Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar o corte de parafina. Este método combina flutuante usando uma simples câmara termostática para evitar o processo de transferência exigido pelo método convencional e de corte. Como resultado, a eficiência e o número de cortes de parafina intactas foram grandemente melhoradas.
Abstract
Corte do tecido parafina é amplamente utilizado em histologia e patologia. No entanto, é tedioso. Para melhorar este método, várias empresas comerciais criaram sistemas de transferência de seção complexo usando água fluida. Para simplificar essa tecnologia, criamos um método simples usando equipamento caseiro que combina o corte e flutuando dentro de uma câmara termostática simples; Portanto, as seções entram automaticamente o banho de água na superfície da água. O hipocampo do cérebro do rato adulto, rato adulto rins, cérebro de rato embrionárias e olhos adultos do zebrafish foram cortadas usando parafina convencional de corte e o método apresentado para comparação. Análise estatística mostra que nosso método melhorado poupado tempo e produziu seções de qualidade superiores. Além disso, parafina seccionamento de um espécime em um curto período de tempo é fácil para os operadores Júnior.
Introduction
Estudo morfológico é importante na pesquisa biológica. Apesar de nova tecnologia permitiu que os pesquisadores a observar seus alvos diretamente do tecido inteiro ou organismos1,2,3, cortar a amostra em seções finas, seguiram de coloração, continua a ser o principal morfologia de tecido único método porque mas também proteína alvo diretamente no tecido. Microscopia de luz usa três tipos de seção: parafina, congelada e semithin. Embora cryosectioning é comum para proteger antigenicidade de tecido, e a preparação das amostras é simples, a morfologia do tecido retido é pobre e inadequado para fino corte4,5. Corte de parafina é o método mais frequentemente usado para exibindo morfologia bem preservada. Como os espécimes são desidratados completamente e incorporados em cera, os blocos de parafina podem ser armazenados indefinidamente. Além disso, parafina seccionamento produz seções finas que melhorar o acesso da sonda biológica em novas experiências e reduzem a sobreposição de camadas de célula na direção Z.
No entanto, seccionamento de parafina convencional é tedioso e exige habilidade do operador. Cortes de parafina passam por fixação, desidratação, incorporação, cortando e flutuante. Importante, transferir fitas seção do suporte da faca para o banho de água é necessária mas difícil para os operadores Júnior. Especialmente no ar seco, as fitas da seção torce-se devido à eletricidade estática em são difíceis de se desdobrar na superfície de água morna. Para melhorar a seção qualidade, umedecendo a superfície do tecido exposto entre passes de lâmina micrótomo, refrigerando os blocos de cera por imergindo-os em água gelada, ou levantando a umidade com um umidificador perto do micrótomo é recomendada6,7 . Novos métodos para melhorar a parafina seccionamento incluem híbrido parafina incorporação cryosectioning8e setor comercial transferência sistema assistência9. Embora esses métodos parcialmente melhorar parafina seccionamento velocidade e qualidade, eles fazem o corte muito mais pesado, e sistemas de transferência de seção comercial são caros.
Neste protocolo, demonstramos como criar equipamentos simples, barato e flexível passo a passo, que podem ser conectado à porta de um micrótomo rotativo. Este equipamento é composto de um canal de seção, um banho de água e um aquecedor com um interruptor de deteção de temperatura. Após o corte, dezenas de seções fluem para o canal de seção e insira o banho de água diretamente, assim se desenrola automaticamente. Isto melhora a eficiência de corte de parafina e faz com que esta tecnologia mais conveniente. Usando este método, mais adultas seções hippocampal do rato, seções de rim de rato adulto, embrionárias 15,5 dias de idade (E15.5) do mouse cérebro seções e olho adulto zebrafish seções foram colhidas em menos tempo e manteve-se intacta mais morfologicamente. Esse método também pode ser usado para outras amostras de tecidos que requerem parafina acelerada de corte, evitando a perda de distinção da seção.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso de Universidade de Nanchang e cuidado Animal.
1. montar o equipamento e conectar o micrótomo
- Desenha o parâmetro pelos requisitos (Supplementary Figura 1).
- Submeta o parâmetro para uma fábrica local para fabricar as placas de acrílico.
- Montar todas as peças na sequência: usar clorofórmio para combinar 7 placas de acrílico comerciais em um tanque com um banho de água e canal de seção (Figura 1).
Cuidado: Clorofórmio produz substâncias tóxicas quando encontra luz e oxigênio. Monte o aparelho em uma coifa. - Instale o elemento de aquecimento elétrico tubular através do orifício na placa de acrílico #1 (Figura 2A, ponta de seta).
- Para instalar o controlador de temperatura, criar um pequeno furo na placa de acrílico #2 usando uma furadeira elétrica e instale o detector de temperatura (Figura 2A, seta). Instale um termostato digital do tanque (Figura 2A).
Nota: O detector de temperatura deve ser dentro de 1 cm abaixo da superfície da água. - Para fornecer acesso de potência, ajuste a tensão abaixo de 24 V antes de ligar o equipamento.
- Remova a bandeja de resíduos de corte do micrótomo.
- Vincule o canal de seções com o suporte da lâmina do micrótomo com selante de silicone neutro (Figura 2B).
Nota: Não difamar qualquer selante de silicone neutro acima da parte superior da lâmina para que a lâmina velha é facilmente substituída. - Secar durante a noite para permitir que o clorofórmio e o tempo de selante de silicone neutro para solidificar.
- Instale a lâmina para o suporte da lâmina. Despeje a água do banho-maria (Figura 2). A superfície da água só deve tocar a parte superior da lâmina (Figura 2D, cabeça de seta).
2. parafina seccionamento
Nota: Os restos muitas vezes se acumulam nas bordas superiores ou inferiores do bloco de cera e a superfície da água. Estes restos devem ser limpos regularmente.
-
Execute a parafina convencional seccionamento10.
- Aperta o espécime de parafina em um micrótomo rotativo e coloque a lâmina em um suporte de lâmina.
- Gire o volante e a seção da amostra.
- Transferi a faixa de opções de parafina seccionada para o banho de água morna de 38,5 ° C.
- Peguem que as seções sobre o microscópio deslize da superfície da água após o desdobramento.
- Seca as lâminas em estufa a 42 ° C durante a noite.
-
Corte de parafina melhorada (Figura 3)
- Liga o equipamento.
- Abra o aquecedor com interruptor de deteção da temperatura e defina a temperatura alvo entre 38,0 ° C e 40,0 ° C, durante 1 h com antecedência aquecer a água.
- Modificar o bloco de parafina, adquirido pela incorporação de parafina; Então coloque o bloco de parafina na braçadeira de fita do micrótomo e travá-lo.
Nota: As bordas superiores e inferiores do bloco de parafina devem ser alteradas horizontalmente para evitar que a fita de seção de formando um arco e tornando-se incapaz de fluxo através do canal de seções estreitas. - Abordar rapidamente a amostra por mais espessas seções de corte.
- Ajuste a uma espessura de seção adequada (10 µm por cérebro de rato adulto, rato adulto rins e cérebro de rato embrião, 4 µm para olhos do zebrafish). Gire o volante e as seções entra automaticamente o canal de seções e banho.
- Seção da amostra em um curso de corte de lenta e uniforme (Figura 3A).
Nota: Thethickness da primeira seção serão alterados depois que o volante foi interrompido por alguns minutos. As lâminas descartáveis devem ser substituídas quando as seções tem arranhões consecutivos. - Orientar as seções na câmara de banho para flutuar em uma linha (Figura 3B, 3C).
Nota: Se seção head adere à parede da câmara, utilize um guia de escova para mantê-lo flutuando. - Aderir a seções em corrediças do microscópio. Após as seções totalmente desdobrar-se em banho-Maria, separadas várias seções com uma pinça. Então pegá-las com o banho de água para as lâminas de microscópio (Figura 3D).
Nota: Seções devem ser recolhidas a parte posterior do banho de água, como aqueles no anterior do banho de água e o canal de seções não ainda será totalmente desdobradas. - Seca as lâminas, colocando-os em um forno de 42 ° C durante a noite. Os slides podem ser armazenados à temperatura ambiente por tempo indeterminado.
- Use a coloração de hematoxilina-eosina (HE) por uma questão de avaliação do melhor método8.
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Representative Results
O método melhorado aumentou o número de cortes de parafina intacta. Nós testamos este novo método no tecido hippocampal do rato adulto, rato adulto rins, cérebro de rato embrionárias e olhos do zebrafish. Água foi adicionada ao tanque, e a temperatura da água foi mantida entre 38,0 ° C e 40,0 ° C. Depois de uma série preparar as amostras de tecido, foram seccionados e comparados com corte convencional. O novo método de evitar a perda de seção e aumentou a proporção de seções intactas no hipocampo de rato adulto, rins de rato adulto, E15.5 cérebro de rato e olhos de adultos do zebrafish (Figura 4A4C, 4E, 4G). Em conclusão, nosso método melhorado o corte, evitando a perda de seção e colheita mais seções intactas por espécime.
O melhor método diminuiu o tempo gasto por espécime. Comparando o tempo despendido entre o método convencional e nosso método melhorado, realizamos toda a série de seccionamento (da primeira seção para a última seção de um órgão) sobre o hipocampo de rato adulto, rato adulto rins, cérebro de rato E15.5 e adulto olhos do zebrafish. Os resultados sugerem que o melhor método acelerado a parafina seccionamento velocidade em todas as amostras testadas (Figura 4B4D, 4F, 4 H). Em geral, nosso método permitido para corte rápida de alta qualidade parafina.
Seções de série da retina óptica zebrafish foi observado pela coloração H e E. Para a série de corte do segmento de disco óptico da retina zebrafish, as seções colhidas do método melhorado de eram melhores tem melhor integridade do que aqueles de parafina convencional seccionamento método (Figura 5A, 5B). Não houve nenhuma diferença significativa entre esses dois métodos em relação à qualidade das seções mais colhidas (Figura 5, 5D). Ocasionalmente, a qualidade das seções colhidos pelo método convencional foram relativamente baixo (Figura 5E, 5F).
Figura 1: O processo para a montagem das 7 placas de acrílico comerciais dentro de um tanque. (A) vista de conjunto das 7 placas de acrílico. (B-G) Passo a passo montagem do tanque da placa # 1 a placa #7. (H) tanque principal após a montagem. (I) o tamanho geral do tanque; a membrana protetora na superfície do tanque foi removida para a instalação ainda mais. L = 400 mm, L' = 220 mm, H = 122 mm, W = 200 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O equipamento devidamente montado pronto para uso. Equipamento (A) o intacto após ser conectado ao micrótomo rotativo. Indicação de seta, o detector de temperatura é instalada através do pequeno orifício de furadeira elétrica. Ponta de flecha, o aquecedor (elemento de aquecimento elétrico tubular) é instalada através do orifício na placa #1. (B) a área tracejada amplificada em um, o recurso da conexão entre o suporte da lâmina do micrótomo e o canal de seções. Ponta de flecha, o suporte da lâmina e canal de seções são conectados por selante de silicone neutro. (C) mesmo que B, com a água derramada e lâmina instalada. (D) vista lateral da área tracejada em C. ponta de flecha, a superfície da água está perto da borda da lâmina. VT: transformador de tensão; WB: banho de água; DT: termostato digital; B: lâmina; BH: porta-lâmina; SC: canal de seções. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A parafina melhorada seccionamento processo. As figuras, localizadas no canto inferior esquerdo são as áreas tracejadas amplificadas em A-D respectivamente. Indicações de seta, a primeira seção. (A, A') A seção entra no canal de seções imediatamente e diretamente depois do corte. (B, B') A faixa de seções atravessa a fronteira entre o banho de água e canal de seções. (C, C') As seções flutuam para a parte posterior do banho de água e são totalmente desdobradas. (D, D') As seções são captadas pelo microscópio quando eles atingem a parte posterior do banho de água e são totalmente desdobrados. SC: canal de seções; WB, banho de água. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O método de corte melhorado melhorou a taxa de eficiência e rendimento significativamente para seções de toda a série. A taxa de rendimento igualou a proporção das seções intactas em todas as seções de corte. Dados são mostrados como a média ± SEM e adquiridos pelo mesmo operador. (A, C, E, G) O melhor método impediu a perda de seção do hipocampo rato adulto (91.04 ± 1.429% N = 3, vs 97.63 ± 0.4864% N = 3, p = 0.0120), adult mouse rins (92.30 ± 0.5689% N = 3, vs 95.99 ± 0.7055% N = 3, p = 0.0153), cérebro de rato E15.5 (90.67 ± 1.549%, N = 3 vs 97.01 ± 0.2816%, N = 3, p = 0.0158) e olhos adultos do zebrafish (91.27 ± 0.9734% N = 4 vs 96.32 ± 0.7217% N = 4, p = 0,0059). (B, D, F, H) O melhor método salvou tempo comparado com o método convencional para o hipocampo de rato adulto (126.0 3,606 min vs 79.67 ± 1,856 min, N = 3, p = 0.0003), adult mouse rins (66.67 1,764 min vs 41,33 ± 2,186 min, N = 3, p = 0,0008), E15.5 rato br Ain (99.67 3,480 min vs 52,33 ± 4,333 min, N = 3, p = 0.0010) e olhos adultos do zebrafish (48.00 2,160 min vs 30.75 ± min 1,797, N = 4, p = 0.0009). * P < 0.05, * * P < 0,01, * * * P < 0.005. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: H e E coloração das seções do segmento de disco óptico de olhos adquiriram a partir de métodos convencionais e melhoraram a parafina secionar o zebrafish pelo mesmo operador toda a série são comparados. (A) parafina convencional seccionamento (21 seções). (B) melhoria de parafina corte (24 seções). (C) área tracejada da A6. (D) área tracejada de B7. (E) área tracejada da A17. (F) área tracejada da B19. Asteriscos, as seções com qualidade relativamente pobre. Cabeças de seta, disco óptico; Setas, lágrima grave dos tecidos da retina. Barra de escala = 200 µm (A e B); Barra de escala = 50 µm (C, D, E, F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1: os parâmetros de dimensão das 7 placas de acrílico comerciais. O número representa o comprimento da margem de placa correspondente. Unidades: mm. clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Para melhorar a morfologia de seção de parafina e resolver o problema do desperdício de tempo durante o corte de parafina convencional, criamos uma parafina melhorada método que combina o corte e o desdobramento de seccionamento. Este método de melhoria se baseia em equipamento simples que compreende um canal de seção, um banho de água e um aquecedor com um interruptor de deteção de temperatura. A faixa de opções da seção entra o banho de água através do canal de seção e desenrola-se automaticamente durante o corte. Portanto, esse método melhora a parafina seccionamento de qualidade e eficiência, o que foi verificada por parafina seccionamento do hipocampo de rato adulto, rins de rato adulto, E15.5 cérebro de rato e olhos adultos do zebrafish.
Para evitar a seção de ondulação durante a parafina convencional de corte, foram feitos muitos ajustes, como umedecer a superfície do tecido, o bloco de cera de resfriamento, aumentando a umidade e combinando cryosectioning6,7, - 8; no entanto, estes ajustes fazem parafina seccionamento mais tedioso. Um sistema de transferência de seção comercial que se baseia em água fluida tem tido mais sucesso. Neste sistema, a seção entra em contato com a superfície da água imediatamente após o corte, e o fluxo de água movido a motor elétrico transfere as seções de suporte da lâmina para a inferior de banho de água morna9. Devido ao seu mecanismo, eletricidade estática não inibe o seccionamento, resultando em qualidade melhorada seção. Além disso, como este sistema evita manualmente transferir seções do suporte da lâmina para o banho de água, facilmente danificar seções frágil, também ajuda na aquisição de seções mais finas de alta qualidade.
Com nosso método melhorado, o equipamento simples baseia-se a experiência do sistema de transferência de seção comercial com algumas vantagens. Em primeiro lugar, o equipamento é mais barato, que poderia popularizar este método em laboratórios nas regiões em desenvolvimento e pode complementar o sistema de transferência de seção comercial. Em segundo lugar, a água no equipamento é estática e nunca perturba as seções, tornando-se possível adquirir seções mais finas. Nós consecutivamente seccionado zebrafish olhos de 2 µm de espessura utilizando o método melhorado, e as seções adquiridas foram de qualidade superior. Em terceiro lugar, um tanque de banho de água maior é usado no equipamento, que permita pelo menos 40 seções para desdobrar e flutuar simultaneamente, permitindo que dois operadores a cooperar. Uma pessoa pode cortar a amostra de tecido continuamente e o outro diretamente pode pescar até as seções. Isso reduz o tempo de espera para seções a se desdobrar. Corte sucessivo com um curso de corte uniforme também melhora a qualidade de seção.
A estrutura e aparência dos nossos equipamentos simples requer melhoria. Por exemplo, os componentes, tais como o poder, um aquecedor e um controlador de temperatura, podem ser integrados para tornar este equipamento mais integral e portátil. Além disso, micrótomos rotativos comerciais têm tamanhos diferentes. Para conectar a outros micrótomos, o ângulo e altura deste equipamento devem ser ajustados. Corte de parafina combinada com outras técnicas moleculares é amplamente utilizado em neurobiologia, morfologia do tecido e outras pesquisas campos11,12,13. Potencialmente, este método pode melhorar o exame clínico eficiência14,15 e outros espécimes biológicos, para além dos tipos de três tecido usados aqui.
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Disclosures
Os autores têm uma patente neste dispositivo e declaram sem interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 31400936, 31460260) e a ciência Natural Fundação de Jiangxi província da China (20171BAB215020). Agradecemos também o programa conjunto entre a Universidade de Nanchang e Queen Mary University of London para apoiar este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12 V 200 W) | |||
| Temperature controller(12 V 120 W) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
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