Summary
Qui, presentiamo un protocollo per migliorare la paraffina sezionamento. Questo metodo combina taglio e mobile utilizzando una semplice camera termostatica per evitare il processo di trasferimento richiesto secondo il metodo convenzionale. Di conseguenza, l'efficienza e il numero di sezioni della paraffina intatti furono notevolmente migliorate.
Abstract
Sezionamento del tessuto paraffina-incastonato è ampiamente usato in istologia e patologia. Tuttavia, è noioso. Per migliorare questo metodo, diverse aziende commerciali hanno messo a punto sistemi di trasferimento di sezione complessa utilizzando acqua liquida. Per semplificare questa tecnologia, abbiamo creato un semplice metodo utilizzando attrezzature fatte in casa che combina taglio e galleggianti all'interno di una semplice camera termostatica; Pertanto, le sezioni immettere automaticamente il bagno d'acqua sulla superficie dell'acqua. L'ippocampo da cervelli di topo adulto, reni di topo adulto, cervelli embrionali del mouse e dello zebrafish adulto sono stati tagliati utilizzando paraffina convenzionale di sezionamento e il metodo proposto per il confronto. Analisi statistica dimostra che il nostro metodo migliorato salvato tempo e sezioni più alte qualità di prodotto. Inoltre, paraffina sezionamento di un esemplare intero in breve tempo è facile per gli operatori junior.
Introduction
Lo studio morfologico è importante nella ricerca biologica. Anche se la nuova tecnologia ha permesso ai ricercatori di osservare loro obiettivi direttamente dall'intero tessuto o organismi1,2,3, l'esemplare di taglio in sezioni sottili, seguirono dalla macchiatura, rimane il primario morfologia del metodo solo tessuto, ma anche proteine targeting direttamente nel tessuto. La microscopia chiara utilizza tre tipi di sezione: paraffina, congelato e semifini. Sebbene cryosectioning è comune per proteggere l'antigenicità del tessuto e la preparazione del campione è semplice, la morfologia del tessuto mantenuto è scadente e non adatto per sottile taglio4,5. Sezionamento di paraffina è il metodo più frequentemente utilizzato per l'esposizione di morfologia ben conservato. Come gli esemplari sono completamente disidratati e incorporati in cera, i blocchi di paraffina possono essere conservati a tempo indeterminato. Inoltre, paraffina sezionamento produce sezioni sottili che migliorare l'accesso della sonda biologico in ulteriori esperimenti e riducono la sovrapposizione di strati di cella nella direzione Z.
Tuttavia, paraffina convenzionale di sezionamento è noioso e richiede abilità dell'operatore. Sezioni della paraffina subiscono fissazione, disidratazione, incastonatura, taglio e galleggianti. È importante trasferire nastri sezione dal portalama a bagno d'acqua è necessaria, ma difficile per operatori junior. Specialmente in aria asciutta, i nastri di sezione torcerà elettricità statica e sono difficili da spiegare sulla superficie dell'acqua calda. Per migliorare la sezione qualità, inumidire la superficie di tessuto esposto tra microtomo lama passate, i blocchi di cera di raffreddamento immergendole in acqua con ghiaccio, o alzando l'umidità con un umidificatore vicino il microtomo sono consigliate6,7 . I più nuovi metodi per migliorare la paraffina sezionamento includono ibrido inclusione in paraffina, cryosectioning8e sezione commerciale trasferimento sistema assistenza9. Sebbene questi metodi migliorano parzialmente paraffina sezionamento velocità e qualità, fanno di sezionamento molto più ingombrante, e sistemi di trasferimento di sezione commerciale sono costosi.
In questo protocollo, dimostriamo come creare attrezzature passo dopo passo, semplice, economico e flessibile che possono essere collegata per il supporto della lama di un microtomo rotativo. Questa apparecchiatura è composta da un canale di sezione, un bagno di acqua e un riscaldatore con un interruttore di rilevazione di temperatura. Dopo il taglio, decine di sezioni fluiscono nella scanalatura della sezione e inserire il bagnomaria direttamente, così sta svolgendo automaticamente. Questo migliora l'efficienza di taglio di paraffina e rende questa tecnologia più conveniente. Utilizzando questo metodo, più adulti sezioni di hippocampal di topo, sezioni di rene di topo adulto, embrionale 15,5 sezioni giorno-vecchio (E15.5) del mouse del cervello e occhio di zebrafish adulto sezioni sono state raccolte in meno tempo e morfologicamente più intatto. Questo metodo può essere utilizzato anche per altri campioni di tessuto che richiedono paraffina accelerata di sezionamento, evitando perdita di distinzione di sezione.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato di Università di Nanchang.
1. Montare l'attrezzatura e collegare il microtomo
- Progettare il parametro per i requisiti (integrativa Figura 1).
- Inviare il parametro per una fabbrica locale per produrre i pannelli acrilici.
- Montare tutte le parti in sequenza: utilizzare cloroformio per combinare 7 pannelli acrilici commerciale in un serbatoio con un bagno di acqua e canale di sezione (Figura 1).
Attenzione: Cloroformio produce sostanze tossiche quando incontra la luce e l'ossigeno. Montare l'apparecchiatura in una cappa aspirante. - Installare l'elemento riscaldante elettrico tubolare attraverso il foro nel bordo acrilico #1 (Figura 2A, punta di freccia).
- Per installare il regolatore di temperatura, creare un piccolo foro sul bordo acrilico #2 con un trapano elettrico e installare il rilevatore di temperatura (Figura 2A, freccia). Installare un termostato digitale sul serbatoio (Figura 2A).
Nota: Il rilevatore di temperatura dovrebbe essere all'interno di 1 cm sotto la superficie dell'acqua. - Per fornire l'accesso di potere, regolare la tensione sotto 24 V prima di accendere l'apparecchio.
- Rimuovere il vassoio dei rifiuti di sezione dal microtomo.
- Collegare il canale di sezioni con il supporto della lama del microtomo con sigillante siliconico neutro (Figura 2B).
Nota: Non striscio qualsiasi sigillante siliconico neutro sopra la parte superiore della lama, affinché la vecchia lama può essere facilmente sostituita. - A secco durante la notte per consentire il cloroformio e neutro del silicone sigillante per solidificare.
- Installare la lama per il supporto della lama. Versare acqua nel bagno d'acqua (Figura 2). La superficie dell'acqua deve solo toccare la parte superiore della lama (Figura 2D, testa di freccia).
2. paraffina sezionamento
Nota: Detriti spesso si accumulano sui bordi superiori o inferiori del blocco di cera e la superficie dell'acqua. Questo detriti deve essere deselezionato regolarmente.
-
Eseguire paraffina convenzionale sezionamento10.
- Bloccare il preparato di paraffina-incastonato su un microtomo rotativo e posizionare la lama in un portalama.
- Ruotare il volantino e la sezione del campione.
- Trasferire il nastro sezionato a bagno d'acqua calda di 38,5 ° C.
- Raccogliere che le sezioni sul microscopio scivolare dalla superficie dell'acqua dopo lo svolgimento.
- Asciugare i vetrini in un forno a 42 ° C durante la notte.
-
Paraffina migliorata sezionamento (Figura 3)
- Accendere l'apparecchiatura.
- Aprire la stufa con interruttore di rilevamento temperatura e impostare la temperatura mirata tra 38,0 ° C a 40,0 ° C per 1 h in anticipo di riscaldare l'acqua.
- Modificare il blocco di paraffina acquisito da inclusione in paraffina; quindi posizionare il blocco di paraffina su morsetto di microtomo e bloccarlo.
Nota: I bordi superiori ed inferiori del blocco paraffina dovrebbero essere modificati in orizzontale per evitare che il nastro di sezione da formando un arco e diventando in grado di fluire attraverso il canale di sezioni strette. - Avvicinarsi rapidamente il campione di taglio di sezioni più spesse.
- Regolare ad uno spessore di sezione adeguata (10 µm per cervelli di topo adulto, reni di topo adulto e cervelli di topo di embrione, 4 µm per zebrafish occhi). Ruotare il volantino e le sezioni verranno immesso automaticamente il canale sezioni e bagno.
- Sezione il campione in una corsa di taglio lento e uniforme (Figura 3A).
Nota: Utile della prima sezione sarà modificato dopo il volantino è stato interrotto per qualche minuto. Le lame monouso devono essere sostituite quando le sezioni hanno graffi consecutivi. - Guida le sezioni nella camera del bagno a galleggiare in una linea (Figura 3B, 3C).
Nota: Se nella sezione head aderisce alla parete della camera, è possibile utilizzare una guida di pennello per tenerlo galleggianti. - Rispettare le sezioni su vetrini da microscopio. Dopo le sezioni dispiegarsi pienamente nel bagno d'acqua, sezioni separate diverse con le pinzette. Poi li pick up dal bagno di acqua sui vetrini al microscopio (Figura 3D).
Nota: Sezioni dovrebbero essere prelevati dalla parte posteriore del bagno d'acqua, come quelli del canale di sezioni e l'anteriore del bagno d'acqua non sarà ancora completamente spiegati. - Asciugare i vetrini mettendoli in un forno di 42 ° C durante la notte. Le diapositive quindi possono essere conservate a temperatura ambiente a tempo indeterminato.
- Utilizzare la colorazione ematossilina-eosina (HE) per motivi di valutazione del metodo migliorato8.
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Representative Results
Il metodo migliorato ha aumentato il numero delle sezioni di paraffina intatto. Abbiamo testato questo metodo nuovo su tessuto ippocampale topo adulto, reni di topo adulto, cervelli embrionali del mouse e dello zebrafish. Acqua è stato aggiunto al serbatoio, e la temperatura dell'acqua è stata mantenuta tra 38,0 ° C a 40,0 ° C. Dopo una preparazione in serie i campioni di tessuto, sono stati sezionati e rispetto alla divisione convenzionale. Il nuovo metodo di evitata perdita di sezione e hanno aumentato la quota delle sezioni intatte nell'ippocampo di topo adulto, reni di topo adulto, cervelli di topo E15.5 e adulti dello zebrafish (Figura 4A4C, 4E, 4G). In conclusione, il nostro metodo migliorato il sezionamento di prevenire la perdita di sezione e la raccolta di sezioni più intatti per campione.
Il metodo migliore è diminuito il tempo trascorso per campione. Confrontando il tempo impiegato tra il metodo convenzionale e migliorato il nostro metodo, abbiamo effettuato tutta la serie di sezionamento (dalla prima sezione per l'ultimo tratto di un organo) il topo adulto ippocampo, reni di topo adulto, cervelli di topo E15.5 e adulto occhi di zebrafish. I risultati indicano che il metodo migliorato accelerato la paraffina sezionamento velocità in tutti i campioni testati (Figura 4B4D, 4F, 4 H). In generale, il nostro metodo consentito per il sezionamento di paraffina di alta qualità più velocemente.
Sezioni di serie della retina ottica zebrafish è stata osservata macchiando H ed E. Per il taglio di serie del segmento disco ottico della retina zebrafish, erano meglio le sezioni raccolte dal metodo migliorato ha migliore integrità rispetto a quelli dalla paraffina convenzionale (Figura 5A, 5B) metodo a sezione ottica. Non c'era differenza significativa tra questi due metodi per quanto riguarda la qualità delle sezioni più raccolti (Figura 5, 5D). In alcuni casi, la qualità delle sezioni raccolte dal metodo convenzionale erano relativamente basso (Figura 5E, 5F).
Figura 1: il processo per l'assemblaggio i 7 pannelli acrilici commerciale in un serbatoio. (A) vista d'insieme delle 7 tavole acriliche. (B-G) Montaggio graduale del serbatoio dal Consiglio n. 1 a bordo #7. (H) serbatoio primario dopo l'assemblaggio. (I) dimensioni del serbatoio generale; la membrana di protezione sulla superficie del serbatoio è stato rimosso per una installazione successiva. L = 400 mm, L' = 220 mm, H = 122 mm, L = 200 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: le attrezzature opportunamente assemblata pronta per l'uso. Attrezzature (A) l'intatta dopo essere stata collegata per il microtomo rotativo. Indicazione di freccia, il rilevatore di temperatura è installato attraverso il piccolo foro di trapano elettrico. Testa di freccia, il riscaldatore (elemento riscaldante elettrico tubolare) viene installato attraverso il foro nel Consiglio #1. (B) l'area tratteggiata amplificato in una, la caratteristica della connessione tra il supporto della lama del microtomo e il canale di sezioni. Arrow head, il portalama e canale sezioni sono collegate da sigillante siliconico neutro. (C) stesso di B, con l'acqua versata e lama installata. (D) vista laterale della zona tratteggiata in testa della freccia C., la superficie dell'acqua è vicino al bordo della lama. VT: trasformatore di tensione; WB: bagno di acqua; DT: termostato digitale; B: lama; BH: portalama; SC: canale sezioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: la paraffina migliorata processo di sezionamento. Le figure che si trova nell'angolo sinistro inferiore sono rispettivamente le aree tratteggiate amplificate in A-D. Indicazioni della freccia, la prima sezione. (A, A') La sezione entra nel canale sezioni immediatamente e direttamente dopo taglio. (B, B') Il nastro di sezioni attraversa il confine tra la vasca di acqua e canale di sezioni. (C, C') Le sezioni del galleggiante per la parte posteriore del bagno d'acqua e sono completamente spiegate. (D, D') Le sezioni sono prelevate dal vetrino da microscopio quando raggiungono la parte posteriore del bagno d'acqua e sono completamente spiegati. SC: canale sezioni; WB, bagno d'acqua. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: il metodo di taglio migliorato migliorato il tasso di efficienza e rendimento significativamente per tutta la serie sezioni. Il tasso di rendimento uguagliato la proporzione delle sezioni intatte in tutte le sezioni di taglio. I dati sono mostrati come la media ± SEM e acquistati dallo stesso operatore. (A, C, E, G) Il metodo migliorato ha impedito la perdita di sezione dell'ippocampo topo adulto (91.04 ± 1.429% N = 3, vs 97,63 ± 0.4864% N = 3, p = 0.0120), adulto del mouse reni (92.30 ± 0.5689% N = 3, vs 95.99 ± 0.7055% N = 3, p = 0.0153), cervello di topo E15.5 (90,67 ± 1.549%, N = 3 vs 97.01 ± 0.2816%, N = 3, p = 0.0158) e adulti dello zebrafish (91.27 ± 0.9734% N = 4 vs 96.32 ± 0.7217% N = 4, p = 0,0059). (B, D, F, H) Il metodo migliorato salvato tempo confrontato con il metodo convenzionale per l'ippocampo di topo adulto (126.0 3,606 min vs 79,67 ± 1,856 min, N = 3, p = 0,0003), adulto del mouse reni (66.67 1,764 min vs 41.33 ± 2,186 min, N = 3, p = 0,0008), E15.5 del mouse br Ain (99.67 3,480 min vs 52,33 ± 4,333 min, N = 3, p = 0,0010) e adulti dello zebrafish (48.00 2,160 min vs 30,75 ± 1,797 min, N = 4, p = 0,0009). * P < 0,05, * * P < 0.01, * * * P < 0,005. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: H ed E colorazione delle sezioni tutta la serie del segmento disco ottico di zebrafish occhi acquisito dai metodi convenzionali e migliorato paraffina sezionamento dallo stesso operatore vengono confrontati. (A) paraffina convenzionale sezionamento (21 sezioni). (B) migliorata di paraffina sezionamento (24 sezioni). (C) area tratteggiata della A6. (D) area tratteggiata di B7. (E) area tratteggiata di A17. (F) area tratteggiata di B19. Asterischi, le sezioni con relativamente scarsa qualità. Punte di freccia, disco ottico; Frecce, grave lacerazione del tessuto retinico. Barra della scala = 200 µm (A e B); Barra della scala = 50 µm (C, D, E, F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 1: I parametri di dimensione delle 7 schede commerciali acriliche. Il numero rappresenta la lunghezza del corrispondente margine di bordo. Unità: mm. per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Per migliorare la paraffina sezione morfologia e risolvere il problema del tempo sprecato durante il sezionamento di paraffina convenzionale, abbiamo creato una paraffina migliore metodo che combina taglio e dispiegarsi di sezionamento. Questo metodo migliorato si basa su semplici attrezzature che comprende un canale di sezione, un bagno di acqua e un riscaldatore con un interruttore di rilevazione di temperatura. La barra multifunzione sezione entra nel bagno d'acqua attraverso il canale di sezione e si svolge automaticamente durante il taglio. Di conseguenza, questo metodo migliora paraffina sezionamento qualità ed efficienza, che è stata verificata dalla divisione di paraffina di topo adulto ippocampo, reni di topo adulto, cervelli di topo E15.5 e adulti dello zebrafish.
Per evitare la sezione curling durante paraffina convenzionale di sezionamento, sono stati fatti molti aggiustamenti, come inumidire la superficie del tessuto, il raffreddamento del blocco di cera, aumentando l'umidità e combinando cryosectioning6,7, 8; Tuttavia, queste regolazioni rendono più noioso paraffina sezionamento. Un sistema di trasferimento di sezione commerciale che si basa sul fluido acqua ha avuto più successo. In questo sistema, la sezione contatti la superficie dell'acqua subito dopo il sezionamento e il flusso di acqua azionate da motori elettrici trasferisce le sezioni dal portalame per l'inferiore acqua calda bagno9. Grazie al suo meccanismo, elettricità statica non inibisce il sezionamento, con conseguente miglioramento della sezione della qualità. Inoltre, come questo sistema evita il trasferimento manuale di sezioni dal portalame a bagno d'acqua, facilmente danneggiare il fragile sezioni, aiuta anche nell'acquisizione di sezioni sottili di alta qualità.
Con il nostro metodo migliorato, l'attrezzatura semplice avvalendosi dell'esperienza del sistema di trasferimento sezione commerciale con alcuni vantaggi. In primo luogo, l'attrezzatura è più conveniente, che potrebbe diffondere questo metodo nei laboratori di sviluppo delle regioni e possono integrare il sistema di trasferimento di sezione commerciale. In secondo luogo, l'acqua nell'apparecchiatura è statico e non disturba mai le sezioni, che permette di acquisire sezioni più sottili. Abbiamo sezionato consecutivamente dello zebrafish di 2 µm spessore utilizzando il metodo migliorato, e le sezioni acquisite erano di qualità superiore. In terzo luogo, vasca di bagno d'acqua più grande viene utilizzato nelle apparecchiature, che consente almeno 40 sezioni per spiegare e galleggiare contemporaneamente, permettendo due operatori a cooperare. Una persona può tagliare il campione di tessuto continuamente e l'altro può pescare direttamente le sezioni. Questo riduce il tempo di attesa per le sezioni a svolgersi. Successivo taglio con un colpo di taglio uniforme migliora anche la qualità di sezione.
La struttura e l'aspetto della nostra attrezzatura semplice richiede un miglioramento. Ad esempio, i componenti, quali il potere, una stufa e un regolatore di temperatura, è integrabile per rendere questa apparecchiatura più integrante e portatile. Inoltre, commerciali microtomi rotativi hanno dimensioni diverse. Per connettersi a altri microtomi, l'angolo e l'altezza di questa apparecchiatura deve essere regolate. Paraffina sezionamento combinato con altre tecniche molecolari è ampiamente usato in neurobiologia, morfologia del tessuto ed altri ricerca campi11,12,13. Potenzialmente, questo metodo può migliorare ispezione clinica efficienza14,15 e altri campioni biologici oltre i tipi di tre tessuto utilizzati qui.
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Disclosures
Gli autori hanno un brevetto su questo dispositivo e non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation della Cina (Grant n. 31400936, 31460260) e il Natural Science Foundation di Jiangxi Provincia della Cina (20171BAB215020). Ringraziamo anche il programma congiunto tra Università di Nanchang e Queen Mary University of London per sostenere questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12 V 200 W) | |||
| Temperature controller(12 V 120 W) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
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