Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att förbättra paraffin snittning. Denna metod kombinerar skärning och flytande med en enkel termostatisk kammare för att undvika överföringsprocessen krävs enligt den konventionella metoden. Som ett resultat, förbättrades effektivitet och antalet intakt paraffin avsnitt kraftigt.
Abstract
Snittning av paraffin-inbäddat vävnad används ofta i histologi och patologi. Men är det jobbigt. För att förbättra denna metod, har flera rörelseidkande bolag utarbetat system för överföring av komplexa avsnitt som använder flytande vatten. För att förenkla denna teknik har skapat vi en enkel metod som använder hemmagjord utrustning som kombinerar skärning och flytande inom en enkel termostatisk kammare; därför ange avsnitten automatiskt vattenbadet på vattenytan. Hippocampus från vuxen mus hjärnor, vuxen mus njurar, embryonala mus hjärnor och vuxen zebrafiskar ögon klipptes med både konventionella paraffin snittning och metod för jämförelse. Statistisk analys visar att vår förbättrade metod Sparad tid och producerade högre kvalitet sektioner. Dessutom är det lätt för junior operatörer att paraffin snittning av ett hela exemplar på kort tid.
Introduction
Morfologisk studie är viktigt i den biologiska forskningen. Men ny teknik har gjort det möjligt för forskare att iaktta sina mål direkt från hela vävnad eller organismer1,2,3, skär preparatet i tunnslip, följt av färgning, fortfarande primärt metoden fornot enda vävnad morfologi men även protein som riktar sig direkt i vävnaden. Ljusmikroskopi används tre avsnittstyper: paraffin, frysta och semithin. Även kryosnitt är vanligt för att skydda vävnaden antigenicitet, och preparatet beredningen är enkel, är balanserade vävnad morfologi dålig och olämpliga för tunna snittningen4,5. Snittning av paraffin är den vanligaste metoden för uppvisar väl bevarad morfologi. Som exemplaren är helt uttorkad och inbäddade i vax, kan paraffin blocken lagras på obestämd tid. Dessutom kan producerar paraffin snittning tunnslip som förbättrar biologiska sonden tillgång i ytterligare experiment och minskar cell lager overlay i Z riktning.
Men konventionella paraffin snittning är tröttande och kräver operatören skicklighet. Paraffin avsnitt genomgå fixering, uttorkning, inbäddning, skärning och flytande. Viktigt, är överföra avsnitt band från knivhållaren till vattenbadet nödvändiga men svåra för junior operatörer. Särskilt i torr luft, avsnitt band kommer att vrida på grund av statisk elektricitet och är svåra att veckla upp på varmt vattenytan. För att förbättra avsnittet rekommenderas kvalitet, fukta den exponerade vävnadsytan mellan mikrotomen blade passerar, kylning vax block genom att doppa dem i isvatten, eller höja luftfuktigheten med en luftfuktare nära mikrotomen6,7 . Nyare metoder för att förbättra paraffin snittning inkluderar hybrid paraffin inbäddning, kryosnitt8och kommersiella avsnitt överföring system hjälp9. Även om dessa metoder delvis förbättra paraffin snittning hastighet och kvalitet, de gör snittning mycket mer besvärligt och kommersiella avsnitt överföringssystem är dyra.
I detta protokoll visar vi hur du skapar enkla, Billiga och flexibel utrustning steg för steg, som kan anslutas till bladhållaren av en roterande mikrotom. Utrustningen består av en avsnitt kanal, ett vattenbad och en värmare med en temperatur detektering switch. Efter styckning, dussintals sektioner flöda in kanalen avsnitt och ange vattenbadet direkt, alltså utspelas automatiskt. Detta förbättrar effektiviteten i paraffin snittning och gör denna teknik mer bekvämt. Använda denna metod, mer vuxen mus Hippocampus sektioner, vuxen mus njure sektioner, embryonala 15,5 dagar gamla (E15.5) mus hjärnan sektioner och vuxen zebrafiskar ögat avsnitt var skördas på kortare tid och förblev mer intakt morfologiskt. Denna metod kan också användas för andra vävnadsprover som kräver påskyndade paraffin snittning samtidigt undvika förlust av avsnitt åtskillnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av djur vård och användning kommittén av Nanchang universitet.
1. Montera utrustningen och ansluta mikrotomen
- Design parametern per kraven (tilläggs figur 1).
- Skicka parametern i en lokal fabrik för tillverkning av akryl styrelser.
- Montera alla delar i sekvens: Använd kloroform för att kombinera 7 kommersiella akryl styrelser i en tank med ett avsnitt kanal och vatten bad (figur 1).
FÖRSIKTIGHET: Kloroform producerar giftiga ämnen när det möter ljus och syre. Montera apparaten i ett dragskåp. - Installera tubulär elektriska värmeelement genom hålet i akryl styrelse #1 (figur 2A, pilspets).
- Installera tempereringsaggregatet, skapa ett litet hål på #2 akryl tavlan med en elektrisk borr och installera temperaturdetektorn (figur 2A, pil). Installera en digital termostat på tanken (figur 2A).
Obs: Detektorns temperatur bör vara inom 1 cm under vattenytan. - För att power komma, justera spänningen under 24 V innan du slår på utrustningen.
- Ta bort snittavfallstråget från mikrotomen.
- Länka kanalen sektioner med mikrotomen bladhållaren med neutrala silikon (figur 2B).
Obs: Inte smutskasta någon neutral silikon över toppen av bladet så att gamla bladet är lätta att byta. - Torka över natten så att kloroform och neutrala silikon tätningsmedel tid att stelna.
- Installera bladet till bladhållaren. Häll vattnet i vattenbadet (figur 2 c). Vattenytan ska bara röra toppen av bladet (figur 2D, pil).
2. paraffin snittning
Obs: Skräp ansamlas ofta övre eller nedre kanten på blocket vax och vattenytan. Detta skräp ska rensas regelbundet.
-
Utföra konventionella paraffin snittning10.
- Spänn fast paraffin-inbäddat preparatet på en roterande mikrotom och placera bladet i en bladhållaren.
- Vrid handratten och avsnitt preparatet.
- Transferfolie den paraffin sektioneras till 38,5 ° C varmt vattenbad.
- Plocka upp avsnitten på mikroskopet glida från vattenytan efter utspelas.
- Torka bilder i en ugn vid 42 ° C över natten.
-
Förbättrad paraffin snittning (figur 3)
- Slå på utrustningen.
- Öppna värmaren med temperatur detektering switch och ställa in riktade temperatur mellan 38,0 ° C till 40,0 ° C för 1 h i förväg att värma vattnet.
- Modifiera blocket paraffin som förvärvats av paraffin inbäddning; sedan placera blocket paraffin på mikrotomens kassettklämma och lås.
Obs: Paraffin blocket överlägsna och underlägsna gränser bör ändras horisontellt för att förhindra menyfliken avsnitt från bildar en båge och blir oförmögen att flöda genom den smala sektioner kanalen. - Snabbt närma provet genom att skära tjockare sektioner.
- Justera till en lämplig snittjocklek (10 µm för vuxen mus hjärnor, vuxen mus njurar och embryo mus hjärnor, 4 µm för zebrafiskar ögon). Vrid handratten och avsnitten kommer automatiskt ange sektioner kanal och bad.
- Avsnitt förlagan i en långsam och jämn klippning stroke (figur 3A).
Obs: Denna av det första avsnittet kommer att ändras efter handratten har stoppats i några minuter. Engångsblad bör ersättas när avsnitten har på varandra följande repor. - Guide avsnitten in Bad kammaren att flyta i en linje (figur 3B, 3 C).
Obs: Om head-avsnitt följer kammaren väggen, Använd en borste guide för att hålla den flytande. - Följa sektioner på objektglas. Efter avsnitten fullt veckla upp i vattenbad, separata flera sektioner med pincett. Sedan plocka upp dem från vattenbadet på objektglas (figur 3D).
Obs: Avsnitten ska plockas från den bakre delen av vattenbadet, som de i avsnitt kanalen och den främre på vattenbadet kommer ännu inte fullt Övik. - Torka glasen genom att placera dem i en 42 ° C ugn över natten. Bilderna kan sedan lagras i rumstemperatur på obestämd tid.
- Använd Hematoxylin-Eosin (HE) färgning skull utvärdering av förbättrad metod8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den förbättra metoden ökade antalet intakt paraffin avsnitt. Vi testade denna nya metod på vuxen mus Hippocampus vävnad, vuxen mus njurar, embryonala mus hjärnor och zebrafiskar ögon. Vatten lades till tanken och vattentemperaturen bibehölls mellan 38,0 ° C till 40,0 ° C. Efter ett seriellt förbereder vävnadsproverna, var de sektioneras och jämfört med konventionell snittning. Den nya metoden undvikas avsnitt förlust och ökade andelen intakta sektioner i vuxen mus hippocampus, vuxen mus njurar, E15.5 mus hjärnor och vuxen zebrafiskar ögon (figur 4A4 C, 4E, 4 G). Sammanfattningsvis, förbättrat vår metod snittningen genom att förhindra avsnitt förlust och skörd mer intakt sektioner per exemplar.
Den förbättra metoden minskade tidsåtgång per exemplar. I jämföra tidsåtgången mellan den konventionella metoden och vår förbättrade metod, utfört vi hela-serien snittning (från det första avsnittet att det sista avsnittet av ett organ) på vuxen mus hippocampus, vuxen mus njurar, E15.5 mus hjärnor och vuxen Zebrafiskar ögon. Resultaten tyder på att metoden förbättrade påskyndade paraffinet snittningshastighet i samtliga testade prover (figur 4B4 D, 4F, 4 H). I allmänhet får vår metod för snabbare högkvalitativt paraffin snittning.
Serie avsnitt Sebrafisken fiberoptiska näthinnan observerades av H och E färgning. För serien snittning av synnervspapillen segmentet zebrafiskar näthinnan, avsnitten skördas från metoden förbättrade var bättre har bättre integritet än de från den konventionella paraffin snittning metod (figur 5A, 5B). Det var ingen signifikant skillnad mellan dessa två metoder avseende kvaliteten på mest skördade sektioner (figur 5 c, 5 D). Ibland kan kvaliteten på sektioner som skördats från den konventionella metoden var relativt låga (figur 5E, 5F).
Figur 1: processen för montering i 7 kommersiella akryl styrelserna i en tank. (A) övergripande syn på 7 akryl styrelser. (B-G) Stegvis montering av tanken från styrelsen # 1 till styrelsen #7. (H) primära tank efter montering. (I) allmänna tankstorlek; det skyddande membranet på tank ytan togs bort för ytterligare installation. L = 400 mm, L' = 220 mm, H = 122 mm, B = 200 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: korrekt monterade utrustningen klar för användning. (A) intakt utrustning efter att ha anslutit till rotationsmikrotom. Pilen indikation, temperaturdetektorn installeras genom det lilla hålet som borrmaskin. Pil, värmaren (tubulär elektriska värmeelement) installeras genom hålet i styrelsen #1. (B) förstärkta streckad området i A, inslag i anslutningen mellan mikrotomen bladhållaren och kanalen sektioner. Pil, bladhållaren och sektioner kanal förbinds av neutrala silikon. (C) samma som B, med vattnet hälls och klingan monterad. (D) sidovy av det streckade området i C. pil, vattenytan är nära bladet kanten. VT: spänning transformator; WB: vattenbad; DT: digital termostat; B: blad; BH: bladhållaren; SC: sektioner kanal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: förbättrad paraffinet snittning processen. Siffrorna ligger på det nedre vänstra hörnet är de förstärkta streckad områdena i A-D respektive. Pilen indikationer, det första avsnittet. (En, A') Avsnittet kommer in i sektioner kanal omedelbart och direkt efter skärning. (B, B') Menyfliken sektioner korsar gränsen mellan sektioner kanal och vatten badet. (C, C') Avsnitten flyta till den bakre delen av vattenbad och är fullt Övik. (D, D') Avsnitten plockas upp av objektglas när de når den bakre delen av vattenbad och är fullt Övik. SC: sektioner kanal; WB, vattenbad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: metoden förbättrade kontinuerligt förbättrad effektivitet och avkastning priset avsevärt för hela-serien sektioner. Den avkastning som equaled andelen intakta sektioner i alla skära sektioner. Uppgifterna visas som den medelvärde ± SEM och förvärvats av samma operatör. (A, C, E, G) Metoden förbättrade hindrade avsnitt förlust av vuxen mus hippocampus (91.04 ± 1.429% N = 3, vs 97,63 ± 0.4864% N = 3, p = 0.0120), vuxen mus njurar (92.30 ± 0.5689% N = 3, vs 95.99 ± 0.7055% N = 3, p = 0.0153), E15.5 mus hjärnan (90.67 ± 1,549%, N = 3 vs 97.01 ± 0.2816%, N = 3, p = 0,0158), och vuxen zebrafiskar ögon (91.27 ± 0.9734% N = 4 vs 96,32 ± 0.7217% N = 4, p = 0.0059). (B, D, F, H) Förbättrad metod sparas tiden jämfört med den konventionella metoden för vuxen mus hippocampus (126,0 3.606 min vs 79,67 ± 1.856 min, N = 3, p = 0.0003), vuxen mus njurar (66.67 1.764 min vs 41.33 ± 2,186 min, N = 3, p = 0,0008), E15.5 mus br Ain (99.67 3.480 min vs 52.33 ± 4.333 min, N = 3, p = 0.0010), och vuxen zebrafiskar ögon (48,00 2.160 min vs 30,75 ± 1.797 min, N = 4, p = 0.0009). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,005. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: H och E färgning av avsnitten hela-serien av synnervspapillen segmentet den zebrafiskar ögon förvärvats från konventionella metoder och förbättrad paraffin snittning av samma operatör jämförs. (A) konventionella paraffin snittning (21 avsnitt). (B) förbättrad paraffin snittning (24 avsnitt). (C) streckad området A6. (D) streckad området B7. (E) streckad området A17. (F) streckad området B19. Asterisker, avsnitten med relativt dålig kvalitet. Pilen huvuden, optisk skiva; Pilar, svår tår av näthinnans vävnader. Skalstapeln = 200 µm (A och B); Skalstapeln = 50 µm (C, D, E, F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: parametrarna dimension av 7 kommersiella akryl styrelser. Numret representerar längden på motsvarande styrelsen marginal. Enheter: mm. vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att förbättra paraffin avsnitt morfologi och lösa problemet med bortkastad tid vid konventionella paraffin snittning, skapade vi en förbättrad paraffin snittning metod som kombinerar skärande och utspelas. Denna förbättrade metod bygger på enkel utrustning som består av en avsnitt kanal, ett vattenbad och en värmare med en temperatur detektering switch. Menyfliken avsnitt in vattenbadet genom avsnitt kanalen och utspelar sig automatiskt medan skära. Därför, denna metoden förbättrar paraffin snittning kvalitet och effektivitet, som kontrollerades av paraffin snittning av vuxen mus hippocampus, vuxen mus njurarna, E15.5 mus hjärnor och vuxen zebrafiskar ögon.
För att undvika avsnitt curling under konventionella paraffin snittning, har många justeringar gjorts, som fuktas vävnadsytan, kylning vax blocket, öka luftfuktigheten och kombinera kryosnitt6,7, 8. men gör dessa justeringar paraffin snittning mer tråkiga. Ett system för överföring av kommersiella avsnitt som bygger på flytande vatten har varit mer framgångsrik. I detta system, avsnittet kontakter vattenytan omedelbart efter styckning och elektrisk motor-driven vattenströmmen överför avsnitten från bladhållaren till lägre varmt vatten bad9. På grund av dess mekanism hämmar statisk elektricitet inte den snittning, vilket resulterar i förbättrad avsnitt kvalitet. Dessutom, eftersom detta system undviker manuellt överföra sektioner från bladhållaren till vattenbadet, hjälper lätt skadar ömtåliga sektioner, det också förvärva hög kvalitet tunnare sektioner.
Med vår förbättrade metod bygger enkla utrustningen på erfarenhet av kommersiella avsnitt transfersystemet med vissa fördelar. Första är utrustningen billigare, som kunde popularisera denna metod i laboratorier i utvecklingsregioner och kan komplettera kommersiella avsnitt transfersystemet. Andra vatten i utrustningen är statisk och aldrig stör avsnitten, gör det möjligt att förvärva tunnare sektioner. Vi i följd sektioneras zebrafiskar ögon av 2 µm tjocklek med metoden förbättrade, och avsnitten förvärvade var av högre kvalitet. För det tredje, en större vattentank för bad används i utrustningen, som tillåter minst 40 sektioner att veckla upp och flyta samtidigt, så att två operatörer att samarbeta. En person kan skära vävnaden preparatet kontinuerligt och den andra direkt kan fiska upp avsnitten. Detta minskar den tid som väntar på avsnitt för att veckla upp. Successiva skärning med en enhetlig skärande stroke förbättrar också avsnittet kvalitet.
Struktur och utseende på vår enkla utrustning kräver förbättring. Komponenter, såsom makt, en värmare och en temperatur styrenhet, kan exempelvis integreras för att göra denna utrustning mer integrerad och bärbara. Dessutom har kommersiella rotationsmikrotom olika storlekar. För att ansluta till andra mikrotomer, bör vinkel och höjd av denna utrustning justeras. Paraffin snittning kombinerat med andra molekylära tekniker används ofta i neurobiologi, vävnad morfologi och andra forskning fält11,12,13. Denna metod kan potentiellt förbättra klinisk inspektion effektivitet14,15 och andra biologiska prov utöver de tre vävnadstyper som används här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har patent på den här enheten och deklarera inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (Grant nr 31400936, 31460260) och den naturvetenskapliga grunden av Jiangxi-provinsen i Kina (20171BAB215020). Vi tackar också det gemensamma programmet mellan Nanchang universitet och Queen Mary University of London för att stödja detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000-2 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 64-17-5 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 1330-20-7 | |
| Paraplast | Leica | 39601006 | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica | ||
| Commercial acrylic board | |||
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 67-66-3 | |
| Tubular electric heating element(12 V 200 W) | |||
| Temperature controller(12 V 120 W) | Mingsuo | XH-W3002 | |
| Rotary microtome | Leica | ||
| Neutral silicone sealant | Link the water channel with the microtome knife holder | ||
| Voltage transformer | Dearll | S-250-12 | |
| Disposable blade | Accu-Edge | 4689 | |
| Hematoxylin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Eosin | Baso Diagnostics Inc. | BA-4025 | |
| Microslide | Sail Brand | 7105 | |
| Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid | 10004160 | |
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | |
| Microscope | Carl Zeiss | ||
| Hydrochloric acid | Xilong Chemical | 7647-01-0 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica | ||
| HistoCore Arcadia C - Cold Plate | Leica | ||
| paraffin repellent spray | Thermo Scientific | 9990420 |
References
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R.
- Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
- Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
- Sabaliauskas, N. A., et al.
- Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).
- Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).
