añade agua al tanque, y la temperatura del agua se mantuvo entre 38,0 ° C y 40,0 ° C. Después de una serie preparación de las muestras de tejido, fueron seccionadas y comparados con seccionamiento convencional. El nuevo método evita la pérdida de sección y aumentó la proporción de secciones intactas en el hipocampo del ratón adulto, los riñones de ratón adulto, E15.5 cerebros de ratón y ojos de pez cebra adulto (Figura 4A4C, 4E, 4 G). En conclusión, nuestro método mejorado el seccionamiento por la prevención de la pérdida de sección y cosecha más secciones intactas por muestra.
El método mejorado disminuyó el tiempo empleado por muestra. Al comparar el tiempo necesario entre el método convencional y el método mejorado, se realizó toda la serie de seccionamiento (de la sección primera a la última sección de un órgano) de hipocampo de ratón adulto, los riñones de ratón adulto, E15.5 cerebros de ratón y adulto ojos de pez cebra. Los resultados sugieren que el método mejorado acelera la parafina secciones velocidad en todas las muestras (Figura 4B4D, 4F, 4 H). En general, nuestro método permitido para secciones de parafina de alta calidad más rápidamente.
Secciones de la serie de la retina de pez cebra óptica fue observada por la coloración H y E. Para serie de seccionamiento del segmento de disco óptico de la retina de pez cebra, las secciones de método mejorado eran mejor tiene mejor integridad que el de la parafina convencional sección método (figura 5A, 5B). No hubo diferencias significativas entre estos dos métodos con respecto a la calidad de las secciones más cosechadas (figura 5, D 5). En ocasiones, la calidad de las secciones de método convencional fueron relativamente bajas (figura 5E, 5F).
Figura 1: el proceso de montaje de los tableros de acrílico comerciales 7 en un tanque de. (A) vista de conjunto de los tableros de acrílico 7. (B-G) Montaje paso a paso del tanque del tablero # 1 tabla #7. Tanque primario (H) después de la Asamblea. (I) tamaño del tanque General; la membrana protectora en la superficie del tanque fue quitada para continuar la instalación. L = 400 mm, L' = 220 mm, H = 122 mm, W = 200 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: el equipo adecuadamente montado listo para uso. (A) intacto equipo después de estar conectado con el microtomo rotatorio. Indicación de la flecha, el detector de temperatura se instala a través del pequeño agujero con un taladro eléctrico. Punta de flecha, el calentador (elemento de calefacción tubular) se instala a través del agujero en la tabla #1. (B) la zona amplificada discontinua en A, la función de la conexión entre el sujetador de la cuchilla de micrótomo y el canal de las secciones. Punta de flecha, el sujetador de la cuchilla y el canal de las secciones están conectadas por el sellante neutral del silicón. (C) igual a B, con el agua vertida y la lámina instalada. (D) vista lateral de la zona punteada en punta de flecha de C., la superficie del agua está cerca del borde de la hoja. VT: transformador de voltaje; BM: baño de agua; DT: termostato digital; B: hoja; BH: sujetador de la cuchilla; SC: canal secciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: la mejor parafina secciones proceso. Las cifras situadas en la esquina inferior izquierda son las áreas discontinuas ampliadas en A-D respectivamente. Indicaciones de la flecha, la primera sección. (A, A') La sección entra en el canal de las secciones inmediatamente y directamente después del corte. (B, B') La cinta de secciones cruza la frontera entre el baño de agua y canal de secciones. (C, C') Las secciones flotan a la parte posterior de la bañera de agua y están completamente desplegadas. (D, D') Las secciones son recogidas por el portaobjetos del microscopio cuando se llega a la parte posterior de la bañera de agua y están completamente desplegadas. SC: canal secciones; WB, baño de agua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: el método de seccionamiento mejorado mejorado la tasa de eficiencia y rendimiento significativamente para las secciones de toda la serie. La tasa de rendimiento era igual a la proporción de secciones intactas en todas las secciones de corte. Datos se muestran como la media ± SEM y adquiridos por el mismo operador. (A, C, E, G) El método mejorado prevenir pérdida de sección de hipocampo de ratón adulto (91.04% de 1.429 ± N = 3, vs 97.63 ± 0.4864% N = 3, p = 0.0120) adultos ratón riñones (92.30 ± 0.5689% N = 3, vs 95.99 ± 0.7055% N = 3, p = 0.0153), cerebro de ratón E15.5 (1.549 de ± 90.67%, N = 3 vs 97.01 ± 0.2816%, N = 3, p = 0.0158) y los ojos de pez cebra adulto (91.27 ± 0.9734% N = 4 ± vs 96.32% 0.7217 N = 4, p = 0.0059). (B, D, F, H) El método mejor guardado tiempo en comparación con el método convencional para el hipocampo del ratón adulto (126.0 ± de 3,606 min vs 79.67 1,856 min, N = 3, p = 0.0003), adultos ratón riñones (66.67 ± de 1,764 min vs 41.33 min 2,186, N = 3, p = 0.0008), E15.5 ratón br Ain (99.67 ± de 3,480 min vs 52.33 4,333 min, N = 3, p = 0,0010) y los ojos de pez cebra adulto (48.00 ± de 2,160 min vs 30,75 1,797 min, N = 4, p = 0.0009). * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.005. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: se compara la coloración H y E de las secciones de toda la serie del segmento de disco óptico del pez cebra ojos adquirieron de los métodos convencionales y mejoraron parafina seccionamiento por el mismo operador. (A) convencional parafina secciones (21 secciones). (B) mejora de parafina seccionamiento (24 secciones). (C) área discontinua de A6. (D) área discontinua de B7. (E) área discontinua de A17. (F) área discontinua de B19. Asteriscos, las secciones con relativamente baja calidad. Cabezas de la flecha, disco óptico; Flechas, severo desgarro de los tejidos retinianos. Barra de escala = 200 μm (A y B); Barra de escala = 50 μm (C, D, E, F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 1: los parámetros de dimensión de los tableros de acrílico comerciales 7. El número representa la longitud del correspondiente margen de junta. Unidades: mm. haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Para mejorar la morfología de la sección de parafina y resolver el problema del tiempo perdido durante el seccionamiento de la parafina convencional, hemos creado una parafina mejor método que combina el corte y el despliegue de seccionamiento. Este método mejorado se basa en un equipo simple que consta de un canal de sección, un baño de agua y un calentador con un interruptor de detección de temperatura. La cinta de la sección entra en el baño de agua a través del canal de sección y se despliega automáticamente al cortar. Por lo tanto, este método mejora la parafina secciones de calidad y eficiencia, lo que fue verificado por la parafina de seccionamiento del hipocampo de ratón adulto, los riñones de ratón adulto, E15.5 cerebros de ratón y ojos de pez cebra adulto.
Para evitar la sección curling durante la parafina convencional de seccionamiento, se han hecho muchos ajustes, como humedecer la superficie del tejido, enfriamiento del bloque de cera, aumentando la humedad y la combinación de cryosectioning6,7, 8; sin embargo, estos ajustes hacen secciones de parafina más tedioso. Un sistema de transferencia de la sección comercial que se basa en agua líquido ha tenido más éxito. En este sistema, la sección de contacto con la superficie de agua inmediatamente después del corte, y la corriente de agua con motor eléctrico transfiere las secciones de sujetador de la cuchilla a la menor agua caliente baño9. Debido a su mecanismo, electricidad estática no inhibe el seccionamiento, dando por resultado calidad mejorada de la sección. Además, como este sistema evita transferir manualmente las secciones de sujetador de la cuchilla para el baño de agua, dañar fácilmente secciones frágiles, también ayuda en la adquisición de secciones más finas de alta calidad.
Con nuestro método mejorado, el equipo simple se basa en la experiencia del sistema de transferencia de sección comercial con algunas ventajas. En primer lugar, el equipo es más barato, que podría popularizar este método en los laboratorios en las regiones en desarrollo y puede complementar el sistema de transferencia de la sección comercial. En segundo lugar, el agua en el equipo es estático y nunca molesta a las secciones, lo que es posible adquirir las secciones más delgadas. Seccionaron consecutivamente ojos de pez cebra de 2 μm de espesor utilizando el método mejorado, y las secciones adquiridas eran de mayor calidad. En tercer lugar, un tanque más grande de baño de agua se utiliza en el equipo, que permite por lo menos 40 secciones para desplegar y flotar al mismo tiempo, permitir que los dos operadores a cooperar. Una persona puede cortar al espécimen de tejido continuamente y la otra puede pescar directamente encima de las secciones. Esto reduce el tiempo de espera para que las secciones a revelar. Corte sucesivo con un movimiento de corte uniforme también mejora la calidad de la sección.
La estructura y apariencia de nuestro equipo simple requiere mejora. Por ejemplo, los componentes, tales como el poder, un calentador y un regulador de temperatura, pueden ser integrados para que este equipo más integral y portátil. Además, Micrótomos rotatorios comerciales tienen diferentes tamaños. Para conectar a otros microtomos, ajustar el ángulo y la altura de este equipo. Secciones de parafina combinada con otras técnicas moleculares es ampliamente utilizado en Neurobiología, morfología de tejido y otros campos de investigación11,12,13. Potencialmente, este método puede mejorar eficacia de inspección clínica14,15 y otros especímenes biológicos más allá de los tipos de tres tejidos utilizados aquí.
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Disclosures
Los autores tienen una patente de este dispositivo y no declaran a intereses en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant no. 31400936, 31460260) y la Ciencia Natural Fundación de Jiangxi provincia de China (20171BAB215020). También agradecemos al programa conjunto entre la Universidad de Nanchang y Queen Mary University of London para apoyar este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12 V 200 W) | |||
| Temperature controller(12 V 120 W) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
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