Summary
Hier presenteren we een protocol om paraffine segmenteren. Deze methode combineert snijden en zwevende met behulp van een eenvoudige thermostatische kamer om te voorkomen dat het proces van de overdracht vereist met de conventionele methode. Dientengevolge, waren de efficiëntie en het aantal intact paraffine secties sterk verbeterd.
Abstract
Afdelen van het weefsel van paraffine-ingebedde wordt wijd gebruikt in de histologie en pathologie. Het is echter vervelend. Ter verbetering van deze methode, hebben verschillende commerciële bedrijven bedacht complexe sectie overdracht systemen met behulp van vloeibaar water. Om deze technologie te vereenvoudigen, wij gemaakt een eenvoudige methode om met behulp van zelfgemaakte apparatuur die combineert knippen en drijvende binnen een eenvoudige thermostatische kamer; Daarom voert de secties automatisch het waterbad op het wateroppervlak. De hippocampus van volwassen muis hersenen, volwassen muis nieren, hersenen van muis embryonale en volwassen zebrafish ogen werden gesneden met behulp van zowel conventionele paraffine segmenteren en de onderhavige methode voor vergelijking. Statistische analyse toont aan dat onze verbeterde methode tijd bespaarde en hogere kwaliteit secties geproduceerd. Daarnaast is het gemakkelijk voor junior exploitanten paraffine segmenteren voor een hele specimen in een korte tijd.
Introduction
Morfologische studie is belangrijk in het biologisch onderzoek. Hoewel de nieuwe technologie heeft toegestaan onderzoekers te observeren hun doelstellingen rechtstreeks vanuit het hele weefsel of organismen1,2,3, snijden het specimen in dunne secties, gevolgd door de kleuring, blijft de primaire methode fornot enige weefsel morfologie maar ook eiwit gericht op direct in het weefsel. De lichte microscopie van gebruikt drie typen secties: paraffine, bevroren, en semithin. Hoewel cryosectioning gemeenschappelijk is voor de bescherming van de antigenicity van het weefsel, en de voorbereiding van het monster simpel is, is de morfologie van de ingehouden weefsel slecht en ongeschikt voor dunne vectorafbeeldingsbestanden4,5. Paraffine segmenteren is de meest gebruikte methode voor het tentoonstellen van goed bewaarde morfologie. Zoals de specimens zijn helemaal uitgedroogd en ingebed in de wax, kunnen de paraffineblokken voor onbepaalde tijd worden opgeslagen. Daarnaast produceert paraffine afdelen dunne secties die toegankelijker maken van biologische sonde in verdere experimenten en cel laag overlay in de Z-richting te verminderen.
Conventionele paraffine segmenteren is echter vervelend en exploitant vaardigheid vereist. Paraffine secties ondergaan fixatie, uitdroging, insluiten, snijden en zweven. Bovenal is sectie linten overzetten van de meshouder naar het waterbad noodzakelijk maar moeilijk voor junior exploitanten. Vooral in droge lucht, de sectie linten zal draai als gevolg van statische elektriciteit en zijn moeilijk te ontvouwen op het warme water. Ter verbetering van de afdeling worden kwaliteit, bevochtigen van het oppervlak van de blootgestelde weefsel tussen microtoom blade passeert, koeling van de wax blokken door ze onder te dompelen in ijs water, of het verhogen van de luchtvochtigheid met een luchtbevochtiger in de buurt van de microtoom aanbevolen6,7 . Nieuwere methoden ter verbetering van paraffine afdelen zijn hybride paraffine insluiten, cryosectioning8en commerciële afdeling overdracht systeem bijstand9. Hoewel deze methoden gedeeltelijk paraffine verbeteren afdelen van snelheid en kwaliteit, ze maken afdelen veel omslachtiger, en commerciële sectie overdracht systemen zijn duur.
In dit protocol, we laten zien hoe maak je eenvoudig, goedkoop en flexibel apparatuur stap voor stap, die kan worden aangesloten op de meshouder van rotary microtome. Deze apparatuur bestaat uit een sectie kanaal, een bad met water en een kachel met een temperatuur detectieschakeloptie. Na het uitsnijden, tientallen secties stromen in de sectie kanaal en voer het waterbad rechtstreeks, dus automatisch ontvouwen. Dit verbetert de efficiency van paraffine afdelen en maakt deze technologie geschikter. Met behulp van deze methode, meer volwassen muis hippocampal secties, volwassen muis nier secties, embryonale 15,5 dagen oude (E15.5) muis hersenen secties en volwassen zebrafish oog secties werden geoogst in minder tijd en morfologisch meer intact gebleven. Deze methode kan ook worden gebruikt voor andere weefselsteekproeven waarvoor versnelde paraffine afdelen terwijl het vermijden van verlies van onderscheid van de sectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité van Nanchang Universiteit.
1. Monteer de apparatuur en sluit de microtoom
- Het ontwerp van de parameter per de eisen (aanvullende Figuur 1).
- De parameter naar een plaatselijke fabriek voor de vervaardiging van de acryl planken leggen.
- Monteren van alle onderdelen in volgorde: chloroform kunt combineren 7 commerciële acryl planken in een tank met een sectie kanaal en water bad (Figuur 1).
Let op: Chloroform produceert giftige stoffen bijeenkomt licht en zuurstof. Monteer het toestel in een zuurkast. - Installeer de tubulaire elektrische verwarmingselement door het gat in acryl bestuur #1 (figuur 2A, pijlpunt).
- Om de temperatuur controller installeren, maken een klein gaatje op de #2 acryl bord met behulp van een elektrische boor en installeren van de temperatuur-detector (figuur 2A, pijl). Installeer een digitale thermostaat op de tank (figuur 2A).
Opmerking: De temperatuur-detector moet binnen 1 cm onder het wateroppervlak. - Macht om toegang te verlenen, de kruisspanning onder 24 V voordat ik overga op de apparatuur.
- Verwijder de sectie afval lade uit de microtoom.
- Het koppelen van het kanaal van de secties met de microtoom Messenhouder met neutrale silicone sealant (figuur 2B).
Opmerking: neutrale silicone sealant boven de bovenkant van het blad niet smeren zodat het oude blad is gemakkelijk te vervangen. - Droog 's nachts om de chloroform en neutrale silicone sealant tijd om te stollen.
- Het mes op de meshouder installeren. Giet water in het waterbad (figuur 2C). Het wateroppervlak moet enkel raken de top van het blad (figuur 2D, pijl hoofd).
2. paraffine segmenteren
Opmerking: Puin verzamelt vaak op de randen van het boven- of ondergrens van de wax blok en het wateroppervlak. Dit puin moet regelmatig worden gewist.
-
Conventionele paraffine afdelen10uit te voeren.
- Klem de paraffine-ingebedde specimen op rotary microtome en plaats het mes in een messenhouder.
- Zet de handknop en afdeling van het model.
- Het lint van paraffine gesegmenteerd overbrengen in de 38.5 ° C warm waterbad.
- Pick up die de secties op de Microscoop vanaf het wateroppervlak na ontvouwen glijden.
- De dia's in een oven bij 42 ° C's nachts droog.
-
Verbeterde paraffine segmenteren (Figuur 3)
- Schakel de apparatuur in.
- Open de kachel met temperatuur detectieschakeloptie en de gerichte temperatuur tussen 38.0 ° C tot 40.0 ° C gedurende 1 uur op voorhand te warm het water instellen.
- Wijzigen van het blok van de paraffine overgenomen door paraffine insluiten; vervolgens plaatst u het blok paraffine op van de microtoom cassette klem en vergrendelen.
Opmerking: De superieure en inferieure grenzen van de paraffine blok moeten worden gewijzigd horizontaal om te voorkomen dat het lint van de sectie van de vorming van een boog en steeds kunnen doorstromen naar het kanaal van de smalle secties. - Aanpak snel het monster door snijden dikker secties.
- Aangepast aan de dikte van een geschikt sectie (10 µm voor volwassen muis hersenen, volwassen muis nieren en embryo muis hersenen, 4 µm voor zebrafish ogen). Zet de handknop en de secties treedt automatisch het kanaal van de secties en bad.
- Het gedeelte van het model in een langzame en uniforme snijden beroerte (figuur 3A).
Opmerking: Thethickness van de eerste sectie zal worden gewijzigd nadat de handknop is gestopt voor een paar minuten. De disposable messen moeten worden vervangen wanneer de secties opeenvolgende krassen hebben. - Het begeleiden van de secties in de bad kamer te zweven in een lijn (figuur 3B, 3 C).
Opmerking: Als de kopsectie houdt zich aan de muur van de kamer, gebruik een borstel-gids om het drijvende te houden. - Secties in Microscoop dia's te houden. Na de secties volledig ontvouwen in het waterbad, aparte verschillende secties met een pincet. Dan halen ze uit het waterbad naar de Microscoop dia's (figuur 3D).
Opmerking: Secties moeten worden opgepikt vanaf de achterkant van het waterbad, zoals die in het kanaal van de secties en de voorste van het waterbad zal nog niet volledig ontvouwen. - Droog de dia's door ze te plaatsen in een oven van 42 ° C's nachts. De dia's kunnen vervolgens worden opgeslagen op kamertemperatuur voor onbepaalde tijd.
- De Haematoxyline-eosine (HE) kleuring omwille van de evaluatie van de verbeterde methode8gebruiken
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De verbeterde methode steeg het aantal intact paraffine secties. We testten deze nieuwe methode op volwassen muis hippocampal weefsel, volwassen muis nieren, hersenen embryonale muis en zebrafish ogen. Water werd toegevoegd aan de tank en de temperatuur van het water werd gehandhaafd tussen 38.0 ° C tot 40.0 ° C. Ze waren na een serieel voorbereiding van de weefselmonsters, gesegmenteerd en in vergelijking met conventionele segmenteren. De nieuwe methode voorkwam sectie nederlaag en steeg het aandeel van intact secties in de volwassen muis hippocampus, volwassen muis nieren E15.5 muis hersenen en ogen van de volwassen zebrafish (figuur 4A4 C, 4E, 4 G). Kortom, verbeterd onze methode de afdelen door sectie gegevensverlies voorkomen en oogsten van meer intact secties per model.
De verbeterde methode daalde de tijd per model. Bij het vergelijken van de tijd die tussen de conventionele methode en onze verbeterde methode, we uitgevoerd geheel-serie segmenteren (van de eerste sectie aan het laatste deel van een orgaan) op de volwassen muis hippocampus, volwassen muis nieren E15.5 muis hersenen en volwassene zebravis ogen. De resultaten suggereren dat de verbeterde methode versneld de paraffine afdelen snelheid in alle geteste monsters (figuur 4B4 D, 4F, 4 H). In het algemeen, onze methode toegestaan voor sneller kwalitatief hoogwaardige paraffine segmenteren.
Serie secties van de zebravis optic netvlies werd waargenomen door H en E kleuring. Voor serie afdelen van het segment van de optische schijf van het netvlies van de zebravis, de secties geoogst uit de verbeterde methode beter waren heeft betere integriteit dan die van de conventionele paraffine afdelen methode (figuur 5A, 5B). Was er geen significant verschil tussen deze twee methoden met betrekking tot de kwaliteit van meest gekapt secties (figuur 5C, 5 D). Af en toe, de kwaliteit van secties geoogst van de conventionele methode waren relatief laag (figuur 5E, 5F).
Figuur 1: het proces voor het samenstellen van de 7 commerciële acryl planken in een tank. (A) overzicht van de 7 acryl planken. (B-G) Stapsgewijze vergadering van de tank van bord # 1 aan boord #7. (H) primaire tank na montage. (I) algemene tank grootte; de beschermende folie op het oppervlak van de tank werd verwijderd voor verdere installatie. L = 400 mm, L' = 220 mm, H = 122 mm, W = 200 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: het op de juiste wijze gemonteerd apparatuur klaar voor gebruik. (A) de intact apparatuur na zijn verbonden met de rotary microtome. Pijl indicatie, de temperatuur-detector wordt geïnstalleerd door het kleine gat door elektrische boor. Pijl hoofd, de kachel (tubulaire elektrische verwarmingselement) wordt geïnstalleerd door het gat in bestuur #1. (B) het versterkte onderbroken gebied in de functie van de verbinding tussen de microtoom meshouder en de secties van het kanaal. Pijl hoofd, de meshouder en secties kanaal zijn verbonden door neutrale silicone sealant. (C) hetzelfde als B, met het water gegoten en blade geïnstalleerd. (D) zijaanzicht van het onderbroken gebied in C. pijl hoofd, het wateroppervlak is dicht bij de rand lemmet. VT: spanning transformator; WB: waterbad; DT: digitale thermostaat; B: blade; BH: Messenhouder; SC: secties kanaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: de verbeterde paraffine proces segmenteren. Gelegen op de linkerbenedenhoek cijfers zijn respectievelijk de versterkte onderbroken gebieden in A-D. Pijl aanwijzingen, het eerste deel. (A, A') De sectie gaat de secties kanaal onmiddellijk en rechtstreeks na snijden. (B, B') Het lint secties kruist de grens tussen de secties kanaal en water bad. (C, C') De secties zweven naar de achterkant van het waterbad en zijn volledig ontvouwen. (D, D') De secties worden opgepikt door microscoopglaasje wanneer ze de posterior van het waterbad bereiken en volledig ontvouwen zijn. SC: secties kanaal; WB, waterbad. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: de verbeterde vectorafbeeldingsbestanden methode verbeterde de efficiëntie en rendement tarief aanzienlijk voor geheel-serie secties. Het percentage van de opbrengst evenaarde het aandeel van intact secties in alle gesneden secties. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM en verworven door dezelfde exploitant. (A, C, E, G) De verbeterde methode voorkomen sectie verlies van de volwassen muis hippocampus (91.04 ± 1.429% N = 3, vs 97.63 ± 0.4864% N = 3, p = 0.0120), volwassen muis nieren (92.30 ± 0.5689% N = 3, vs 95.99 ± 0.7055% N = 3, p = 0.0153), E15.5 muis hersenen (90.67 ± 1.549%, N = 3 vs 97.01 ± 0.2816%, N = 3, p = 0.0158), en volwassen zebrafish ogen (91,27 ± 0.9734% N = 4 vs 96.32 ± 0.7217% N = 4, p = 0.0059). (B, D, F, H) De verbeterde methode opgeslagen tijd vergeleken met de conventionele methode voor de volwassen muis hippocampus (126.0 ± 3.606 min vs 79.67 ± 1.856 min, N = 3, p = 0.0003), volwassen muis nieren (66.67 ± 1.764 min vs 41.33 ± 2.186 min, N = 3, p = 0,0008), E15.5 muis br Ain (99.67 ± 3.480 min vs 52.33 ± 4.333 min, N = 3, p = 0.0010), en volwassen zebrafish ogen (48.00 ± 2.160 min vs 30.75 ± 1.797 min, N = 4, p = 0.0009). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0.005. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: H en E kleuring van de secties geheel-serie van de optische schijf segment van de zebravis ogen verworven van de conventionele methoden en verbeterd paraffine afdelen door dezelfde exploitant worden vergeleken. (A) conventionele paraffine segmenteren (21 afdelingen). (B) verbeterde paraffine vectorafbeeldingsbestanden (24 secties). (C) onderbroken gebied van A6. (D) onderbroken gebied van B7. (E) onderbroken gebied van A17. (F) onderbroken gebied van B19. Sterretjes, de secties met relatief slechte kwaliteit. Pijlpunten, optische schijf; Pijlen, ernstige scheuren van het netvlies weefsel. Schaal bar = 200 µm (A en B); Schaal bar = 50 µm (C, D, E, F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: de parameters van de dimensie van de 7 commerciële acryl planken. Het getal staat voor de lengte van de overeenkomstige marge van de Raad van bestuur. Eenheden: mm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verbeteren van paraffine sectie morfologie en oplossen van het probleem van tijdverlies tijdens het conventionele paraffine afdelen, we een verbeterde paraffine afdelen methode die snijden en ontplooiing combineert gecreëerd. Deze verbeterde methode is gebaseerd op eenvoudige apparatuur die bestaat uit een sectie kanaal, een bad met water en een kachel met een temperatuur detectieschakeloptie. De sectie lint treedt het waterbad via het kanaal van de sectie en ontvouwt zich automatisch tijdens het snijden. Deze methode verbetert daarom paraffine afdelen van kwaliteit en efficiëntie, die werd gecontroleerd door paraffine segmenteren van de volwassen muis hippocampus, volwassen muis nieren E15.5 muis hersenen en volwassen zebrafish ogen.
Om te voorkomen dat de sectie curling tijdens conventionele paraffine afdelen, zijn vele aanpassingen aangebracht, zoals het weefsel oppervlak bevochtigen, koeling van de wax blok, verhoging van de luchtvochtigheid en combineren cryosectioning6,7, 8; echter, deze aanpassingen maken paraffine afdelen meer vervelend. Een systeem voor de overdracht van commerciële sectie die afhankelijk van vloeibaar water is meer succesvol geweest. In dit systeem, de sectie contact op het wateroppervlak onmiddellijk na het uitsnijden en de elektrische motor aangedreven waterstraal brengt de secties van de meshouder naar de lagere warm water bad9. Als gevolg van het mechanisme, bij statische elektriciteit niet remmen de afdelen, wat resulteert in verbeterde sectie kwaliteit. Bovendien, als dit systeem handmatig overzetten secties van de meshouder naar het waterbad vermijdt, helpt gemakkelijk beschadigen fragiele secties, het ook in het verwerven van kwalitatief hoogwaardige dunner secties.
Met onze verbeterde methode, de eenvoudige apparatuur is gebaseerd op de ervaring van het transfersysteem van de commerciële afdeling met een aantal voordelen. Ten eerste, de apparatuur is goedkoper, die deze methode in laboratoria in de ontwikkeling van de regio's zou populariseren en kunnen een aanvulling vormen op het transfersysteem van de commerciële afdeling. Ten tweede, het water in de apparatuur is statisch en nooit verstoort de secties, waardoor het kan verwerven dunner secties. We achtereenvolgens gesegmenteerd zebrafish ogen 2 µm dik met behulp van de verbeterde methode, en de verworven secties waren van hogere kwaliteit. Ten derde, een grotere waterreservoir voor bad wordt gebruikt in de apparatuur, die het mogelijk ten minste 40 secties maakt te ontplooien en tegelijkertijd zweven die twee-exploitanten samen te werken. Één persoon kan voortdurend het weefsel model knippen en anderzijds kan direct vissen van de secties. Dit vermindert de tijd wachten op secties te ontvouwen. Opeenvolgende snijden met een uniforme snijden slag verbetert ook de afdeling kwaliteit.
De structuur en vormgeving van onze eenvoudige apparatuur vereist verbetering. Bijvoorbeeld, kunnen de componenten, zoals de macht, een kachel en een temperatuurregelaar, zodat deze apparatuur meer integraal en draagbare worden geïntegreerd. Daarnaast hebben commerciële roterende microtomes verschillende maten. Om te verbinden met andere microtomes, moeten de hoek en hoogte van deze apparatuur worden aangepast. Paraffine segmenteren in combinatie met andere moleculaire technieken wordt veel gebruikt in de neurobiologie, weefsel morfologie en andere onderzoek velden11,12,13. Deze methode kan potentieel,14,15 van de efficiëntie van de klinische keuring en andere biologische exemplaren buiten de drie weefseltypes (HLA) gebruikt hier verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben een patent op dit apparaat en verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 31400936, 31460260) en de Natural Science Foundation van Jiangxi provincie van China (20171BAB215020). Wij danken ook de gezamenlijk programma tussen Nanchang Universiteit en Queen Mary University of London voor de ondersteuning van dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12 V 200 W) | |||
| Temperature controller(12 V 120 W) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
- Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
- Sabaliauskas, N. A., et al.
- Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).
- Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).
