Summary
Her presenterer vi en protokoll for å forbedre parafin snitting. Denne metoden kombinerer kutte og flytende bruker en enkel Termostatiske kammer for å unngå overføringsprosessen kreves av det tradisjonelle metoden. Som et resultat, ble effektiviteten og antall intakt parafinsnitt kraftig forbedret.
Abstract
Skjæring av parafin-embedded vev er mye brukt i histologi og patologi. Men er det kjedelig. For å forbedre denne metoden, har flere kommersielle selskaper utarbeidet komplekse delen transportsystemer med flytende vann. For å forenkle denne teknologien, laget vi en enkel metode bruker hjemmelaget utstyr som kombinerer kutte og flytende innen en enkelt Termostatiske kammer; Derfor inn delene automatisk vannbad på vannflaten. Hippocampus fra voksen mus hjerner, voksen mus nyrer, embryonale musen hjerner og voksen sebrafisk øyne ble skåret med både konvensjonell parafin snitting og presentert metoden for sammenligning. Statistiske analyser viser at vår forbedret metode lagret tid og produsert høyere kvalitet deler. I tillegg er parafin snitting av en hel på kort tid lett for junior operatører.
Introduction
Morfologisk studie er viktig i biologisk forskning. Selv om ny teknologi har tillatt forskere å observere sine mål direkte fra hele vev eller organismer1,2,3, kutte prøven i tynne snitt, etterfulgt av flekker, forblir primært metoden fornot eneste vev morfologi, men også protein målretting direkte i vevet. * Lys bruker tre inndelingstypene: parafin, frossen og semithin. Selv om og kryosnitt er vanlig for å beskytte vev antigenicity og prøven forberedelsene er enkel, er beholdt vev morfologi fattige og uegnet for tynne snitt4,5. Parafin snitting er den mest brukte metoden for utstilling godt bevart morfologi. De er dehydrert helt og innebygd i voks, kan parafinblokkene lagres på ubestemt tid. I tillegg produserer parafin snitting tynne snitt som bedre biologiske sonde tilgang i videre studier og redusere celle lag overlegg i Z-retningen.
Men konvensjonell parafin snitting er kjedelig og krever operatør ferdigheter. Parafinsnitt gjennomgå fiksering, dehydrering, innebygging, skjæring og flytende. Viktigere, er overføre delen bånd fra knivholderen til vannbad nødvendige, men vanskelig for junior operatører. Spesielt i tørr luft, delen bånd vil vri på grunn av statisk elektrisitet og er vanskelig å utfolde seg på varmt vannoverflaten. For å forbedre delen anbefales kvalitet, fukte eksponert vevet overflaten mellom mikrotomen blad passerer, kjøling voks blokkene ved å leve dem i isvann, eller høyne fuktigheten med en luftfukter nær mikrotomen6,7 . Nyere metoder for å forbedre parafin snitting inkluderer hybrid parafin innebygging og kryosnitt8og kommersielle delen overføring system hjelp9. Selv om disse metodene delvis forbedre parafin snitting hastighet og kvalitet, de gjør snitting mye mer tungvint, og transportsystemer for kommersielle delen er dyrt.
Denne protokollen viser vi hvordan å lage enkle, billige og fleksibel utstyr steg for steg, som kan være koblet til holderen over en roterende mikrotom. Utstyret består av en delen kanal, et vannbad og en oppvarmet med temperatur oppdagelsen bryter. Etter klipping, dusinvis av deler strømme inn delen kanalen og angi vannbad på direkte, dermed utspiller seg automatisk. Dette forbedrer effektiviteten av parafin snitting og gjør denne teknologien mer praktisk. Bruker denne metoden, mer voksen mus hippocampus deler, voksen mus nyre deler, embryonale 15.5 dager gamle (E15.5) musen hjernen inndelinger og voksen sebrafisk øye delene ble høstet i mindre tid og forble mer intakt morphologically. Denne metoden kan også brukes for andre vevsprøver som krever akselerert parafin snitting og unngå tap av delen skillet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av Animal Care og bruk komiteen av Nanchang University.
1. samle utstyret og koble mikrotomen
- Utforme parameteren per kravene (utfyllende figur 1).
- Sende parameteren til en lokal fabrikk å produsere akryl styrene.
- Samle alle deler i rekkefølge: bruke kloroform kombinere 7 kommersielle akryl styrene i en tank med delen kanal og vann bad (figur 1).
FORSIKTIG: Kloroform produserer giftige stoffer når den oppfyller lys og oksygen. Montere apparatet i avtrekksvifte. - Installere rørformede elektrisk varme-element gjennom hullet i akryl bord #1 (figur 2A, pilspiss).
- For å installere temperatur kontrolleren, lage et lite hull i #2 akryl styret ved hjelp av en elektrisk drill, og Installer temperatur detektoren (figur 2A, pil). Installere en digitalt termostat på tanken (figur 2A).
Merk: Temperatur detektoren skal være innen 1 cm under vannflaten. - For å gi makt tilgang, justere spenningen under 24 V før du slår på utstyret.
- Fjern avfallsbrettet fra mikrotomen.
- Koble deler kanalen med mikrotomen bladholderen med nøytral silikon tetningsmiddel (figur 2B).
Merk: Ikke smøre en nøytral silikon fugemasse over toppen av bladet slik at gamle bladet erstattes enkelt. - Tørke over natten tillater kloroform og nøytrale silikon fugemasse tid å stivne.
- Installer bladet bladholderen. Hell vann i vannbad (figur 2C). Vannflaten bør bare trykk toppen av bladet (figur 2D, pil leder).
2. parafin snitting
Merk: Rusk ofte akkumuleres på øvre eller nedre kant av voks blokken og vannflaten. Dette rusk skal tømmes regelmessig.
-
Utføre konvensjonell parafin snitting10.
- Fast parafin-embedded prøven på en roterende mikrotom og sett bladet i en bladholderen.
- Bakover og prøven.
- Overføre parafin delt båndet til 38,5 ° C varmt vannbad.
- Plukke opp delene på mikroskopet Skyv vannflaten etter unfolding.
- Tørr lysbildene i en ovn ved 42 ° C over natten.
-
Forbedret parafin snitting (Figur 3)
- Slå på utstyret.
- Åpne ovnen med oppdagelsen temperaturbryteren og målrettet temperaturen 38.0 ° c 40,0 ° c 1t på forhånd å varme opp vannet.
- Endre parafin blokken av parafin innebygging; Deretter plasserer parafin blokken på mikrotomens kassettklemmen og lås den.
Merk: Opphøyd og grenser parafin blokken skal endres vannrett for å hindre delen båndet fra danner en bue og bli ikke kan strømme gjennom smale deler kanalen. - Raskt nærme utvalget av skjæring tykkere deler.
- Justere en egnet snittykkelse (10 µm for voksen mus hjerner, voksen mus nyrer og embryo musen hjerner, 4 µm for sebrafisk øyne). Bakover og delene inn automatisk inndelinger kanalen og bad.
- Delen prøven i langsom og jevn kutte slag (figur 3A).
Merk: Thethickness av den første delen vil endres etter rattet har blitt stoppet i noen minutter. Til engangsbruk bør erstattes når delene har påfølgende riper. - Guide delene i Bad kammeret flyte i en linje (tallet 3B, 3 C).
Merk: Hvis hodet delen fester seg til chamber veggen, bruke en pensel guide for å holde det flytende. - Følge deler på objektglass. Etter delene fullt brette i vannbad, separate flere deler med pinsett. Deretter plukke dem opp fra vannbad på objektglass (figur 3D).
Merk: Deler skal hentes fra bakre av vannbad, som i deler kanalen og det fremre av vannbad ennå ikke fullt ut ufalsede. - Tørr lysbildene ved å plassere dem i en ovn 42 ° C over natten. Lysbildene kan deretter lagres ved romtemperatur på ubestemt tid.
- Bruk Hematoxylin-Eosin (HE) flekker for evaluering av forbedret metode8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forbedret metoden økt antall intakt parafinsnitt. Vi testet denne nye metoden på voksen mus hippocampus vev, voksen mus nyrer, embryonale musen hjerner og sebrafisk øyne. Vannet ble lagt til tanken, og temperaturen ble opprettholdt 38.0 ° c til 40,0 ° C. Etter et serielt forbereder vevsprøver, var de delt og sammenlignet med vanlig snittemetode. Den nye metoden unngått delen tap og økt andelen intakt deler i voksen mus hippocampus, voksen mus nyrene, E15.5 musen hjerner og voksen sebrafisk øyne (figur 4A4 C, 4E, 4 G). Avslutningsvis forbedret vår metode snitting av forhindrer delen tap og høsting mer intakt deler per prøven.
Forbedret metoden redusert tidsbruk per prøven. I sammenligne tiden mellom det tradisjonelle metoden og våre forbedret metode, spilte vi hele-serien snitting (fra den første delen til den siste delen av et organ) på voksen mus hippocampus, voksen mus nyrene, E15.5 musen hjerner og voksen sebrafisk øyne. Resultatene tyder på at metoden forbedret akselerert parafinen snittehastighet i alle testede prøver (figur 4B4 D, 4F, 4 H). Generelt vår metode tillatt for raskere høykvalitets parafin snitting.
Serien deler av sebrafisk fiberoptisk netthinnen ble observert av H og E flekker. Serien snitting av blinde flekk segmentet av sebrafisk netthinnen delene høstet fra forbedret metoden var bedre har bedre integritet enn fra konvensjonelle parafinen snitting metoden (figur 5A, 5B). Det var ingen signifikant forskjell mellom disse to metodene for kvaliteten av mest høstet deler (figur 5C, 5 D). Noen ganger kvaliteten på delene høstet fra det tradisjonelle metoden var relativt lav (figur 5E, 5F).
Figur 1: prosessen for montering 7 kommersielle akryl styrene i en tank. (A) samlet visning av 7 akryl styrene. (B-G) Gradvis montering av tanken fra styret # 1 styret #7. (H) primære tank etter montering. (I) de generelle tankstørrelse; den beskyttende membranen på tanken overflaten var fjernet for videre installasjon. L = 400 mm, L' = 220 mm, H = 122 mm, W = 200 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: riktig montert utstyret brukes. (A) den intakt utstyr etter å ha koblet til roterende mikrotomen. Pil indikasjon, temperatur detektoren installeres gjennom det lille hullet elektrisk drill. Pilen hodet, ovnen (rørformet Elektrisk oppvarming element) installeres gjennom hullet i styret #1. (B) forsterket stiplet området, har funksjon for forbindelsen mellom mikrotomen holderen og deler kanalen. Pilen hodet, bladholderen og deler kanal er forbundet med nøytral silikon fugemasse. (C) samme som B, med vann strømmet og blad installert. (D) Side vise stiplede området i C. pilen hodet, vannflaten ligger blad kanten. VT: spenning transformator; WB: vannbad; DT: digitalt termostat; B: blad; BH: bladholderen; SC: deler kanal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: forbedret parafinen snitting prosessen. Tallene i nedre venstre hjørne er forsterket stiplet områdene i AD. Pilen indikasjoner, den første delen. (, A') Delen inn i inndelinger kanal umiddelbart og direkte etter klipping. (B, B') Deler båndet krysser grensen mellom inndelinger kanal og vann badekaret. (C, C') Delene flyte til bakre av vannbad og er fullt brettet. (D, D') Delene blir plukket opp av microscope skyve når de når bakre av vannbad og er fullt brettet. SC: deler kanalen. WB, vannbad. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: forbedret snitting metoden forbedret effektivitet og gir verdi betydelig for hele-serien deler. Avkastning hastigheten likeverdig andelen intakt inndelinger i alle kutt deler. Dataene vises som den gjennomsnittlig ± SEM og kjøpt av den samme operatøren. (A, C, E, G) Forbedret metoden forhindret delen tap av voksen mus hippocampus (91.04 ± 1.429% N = 3, vs 97.63 ± 0.4864% N = 3, p = 0.0120), voksen mus nyrene (92.30 ± 0.5689% N = 3, vs 95.99 ± 0.7055% N = 3, p = 0.0153), E15.5 musen hjernen (90.67 ± 1.549%, N = 3 vs 97.01 ± 0.2816%, N = 3, p = 0.0158), og voksen sebrafisk øyne (91.27 ± 0.9734% N = 4 vs 96.32 ± 0.7217% N = 4, p = 0.0059). (B, D, F, H) Forbedret metode lagret tid sammenlignet med konvensjonelle metoden for voksen mus hippocampus (126.0 ± 3.606 min vs 79.67 ± 1.856 min, N = 3, p = 0.0003), voksen mus nyrene (66.67 ± 1.764 min vs 41.33 ± 2.186 min, N = 3, p = 0.0008), E15.5 musen br Ain (99.67 ± 3.480 min vs 52.33 ± 4.333 min, N = 3, p = 0.0010), og voksen sebrafisk øyne (48.00 ± 2.160 min vs 30.75 ± 1.797 min, N = 4, p = 0.0009). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0.005. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: H og E farging av hele-serien delene av blinde flekk segmentet av sebrafisk øyne kjøpt fra de konvensjonelle metodene og forbedret parafin snitting av den samme operatøren sammenlignes. (A) konvensjonell parafin snitting (21 seksjoner). (B) forbedret parafinen snitting (24 seksjoner). (C) stiplet området A6. (D) stiplet området B7. (E) stiplet området A17. (F) stiplet området B19. Stjerner avsnittene med relativt dårlig kvalitet. Pilespisser, optisk plate; Piler, alvorlig rive av netthinnen vev. Skala bar = 200 µm (A og B); Skala bar = 50 µm (C, D, E, F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: dimensjonen parameterne for 7 kommersielle akryl styrene. Tallet representerer lengden på tilsvarende styret margin. Enheter: mm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å forbedre parafin delen morfologi og løse problemet med bortkastet tid under konvensjonell parafin snitting, laget vi en forbedret parafin snitting metoden som kombinerer skjæring og unfolding. Denne forbedrede metoden er avhengig av enkel utstyr som består av en delen kanal, et vannbad og en oppvarmet med temperatur oppdagelsen bryter. Delen båndet inn vannbad gjennom delen kanalen og utfolder seg automatisk under sagingen. Derfor forbedrer denne metoden parafin snitting kvalitet og effektivitet, som ble bekreftet av parafin snitting av voksen mus hippocampus, voksen mus nyrene, E15.5 musen hjerner og voksen sebrafisk øyne.
For å unngå delen curling under konvensjonell parafin skjæring, er mange tilpasninger gjort, som myker opp vevet overflaten, kjøling voks blokken, øker fuktigheten og kombinere og kryosnitt6,7, 8; men gjøre disse justeringene parafin skjæring mer kjedelig. Et system for overføring av kommersielle delen som flytende vann har vært mer vellykket. I dette systemet, delen kontakter vannflaten umiddelbart etter klipping og elektrisk motor-drevet vannet bekken overfører delene fra bladholderen til lavere varmt vann bad9. På grunn av dens mekanikk hemmer ikke statisk elektrisitet inndeling, som resulterer i bedre delen kvalitet. I tillegg som dette systemet unngår manuelt overføre deler fra bladholderen til vannbad, hjelper lett skade skjøre deler, den likeledes i å skaffe høy kvalitet tynnere delene.
Med vår forbedrede metoden trekker enkle utstyret på opplevelsen av kommersielle delen overføring systemet med noen fordeler. Først er utstyret billigere, som kunne popularisere denne metoden i laboratorier i utviklingen områder og kan utfylle kommersielle delen overføring systemet. Andre vann i utstyret er statisk og aldri forstyrrer delene, gjør det mulig å få tynnere delene. Vi delt fortløpende sebrafisk øynene til 2 µm tykkelse ved hjelp av forbedret metoden og ervervet delene var av høyere kvalitet. Tredje, brukes en større bad vanntank utstyret, som tillater minst 40 deler å brette og flyter samtidig, slik at to operatører å samarbeide. Én person kan klippe vev prøven kontinuerlig og den andre direkte kan fiske opp snittene. Dette reduserer tiden venter å utfolde seg. Påfølgende kutte med en ensartet kutte strek forbedrer også delen kvalitet.
Strukturen og utseendet på vårt enkle utstyr krever forbedring. For eksempel kan komponentene som makt, en ovn og en temperatur kontroller, integrert for å gjøre dette utstyret mer integrert og bærbare. I tillegg, har kommersiell rotasjonsmikrotomene ulike størrelser. For å koble til andre mikrotomer, skal den vinkelen og høyden av dette utstyret justeres. Parafin snitting kombinert med andre molekylære teknikker er mye brukt i nevrobiologi, vev morfologi og andre forskning felt11,12,13. Denne metoden kan muligens forbedre klinisk inspeksjon effektivitet14,15 og andre biologiske prøver utover hvilke tre vev som er brukt her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har en patent på denne enheten og erklære noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 31400936, 31460260) og den Natural Science Foundation i Jiangxi-provinsen i Kina (20171BAB215020). Vi takker også det felles programmet mellom Nanchang University og Queen Mary University of London for å støtte dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12 V 200 W) | |||
| Temperature controller(12 V 120 W) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
- Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
- Sabaliauskas, N. A., et al.
- Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).
- Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).
