Summary
Nous présentons ici un protocole visant à améliorer le sectionnement de la paraffine. Cette méthode combine coupe et flottant à l’aide d’une simple chambre thermostatique pour éviter le processus de transfert requis par la méthode conventionnelle. En conséquence, l’efficacité et le nombre de sections de paraffine intacts ont été grandement améliorées.
Abstract
Découpe des tissus inclus en paraffine est largement utilisé en histologie et pathologie. Toutefois, il est fastidieux. Pour améliorer cette méthode, plusieurs sociétés commerciales ont mis au point des systèmes de transfert de section complexe à l’aide de l’eau liquide. Pour simplifier cette technologie, nous avons créé une méthode simple à l’aide de matériel fait maison qui combine coupe et flottant dans une enceinte thermostatique simple ; par conséquent, les sections automatiquement dans le bain d’eau à la surface de l’eau. L’hippocampe du cerveau de souris adultes, reins de souris adulte, cerveaux embryonnaires de souris et yeux de poisson-zèbre adulte ont été coupés à l’aide de paraffine conventionnelle de sectionnement et de la méthode présentée aux fins de comparaison. L’analyse statistique montre que notre méthode améliorée enregistrés fois et produit des Articles de qualité supérieures. En outre, il est facile pour les opérateurs juniors de paraffine sectionnement d’un spécimen entier en peu de temps.
Introduction
Étude morphologique est importante dans la recherche biologique. Bien que la nouvelle technologie a permis aux chercheurs d’observer leurs cibles directement du tissu entier ou organismes1,2,3, coupant le spécimen en lames minces, suivie d’une coloration, reste le principal la morphologie tissulaire seule méthode fornot mais aussi protéine ciblant directement dans le tissu. Microscopie optique utilise trois types de section : paraffine, congelé et semi-fines. Bien que cryosectioning est commun pour protéger l’antigénicité des tissus, et la préparation des échantillons est simple, la morphologie des tissus conservés est pauvre et impropres à être mince séparation4,5. Sectionnement de paraffine est la méthode le plus souvent utilisée pour qui présentent une morphologie bien conservée. Comme les spécimens sont déshydratées complètement et incorporés dans la cire, les blocs de paraffine peuvent être conservés indéfiniment. En outre, paraffine sectionnement produit des coupes minces qu’améliorer l’accès de la sonde biologique dans d’autres expériences et réduisent la superposition de couche de cellule dans la direction Z.
Cependant, paraffine conventionnelle de sectionnement est fastidieux et exige des compétences de l’opérateur. Sections de paraffine subissent une fixation, déshydratation, enrobage, découpage et flottant. Ce qui est important, rubans section proviennent du porte-couteau à l’eau du bain est nécessaire mais difficile pour les opérateurs juniors. Surtout dans l’air sec, les rubans de section seront tordre à cause de l’électricité statique et sont difficiles à se dérouler sur la surface de l’eau tiède. Afin d’améliorer la section qualité, humidifier la surface du tissu exposé entre les passages de lame microtome, refroidissement des blocs de cire en l’immergeant dans l’eau glacée, ou le relèvement de l’humidité avec un humidificateur près du microtome est recommandée6,7 . Des méthodes plus récentes pour améliorer le sectionnement de la paraffine incluent hybride enrobage de paraffine, cryosectioning8et section commerciale transfert système assistance9. Bien que ces méthodes améliorent partiellement paraffine sectionnant la rapidité et la qualité, ils font la section beaucoup plus encombrante, et systèmes de transfert de la section commerciale sont chers.
Dans ce protocole, nous montrent comment créer des équipements simples, bon marché et flexible étape par étape, qui peuvent être reliée au détenteur d’un microtome à lame. Cet équipement se compose d’un canal de section, un bain d’eau et un appareil de chauffage avec un interrupteur de détection de température. Après la découpe, des dizaines de sections se jettent dans le canal de section et entrer dans le bain d’eau directement, donc qui se déroulent automatiquement. Cela améliore l’efficacité de sectionnement de la paraffine et rend cette technologie plus commode. En utilisant cette méthode, plus adulte souris hippocampe sections, sections de rein de souris adultes, embryonnaires 15,5 sections jour-vieux (E15.5) souris cerveau et œil de poisson-zèbre adulte sections ont été récoltées en moins de temps et est restées intact plus morphologiquement. Cette méthode peut également être utilisée pour d’autres échantillons de tissus qui requièrent le sectionnement de paraffine accéléré tout en évitant la perte de distinction de la section.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité emploi de l’Université de Nanchang et animalier.
1. Assemblez l’équipement et le Microtome
- Concevoir le paramètre aux exigences (supplémentaire Figure 1).
- Envoyer le paramètre à une usine locale pour fabriquer les panneaux acryliques.
- Assembler toutes les pièces dans l’ordre : chloroforme permet de combiner les 7 planches acryliques commerciales dans un réservoir avec un bain section de canal et de l’eau (Figure 1).
ATTENTION : Chloroforme produit des substances toxiques lorsqu’il rencontre la lumière et l’oxygène. Assembler l’appareil sous une hotte. - Installez l’élément chauffant tubulaire dans le trou en acrylique Conseil #1 (Figure 2 a, , flèche).
- Pour installer le régulateur de température, créez un petit trou sur le plateau acrylique #2 à l’aide d’une perceuse électrique et installer le détecteur de température (Figure 2 a, , flèche). Installez un thermostat numérique sur le réservoir (Figure 2 a).
Remarque : Le détecteur de température devrait être moins de 1 cm sous la surface de l’eau. - Pour pouvoir accéder, ajuster la tension au-dessous de 24 V avant d’allumer l’appareil.
- Retirez le bac à déchets section le microtome.
- Lien vers le canal de sections avec le porte-lame microtome avec un scellant au silicone neutre (Figure 2 b).
Remarque : Ne pas salir tout mastic silicone neutre au-dessus de la lame afin que la lame usagée est facilement remplaçable. - Sécher toute la nuit pour permettre au chloroforme et le temps du mastic silicone neutre pour solidifier.
- Installer la lame dans le porte-lame. Versez l’eau dans le bain d’eau (Figure 2). La surface de l’eau doit juste toucher la partie supérieure de la lame (tête de flècheFigure 2D, ).
2. sectionnement de paraffine
Remarque : Les débris s’accumulent souvent sur les bords supérieurs ou inférieurs de l’édifice de la cire et la surface de l’eau. Ces débris doivent être nettoyées régulièrement.
-
Effectuer la paraffine conventionnelle la section10.
- Le spécimen de paraffine sur un microtome rotatif et l’insérer la lame dans un porte-pale.
- Tourner le volant et le modèle de l’article.
- Transférer le ruban de paraffine sectionné dans le bain d’eau chaude de 38,5 ° C.
- Ramasser que les sections sur le microscope glissent à la surface de l’eau après dépliage.
- Sécher les lames dans une étuve à 42 ° C pendant la nuit.
-
Paraffine améliorée de sectionnement (Figure 3)
- Allumez l’appareil.
- Ouvrir l’appareil de chauffage avec interrupteur de détection de température et régler la température ciblée entre 38,0 ° C à 40,0 ° C pendant 1 h à l’avance réchauffer l’eau.
- Modifier le bloc de paraffine acquis par enrobage de paraffine ; Ensuite, placez le bloc de paraffine sur cassette de serrage du microtome et verrouillez-la.
Remarque : Les bordures supérieures et inférieures du bloc de paraffine doivent être modifiés horizontalement afin d’éviter le ruban section formant un arc de cercle et de leur incapacité à s’écouler par le canal de sections étroites. - Se rapprocher rapidement l’échantillon par la coupe des sections plus épaisses.
- S’adapter à une épaisseur de coupe approprié (10 µm pour les cerveaux de souris adultes, les reins de souris adultes et cerveau de souris embryon, 4 µm pour les yeux de poisson zèbre). Tourner le volant et les sections entrera automatiquement le canal de sections et de bain.
- L’article le spécimen dans une course lente et uniforme (Figure 3 a).
Remarque : Thethickness de la première section sera modifiée après que le volant a été arrêté pendant quelques minutes. Les lames jetables doivent être remplacés lorsque les sections ont des rayures consécutives. - Guidez les sections dans la chambre de bain à flotter en ligne (Figure 3 b, 3C).
Remarque : Si la section head adhère à la paroi de la chambre, utiliser un guide de la brosse pour le garder flottant. - Respecter les sections sur lames de microscope. Après les sections se déroulent entièrement dans le bain d’eau, séparé de plusieurs sections avec des pincettes. Ensuite, ramasser de l’eau du bain sur les lames de microscope (Figure 3D).
NOTE : Sections doivent être ramassées de la partie postérieure de la baignoire d’eau, comme ceux de la manche de sections et la partie antérieure de l’eau du bain ne sera pas encore entièrement dépliés. - Sécher les lames en les plaçant dans un four à 42 ° C pendant la nuit. Les lames peuvent ensuite être stockés à température ambiante indéfiniment.
- Utiliser la coloration hématoxyline-éosine (HE) dans un souci de l’évaluation de la méthode améliorée de8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La méthode améliorée a augmenté le nombre de sections de paraffine intact. Nous avons testé cette nouvelle méthode sur souris adulte tissu hippocampique, reins de souris adultes, cerveaux embryonnaires de souris et yeux de poisson-zèbre. L’eau a été ajoutée au réservoir, et la température de l’eau a été maintenue entre 38,0 ° C à 40,0 ° C. Après une série de préparation les échantillons de tissus, ils étaient sectionnés et par rapport aux coupes classiques. La nouvelle méthode évité la perte de section et a augmenté la proportion de tronçons intacts dans le hippocampe de souris adultes, souris adulte reins, cerveau de souris E15.5 et yeux de poisson-zèbre adulte (Figure 4 a4C, 4F, 4 G). En conclusion, notre méthode améliorée le sectionnement de prévenir la perte de section et la récolte plus de sections intacts par spécimen.
La méthode améliorée a réduit le temps passé par spécimen. En comparant le temps nécessaire entre la méthode conventionnelle et notre méthode améliorée, nous avons réalisé ensemble-série de sectionnement sur l’hippocampe de souris adultes, reins de souris adultes, cerveaux de souris E15.5 et adulte (à partir de la première section à la dernière section d’un organe) yeux de poisson-zèbre. Les résultats suggèrent que la méthode améliorée accélère la paraffine sectionnement vitesse dans tous les échantillons testés (Figure 4 b4D, 4F, 4 H). En général, notre méthode autorisée pour le plus rapide de haute qualité paraffine sectionnement.
Sections de série de la rétine optique de poisson-zèbre a été observée par H et E coloration. Pour la série Coupe du tronçon disque optique de la rétine de poisson-zèbre, les sections récoltées dans la méthode améliorée étaient mieux a meilleure intégrité que celles de la paraffine conventionnelle sectionnement méthode (Figure 5 a, 5 b). Il n’y avait aucun différence significative entre ces deux méthodes quant à la qualité des sections plus récoltées (Figure 5, 5D). Parfois, la qualité des articles récoltés à partir de la méthode conventionnelle étaient relativement faibles (Figure 5E, 5F).
Figure 1 : le processus pour assembler les 7 planches acryliques commerciales dans un réservoir de. (A) vue d’ensemble des 7 conseils acryliques. (G-B) Montage par étapes de la citerne de Conseil # 1 au Conseil #7. (H) le réservoir primaire après assemblage. (I) la taille du réservoir générales ; la membrane protectrice sur la surface du réservoir a été supprimée pour une installation plus loin. L = 400 mm, L' = 220 mm, H = 122 mm, L = 200 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : l’équipement correctement assemblé prêt à l’emploi. Matériel (A) l’intact après être relié sur le microtome rotatif. Indication de la flèche, le détecteur de température est installée dans le petit trou de perceuse électrique. Pointe de flèche, le chauffage (élément chauffant tubulaire) est installé dans le trou de Conseil #1. (B) la zone pointillée amplifiée dans A, la fonctionnalité de la connexion entre le porte-lame microtome et le canal de sections. Pointe de flèche, le support de lame et le canal de sections sont reliées par mastic silicone neutre. (C) de même que B, avec l’eau coulé et lame installée. (D) vue de côté de la zone en pointillés dans la tête de C. flèche, la surface de l’eau est proche du bord de la lame. VT : transformateur de tension ; WB : bain d’eau ; DT : thermostat numérique ; B: lame ; BH : support de lame ; SC : canal de sections. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : la paraffine améliorée la section processus. Les chiffres situés dans le coin inférieur gauche sont les zones en pointillés amplifiés en A-D respectivement. Indications de la flèche, la première section. (A, A') La section pénètre dans le canal de sections immédiatement et directement après coupe. (B, B') Le ruban de sections franchit la frontière entre le bain de l’eau et le canal de sections. (C, C') Les sections flottent à la partie postérieure de l’eau du bain et sont entièrement dépliées. (D, D') Les sections sont captées par la lame de microscope quand ils atteignent l’extrémité postérieure de l’eau du bain et sont entièrement dépliés. SC : canal sections ; WB, bain d’eau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : la methode de sectionnement améliorée amélioré le taux d’efficacité et le rendement significativement pour les sections ensemble série. Le taux de rendement représente la proportion des sections intactes dans toutes les sections coupées. Données figurent comme la moyenne ± SEM et acquis par le même opérateur. (A, C, E, G) La méthode améliorée empêche la perte de section de l’hippocampe de souris adulte (91.04 ± 1,429 % N = 3, vs 97.63 ± 0.4864 % N = 3, p = 0,0120), adulte souris reins (92.30 ± 0.5689 % N = 3, vs 95.99 ± 0.7055 % N = 3, p = 0,0153), cerveau de souris E15.5 (90.67 ± 1,549 %, N = 3 vs 97.01 ± 0.2816 %, N = 3, p = 0.0158) et des yeux de poisson-zèbre adulte (91.27 ± 0.9734 % N = 4 vs 96,32 ± 0.7217 % N = 4, p = 0,0059). (B, D, F, H) Le temps de la méthode améliorée sauvé par rapport à la méthode conventionnelle pour l’hippocampe de souris adulte (126,0 ± 3,606 min vs 79.67 ± 1,856 min, N = 3, p = 0,0003), adulte souris reins (66.67 ± 1,764 min vs 41,33 ± 2,186 min, N = 3, p = 0,0008), E15.5 souris br Ain (99,67 ± 3,480 min vs 52,33 ± 4,333 min, N = 3, p = 0,0010) et des yeux de poisson-zèbre adulte (48.00 ± 2,160 min vs 30.75 ± 1,797 min, N = 4, p = 0,0009). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,005. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : H et E coloration des sections ensemble-série du tronçon disque optique du poisson-zèbre yeux acquis des méthodes conventionnelles et amélioré le sectionnement de la paraffine par le même opérateur sont comparés. (A) conventionnelle paraffine sectionnement (21 art.). (B) amélioration de paraffine sectionnement (24 art.). (C) zone en pointillés de l’A6. (D) zone en pointillés de B7. (E) zone en pointillés de A17. (F) zone en pointillés de B19. Astérisques, les sections de relativement mauvaise qualité. Têtes de flèche, disque optique ; Flèches, grave déchirure des tissus rétiniens. Echelle = 200 µm (A et B) ; Echelle = 50 µm (C, D, E, F). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 : les paramètres de dimension des planches acryliques commerciales 7. Le numéro représente la longueur de la marge de la Commission correspondante. Unités : mm. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pour améliorer la paraffine section morphologie et résoudre le problème de perte de temps au cours de la paraffine conventionnelle de sectionnement, nous avons créé une paraffine meilleure méthode qui combine la coupe et du dépliage de sectionnement. Cette méthode améliorée s’appuie sur des équipements simples qui comprend un canal de section, un bain d’eau et un appareil de chauffage avec un interrupteur de détection de température. Le ruban de la section entre le bain d’eau à travers le canal de la section et se déploie automatiquement pendant que vous coupez. Par conséquent, cette méthode améliore la paraffine sectionnant la qualité et l’efficacité, qui a été vérifiée par la paraffine de sectionnement de l’hippocampe de souris adultes, souris adulte reins, cerveau de souris E15.5 et yeux de poisson-zèbre adulte.
Afin d’éviter la section curling au cours de la paraffine conventionnelle de sectionnement, plusieurs ajustements ont été apportés, tels que l’humidification de la surface du tissu, refroidissement le bloc de cire, augmentant le taux d’humidité et la combinaison cryosectioning6,7, 8; Toutefois, ces ajustements faire paraffine sectionnement plus fastidieux. Un système de transfert de la section commerciale qui s’appuie sur l’eau liquide a eu plus de succès. Dans ce système, la section entre en contact avec la surface de l’eau immédiatement après la coupe, et le jet d’eau à moteur électrique transfère les sections du porte-lames à la basse eau chaude bain9. En raison de son mécanisme, l’électricité statique n’inhibe pas le sectionnement, résultant en une qualité meilleure section. En outre, puisque ce système évite de transférer manuellement sections du porte-lames pour le bain d’eau, facilement endommager les articles fragiles, il aide également à acquérir des sections minces de haute qualité.
Avec notre méthode améliorée, l’équipement simple s’appuie sur l’expérience du système section commerciale avec quelques avantages. Tout d’abord, le matériel est moins cher, qui pourrait faire connaître cette méthode dans les laboratoires dans les régions en développement et peut compléter le système de transfert de la section commerciale. En second lieu, l’eau dans l’équipement est statique et ne perturbe les sections, ce qui permet d’acquérir des sections minces. Nous avons sectionné consécutivement yeux de poisson-zèbre de 2 µm d’épaisseur à l’aide de la méthode améliorée, et les sections acquises étaient de meilleure qualité. Troisièmement, une plus grande cuve en eau est utilisé dans l’équipement, ce qui permet au moins de 40 sections à déplier et flottent en même temps, permettant aux deux opérateurs de coopérer. Une personne peut couper l’échantillon de tissu en permanence et l’autre peut pêcher directement les sections. Cela réduit les temps d’attente pour les sections de se dérouler. Coupe successifs d’un trait de coupe uniforme améliore également la qualité de la section.
La structure et l’apparence de notre équipement simple exige l’amélioration. Par exemple, les composants, comme la puissance, un chauffe-eau et un régulateur de température, peuvent être intégrés pour rendre cet équipement plus intégrante et portable. En outre, microtomes rotatifs commerciaux ont des tailles différentes. Pour vous connecter aux autres microtomes, l’angle et la hauteur de cet équipement doivent être ajustées. Paraffine sectionnement combiné avec d’autres techniques moléculaires est employé couramment en neurobiologie, morphologie tissulaire et autres champs de recherche11,12,13. Potentiellement, cette méthode peut améliorer inspection clinique efficacité14,15 et autres spécimens biologiques au-delà des types de trois tissus utilisés ici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ont un brevet sur ce dispositif et ne déclarent aucun intérêts opposés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Grant no 31400936, 31460260) et la Fondation sciences naturelles du Jiangxi Province de Chine (20171BAB215020). Nous remercions également le programme conjoint entre l’Université de Nanchang et Queen Mary University of London pour soutenir ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12 V 200 W) | |||
| Temperature controller(12 V 120 W) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
- Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
- Sabaliauskas, N. A., et al.
- Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).
- Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).
