Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at forbedre paraffin skæring. Denne metode kombinerer klippe og flyder ved hjælp af en simpel termostatisk kammer for at undgå overførslen kræves af den konventionelle metode. Som et resultat, blev effektivitet og antallet af intakt paraffinsnit væsentligt forbedret.
Abstract
Skæring af paraffin-embedded væv er meget udbredt i histologi og patologi. Men det er trættende. For at forbedre denne metode, har flere kommercielle virksomheder udtænkt komplekse afsnit overførselssystemer ved hjælp af flydende vand. For at forenkle denne teknologi, lavet vi en enkel metode ved hjælp af hjemmelavet udstyr, der kombinerer klippe og flyder i en enkel termostatisk kammer; derfor angive automatisk afsnittene vandbadet på vandoverfladen. Hippocampus fra voksne mus hjerner, voksen mus nyrer, embryonale mus hjerner og voksen zebrafisk øjne blev skåret, ved hjælp af både konventionelle paraffin afsnitsinddeling og metoden præsenteres for sammenligning. Statistiske analyser viser, at vores forbedrede metode sparet tid og produceret højere kvalitet sektioner. Desuden er paraffin skæring af en hele modellen i en kort tid let for junior operatører.
Introduction
Morfologiske undersøgelsen er vigtig i den biologiske forskning. Selv om ny teknologi har gjort det muligt for forskere at observere deres mål direkte fra hele væv eller organismer1,2,3, skære modellen i tynde sektioner, efterfulgt af farvning, stadig primære metoden fornot eneste væv morfologi men også protein målretning direkte i vævet. Lysmikroskopi bruger tre afsnit typer: paraffin, frosne, og semithin. Selvom cryosectioning er almindelige for at beskytte væv antigenicity, og prøvepræparation er enkel, er opbevarede væv morfologi dårlig og uegnet til tynde skære4,5. Paraffin skæring er den hyppigst anvendte metode for at udstille velbevaret morfologi. Som modellerne er dehydreret helt og indlejret i voks, kan paraffinblokke gemmes på ubestemt tid. Desuden producerer paraffin skæring tynde sektioner, der forbedrer biologiske sonde adgang i yderligere eksperimenter og reducere celle lag overlay i Z retning.
Men konventionelle paraffin skæring er kedelig og kræver operatør dygtighed. Paraffinsnit gennemgå fiksering, dehydrering, integrere, skære og flydende. Vigtigere, er overføre afsnit bånd fra knivholderen til vandbadet nødvendige, men vanskelige for junior operatører. Især i tør luft, afsnit bånd vil twist på grund af statisk elektricitet og er svært at udfolde sig på varmt vandoverfladen. For at forbedre sektionen anbefales kvalitet, fugtning udsatte væv overflade mellem mikrotomen klinge passerer, køling voks blokke af nedsænke dem i isvand, eller hæve fugtighed med en luftfugter i nærheden af mikrotomen6,7 . Nyere metoder til forbedring af paraffin skæring omfatter hybrid paraffin indlejring, cryosectioning8, og kommerciel afdeling overførsel system bistand9. Selv om disse metoder delvist forbedre paraffin skæring hastighed og kvalitet, de gør skæring langt mere besværlige, og kommerciel afdeling overførselssystemer er dyre.
I denne protokol vise vi hvordan du kan oprette enkle, billige og fleksible udstyr skridt, som kan være forbundet med klingeholder af en Rotationsmikrotom. Dette udstyr består af et afsnit kanal, et vandbad og et varmeapparat med en temperatur påvisning switch. Efter opskæring, snesevis af sektioner flyde ind i afsnittet kanal og Indtast vandbad direkte, således udfolder sig automatisk. Dette forbedrer effektiviteten af paraffin skæring og gør denne teknologi mere bekvem. Ved hjælp af denne metode, mere voksen mus hippocampus sektioner, voksen mus nyre sektioner, embryonale 15,5 daggamle (E15.5) mouse hjernen sektioner og voksen zebrafisk øje sektioner var høstet i kortere tid og forblev mere intakt morfologisk. Denne metode kan også bruges til andre vævsprøver, der kræver accelereret paraffin skæring samtidig undgå tab af afsnit skelnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af Animal Care og brug Udvalget af Nanchang Universitet.
1. Saml udstyr og forbinde mikrotomen
- Design parameter pr. krav (tillægs figur 1).
- Indsende parameteren til en lokal fabrik til fremstilling af akryl bestyrelser.
- Saml alle dele i rækkefølge: Brug chloroform for at kombinere 7 kommercielle akryl plader ind i en tank med en sektion kanal og vand bad (figur 1).
Forsigtig: Chloroform producerer giftige stoffer, når det opfylder lys og ilt. Samle apparater i et stinkskab. - Installere den rørformede el-varmelegeme gennem hullet i akryl board #1 (figur 2A, pilespids).
- Installer temperatur controller, oprette et lille hul i #2 akryl bestyrelsen ved hjælp af en elektrisk boremaskine og installere temperatur detektor (figur 2A, pil). Installere en digital termostat på tank (figur 2A).
Bemærk: Temperatur detektoren skal være inden for 1 cm under vandoverfladen. - For at give magt adgang, skal du justere spænding under 24 V før du tænder på udstyr.
- Fjern sektion spildbakken fra mikrotomen.
- Sammenkæde sektioner kanal med klingeholder mikrotom med neutral silikone fugemasse (figur 2B).
Bemærk: Ikke smøre nogen neutral silikonefuge over toppen af vingen, således at den gamle klinge er let udskiftes. - Tørre natten for at tillade chloroform og neutral silikone fugemasse tid til at størkne.
- Installere bladet til klingeholderen. Hæld vand i vandbadet (figur 2 c). Vandoverfladen skal bare røre toppen af vingen (figur 2D, pil hovedet).
2. paraffin skæring
Bemærk: Snavs ophobes ofte på de øverste eller nederste kanter af voks blokere og vandoverfladen. Denne aflejringskegler bør ryddes regelmæssigt.
-
Udføre konventionelle paraffin skæring10.
- Klemme paraffin-embedded-modellen på en Rotationsmikrotom og placere vingen i en klingeholder.
- Drej håndhjulet og afsnit modellen.
- Overføre paraffin sectioned bånd til 38,5 ° C varmt vandbad.
- Pick up sektioner på mikroskopet glide fra vandoverfladen efter udfoldning.
- Tørre dias i en ovn ved 42 ° C natten over.
-
Forbedret paraffin skæring (figur 3)
- Tænd udstyret.
- Åbne varmer med temperaturknappen påvisning og Indstil målrettede temperaturen mellem 38,0 ° C 40.0 ° C i 1 time i forvejen til at opvarme vandet.
- Ændre paraffin blok erhvervet af paraffin indlejring; derefter placere paraffin-blok på af mikrotomet kassetteklemmen og låse den.
Bemærk: De overlegne og underlegne grænser af paraffin blok bør ændres vandret for at forhindre afsnit båndet i danner en bue og blive ude af stand til at flyde gennem den smalle afsnit kanal. - Hurtigt nærme prøven ved at skære tykkere sektioner.
- Tilpasse sig til en egnet snittykkelse (10 µm af voksen mus hjerner, voksen mus nyrer og embryo mus hjerner, 4 µm for zebrafisk øjne). Drej håndhjulet og afsnittene vil automatisk blive indsat sektioner kanal og bad.
- Afsnit modellen i en langsom og ensartet skæring slagtilfælde (figur 3A).
Bemærk: Thethickness af den første del vil blive ændret, når håndhjulet er blevet stoppet for et par minutter. Af envejsklinger bør udskiftes når afsnittene har fortløbende ridser. - Guide afsnittene i Bad kammer at flyde i en linje (figur 3B, 3 C).
Bemærk: Hvis hovedafsnittet overholder kammerets væg, brug en pensel vejledning til at holde det flydende. - Overholde sektioner på objektglas. Efter afsnittene fuldt ud udfolde sig i vandbad, separat flere sektioner med pincet. Derefter samle dem op fra vandbad til objektglas (figur 3D).
Bemærk: Sektioner skal afhentes fra bageste i vandbad, som dem i sektioner kanal og det forreste af vandbadet ikke vil endnu er fuldt udfoldet. - Tørre dias ved at placere dem i en 42 ° C ovnen natten over. Dias kan derefter opbevares ved stuetemperatur på ubestemt tid.
- Bruge hæmatoxylin-Eosin (han) farvning af hensyn til evaluering af forbedret metode8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden forbedret steg antallet af intakt paraffinsnit. Vi testede denne nye metode på voksen mus hippocampus væv, voksen mus nyrer, embryonale mus hjerner og zebrafisk øjne. Vand blev føjet til tanken, og vandtemperaturen blev opretholdt mellem 38,0 ° C til 40.0 ° C. Efter en serie i udarbejdelsen af vævsprøver, var de i snit og i forhold til konventionelle skæring. Den nye metode undgået afsnit tab og øget andelen af intakt sektioner i voksen mus hippocampus, voksen mus nyrerne, E15.5 mus hjerner og voksen zebrafisk øjne (figur 4A4 C, 4E, 4 G). Afslutningsvis, forbedret vores metode skæring ved at forebygge afsnit tab og høst mere intakt sektioner per eksemplar.
Metoden forbedret faldt tidsforbrug pr. eksemplar. Sammenligne den tid, det tager mellem den konventionelle metode og vores forbedrede metode, udførte vi hele-serien skæring (fra den første sektion til den sidste del af et organ) på voksen mus hippocampus, voksen mus nyrerne, E15.5 mus hjerner og voksen zebrafisk øjne. Resultaterne tyder på, at metoden forbedret accelereret paraffin skærehastighed i alle testede prøver (figur 4B4 D, 4F, 4 H). Generelt er vores metode tilladt for hurtigere høj kvalitet paraffin skæring.
Serien sektioner af zebrafisk optic nethinden blev observeret af H og E farvning. For serien skæring af den optiske disk segment af zebrafisk nethinden, afsnittene høstet fra den forbedrede metode var bedre har bedre integritet end dem fra konventionelle paraffin skæring metode (figur 5A, 5B). Der var ingen signifikant forskel mellem disse to metoder vedrørende kvaliteten af mest høstede sektioner (figur 5 c, 5 D). Lejlighedsvis, kvaliteten af sektioner høstet fra den konventionelle metode var relativt lavt (figur 5E, 5F).
Figur 1: proces til at samle de 7 kommercielle akryl plader ind i en tank. (A) samlet visning af 7 akryl bestyrelser. (B-G) Trinvis forsamling af tank fra bestyrelsen # 1 til bestyrelsen #7. (H) primære kampvogn efter forsamling. (I) generelle tank størrelse; den beskyttende membran på tank overfladen var fjernet for yderligere installation. L = 400 mm, L' = 220 mm, H = 122 mm, W = 200 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: korrekt monteret udstyr klar til brug. (A) den intakte udstyr efter at være tilsluttet den Rotationsmikrotom. Pil indikation, temperatur detektoren er installeret gennem det lille hul ved elektrisk boremaskine. Pil hovedet, varmelegeme (tubulær elektrisk varmelegeme) er installeret gennem hullet i brættet #1. (B) den forstærkede stiplede område i en, funktionen af forbindelsen mellem klingeholderen mikrotomen og sektioner kanal. Pil hovedet, klingeholderen og sektioner kanal er forbundet med neutral silikone fugemasse. (C) samme som B, med vandet hældes og bladene er installeret. (D) Side opfattelse af den stiplede område i C. pil hoved, vandoverfladen er tæt på klinge kant. VT: spændingstransformer; WB: vandbad; DT: digital termostat; B: blade; BH: klingeholderen; SC: sektioner kanal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: forbedret paraffin skæring proces. De tal, der er placeret i nederste venstre hjørne er de forstærkede stiplede områder i A-D henholdsvis. Pil indikationer, første sektion. (A, A') Afsnittet ind i sektioner kanal umiddelbart og direkte efter opskæring. (B, B') Sektioner båndet krydser grænsen mellem sektioner kanal og vand bad. (C, C') Afsnittene flyde til bageste af vandbadet og er fuldt udfoldet. (D, D') Sektionerne samles op af objektglas, når de når bageste af vandbadet og er fuldt udfoldet. SC: sektioner kanal; WB, vandbad. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: forbedret skære metoden afskydningsmekanismen effektiviteten og udbyttet væsentligt for hele-serien sektioner. Udbytte rate equaled andelen af intakt sektioner i alle snit sektioner. Data er vist som gennemsnit ± SEM og erhvervet af samme driftsleder. (A, C, E, G) Metoden forbedret forhindret afsnit tab af voksen mus hippocampus (91.04 ± 1.429% N = 3, vs 97.63 ± 0.4864% N = 3, p = 0.0120), voksne mus nyrerne (92.30 ± 0.5689% N = 3, vs 95.99 ± 0.7055% N = 3, p = 0.0153), E15.5 mus hjernen (90,67 ± 1.549%, N = 3 vs 97.01 ± 0.2816%, N = 3, p = 0.0158), og voksen zebrafisk øjne (91.27 ± 0.9734% N = 4 vs 96.32 ± 0.7217% N = 4, p = 0.0059). (B, D, F, H) Forbedret metode gemt tid sammenlignet med den konventionelle metode for voksne mus hippocampus (126.0 ± 3.606 min vs 79.67 ± 1.856 min, N = 3, p = 0,0003), voksne mus nyrerne (66.67 ± 1.764 min vs 41.33 ± 2.186 min, N = 3, p = 0,0008), E15.5 musen br Ain (99.67 ± 3.480 min vs 52,33 ± 4.333 min, N = 3, p = 0.0010), og voksen zebrafisk øjne (48,00 ± 2.160 min vs 30.75 ± 1.797 min, N = 4, p = 0.0009). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,005. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: H og E farvning af sektionerne hele-serie af den optiske disk segment af zebrafisk øjne erhvervet fra de konventionelle metoder og forbedret paraffin skæring af samme driftsleder sammenlignes. (A) konventionelle paraffin skæring (21 sektioner). (B) forbedret paraffin skæring (24 dele). (C) stiplede område af A6. (D) stiplede område af B7. (E) stiplede område af A17. (F) stiplede område af B19. Stjerner, sektioner med relativt dårlig kvalitet. Pilespidser, optiske disk; Pile, svær tåre af retinale væv. Skalalinjen = 200 µm (A og B); Skalalinjen = 50 µm (C, D, E, F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tillægs figur 1: parametrene dimension af de 7 kommercielle akryl boards. Nummeret repræsenterer længden af tilsvarende bestyrelsen margen. Enheder: mm. venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at forbedre paraffin afsnit morfologi og løse problemet med spildtid ved konventionelle paraffin skæring, skabt vi en forbedret paraffin skæring metode, der kombinerer opskæring og udfoldelse. Denne forbedrede metode bygger på enkle udstyr, der består af et afsnit kanal, et vandbad og et varmeapparat med en temperatur påvisning switch. Afsnit bånd ind vandbad gennem afsnit kanal og udfolder sig automatisk mens der skæres. Derfor, denne metode forbedrer paraffin skæring kvalitet og effektivitet, hvilket blev bekræftet af paraffin skæring af voksen mus hippocampus, voksen mus nyrerne, E15.5 mus hjerner og voksen zebrafisk øjne.
For at undgå afsnit curling under konventionelle paraffin skæring, har mange foretaget justeringer, fugtning væv overflade, afkøling voks blokere, øge luftfugtigheden og kombinerer cryosectioning6,7, 8; men disse justeringer gøre paraffin skæring mere kedelig. En kommerciel afdeling overførsel system, der bygger på flydende vand har været mere vellykket. I dette system, afsnittet kontakter vandoverfladen straks efter opskæring og elmotor-drevet vandet strøm overfører afsnittene fra klingeholderen til den lavere varmt vand bad9. Statisk elektricitet hæmmer på grund af dens mekanisme, ikke den skæring, hvilket resulterer i forbedret afsnit kvalitet. Derudover dette system undgår manuelt overføre sektioner fra klingeholderen til vandbadet, hjælper nemt beskadige skrøbelige dele, det også i at erhverve høj kvalitet tyndere sektioner.
Med vores forbedret metode trækker simpelt udstyr på erfaringerne med kommerciel afdeling overførsel system med nogle fordele. Første er udstyr billigere, som kunne popularisere denne metode i laboratorier i udviklingsregioner og kan supplere kommerciel afdeling transfersystem. Andet vand i apparatet er statisk og aldrig forstyrrer sektioner, gør det muligt at erhverve tyndere sektioner. Vi sectioned fortløbende zebrafisk øjne af 2 µm tykkelse ved hjælp af forbedret metode, og de erhvervede sektioner var af højere kvalitet. For det tredje bruges et større vandtank for bad i det udstyr, der tillader mindst 40 sektioner til at udfolde sig og flyde samtidig giver to operatører til at samarbejde. Én person kan skære væv modellen løbende og den anden kan direkte fisk op i afsnit. Dette reducerer den tid, venter på sektioner til at udfolde. Successive skæring med en ensartet opskæring slagtilfælde forbedrer også afsnit kvalitet.
Struktur og udseende af vores simple udstyr kræver forbedring. For eksempel, kan komponenter, såsom magt, et varmeapparat og en temperatur controller, integreres for at gøre dette udstyr mere integrerende og bærbare. Derudover har kommercielle roterende mikrotomer forskellige størrelser. For at oprette forbindelse til andre mikrotomer, bør vinkel og højde af dette udstyr justeres. Paraffin skæring kombineret med andre molekylære teknikker er meget udbredt i neurobiologi, væv morfologi og andre forskning felter11,12,13. Denne metode kan potentielt, forbedre klinisk inspektion effektivitet14,15 og andre biologiske prøver ud over de tre vævstyper bruges her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har patent på denne enhed og erklære nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31400936, 31460260) og Natural Science Foundation i Jiangxi-provinsen of China (20171BAB215020). Vi takker også det fælles program mellem Nanchang Universitet og Queen Mary University of London for at støtte dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12 V 200 W) | |||
| Temperature controller(12 V 120 W) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
- Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
- Sabaliauskas, N. A., et al.
- Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).
- Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).
