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Chemistry

合成と異なる二硫化接続と μ-コノトキシン PIIIA 異性体の構造決定

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58368
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Pharmaceutical Biochemistry and Bioanalytics, Pharmaceutical Institute, University of Bonn
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

システイン豊富なペプチッドは、二硫化接続に応じて異なる立体構造に折る。個々 のジスルフィド異性体のターゲットを絞った合成は、バッファー酸化が必要な二硫化接続につながるしない場合に必要です。プロトコルを扱う 3 ジスルフィド結合ペプチド、NMR および MS/MS 研究を用いた構造解析の選択的合成。

Abstract

通常にシステインの数が多いを持つペプチド立体構造に関する、二硫化接続によって受けます。こうしてペプチド合成時に不要なジスルフィド結合の形成を避けるために非常に重要な完全に異なるペプチド構造で起因するかもしれないので、結果として生理活性を変更します。ただし、ペプチドの複数のジスルフィド結合の正しい形成がいくつか二硫化接続を作成できるため、従来バッファー酸化プロトコルなど標準的な自己折りたたみメソッドを使用して取得することは困難。このプロトコルは、ターゲットを絞った高品質と量のバッファー酸化を介して合成できない複数のジスルフィド架橋ペプチド合成に必要な高度な戦略を表します。研究では、ターゲットを絞った形で μ-コノトキシン PIIIA のすべての可能な 3 ジスルフィド結合ペプチド異性体の合成のための明確な保護グループ戦略のアプリケーションを示します。ペプチドは、保護グループ戦略定義ジスルフィド結合形成に使用して fmoc 保護基固相ペプチド合成によって準備されます。システインのそれぞれのペアは、トリチル (Trt)、acetamidomethyl (Acm)、 tertと保護されている- とは、すべての酸化ステップ中にそののみ必要なシステインは deprotected リンクを確認するグループのブチル (tBu) を保護します。対象となる合成に加えて分析手法の組み合わせを使用して、正しい折りたたみ目的ペプチド構造の生成を明らかにします。異なる 3 ジスルフィド結合異性体の比較を示し、正確な決定の重要性二硫化接続立体構造の計算および生物学的の解釈のための知識ペプチド異性体の活動。分析の特性には、適応プロトコルによって生成されたそのままのペプチド異性体の部分的に減少およびアルキル化誘導体で行われるタンデム質量分析 (MS/MS) 解析による正確なジスルフィド結合解明が含まれています。さらに、ペプチドの構造は、2次元核磁気共鳴 (NMR) 実験および MS/MS 分析から得られた知識を使用して決定されます。

Introduction

特定の生物学的ターゲット1の強力かつ選択性の高い化合物を表すため生理活性ペプチド医薬品の研究開発での使用は認めです。その生物活性の立体構造は、非常に重要な構造活動関係研究2,3、4を実行するために。別に全体の構造に影響を与える主なアミノ酸シーケンス、二硫化物結束は大幅システイン豊富なペプチッド5の構造を安定させます。複数のジスルフィド架橋ペプチドには、そのシーケンス内の六つのシステインを含む円錐ササから μ PIIIA など conotoxins が含まれます。この高システイン コンテンツ 15 ジスルフィド異性体の形成が可能で理論的に。正しい二硫化接続は非常に重要な生物学的活性6,7 です。しかし、問題が発生は、天然のペプチドとかどうかは、それらの異性体の所有している最高の生物学的活性の 1 つ以上の生理活性構造があるかどうかですか。Μ-conotoxins の場合生物学的ターゲットの電位依存性ナトリウム イオン チャネル、μ PIIIA は特にサブタイプ NaV1.2、Na の最も強力なV1.4 と NaV1.73。

ジスルフィド架橋ペプチドの合成は、さまざまな方法を使用して実現できます。ペプチド内ジスルフィド結合の形成のための最も便利な方法は、いわゆる酸化自己折り畳み方法です。ここでは、まず高分子のサポートから胸の谷間がバッファー システムに酸化を受けた後である固相ペプチド合成を使用して目的の環状ペプチドの線形の前駆体を合成します。還元と酸化型グルタチオン (GSH/GSSG) などのレドックス活性剤がしばしばジスルフィド結合の形成を促進するために追加されます。折り畳み式のバッファーでサポートされている自己の主な欠点は、二硫化物結束は段階的で選択的に形式がないことです。多くの場合 1 つだけ特定のジスルフィド異性体は記載されて、ネイティブのペプチドと比較してこのアプローチ8とその他の多数の異性体を得ることが可能です。Μ PIIIA は既に自己以前の研究3で折り畳み時に異なる 2 つ折り異性体、少なくとも 3 つの結果に示されています。このような異性体混合物の分離は、クロマトグラフィー精製方法9を使用して同じような保持時間のため難しい。特定の異性体のターゲットを絞った合成のため有利です。ジスルフィド結合をで定義された二硫化接続、特別な戦略を持つ異性体が必要な具体的にプロデュースして連続して閉じられます。したがって、個々 のシステインの組み合わせで異なる保護グループを運ぶ線形前駆体高分子担体を合成します。、除去後システイン ペア個別し順次 deprotected、リンク目的二硫化物結束10,11,12,13,を生成する酸化反応で14,15,16. 合成と反応生成物の精製後、適当な分析方法により id とジスルフィド結合接続を確認する必要です。例えば一次アミノ酸シーケンスの解明のため多数の分析方法があります。、MS/MS、二硫化接続の定量は依然としてはるかに少ない調査中。このような複数のジスルフィド結合のペプチドを製品関連不純物の複雑さから離れて (e.g。、二硫化スクランブルから)、サンプルのため準備や作業を解析さらに複雑にすることができます。本稿ではっきりと μ PIIIA 異性体のジスルフィド結合のアイデンティティを明らかにする必要があるさまざまな分析手法の組み合わせの使用を示します。質量分析法とクロマトグラフィー法を組み合わせるし、NMR 分光法に同じサンプルを提供しました。マトリックス支援レーザー desorption/ionization(MALDI) ・ MS/MS 分析の部分還元とヨードアセトアミド誘導トップダウン解析はこのペプチドを用いたジスルフィド結合がわかりました。各異性体の立体構造を得るために 2D NMR 実験を行った。したがって、異なる洗練された分析方法を組み合わせることによって複数のジスルフィド結合ペプチド7ジスルフィド接続および複合体の三次元構造を正しく解明することが可能です。

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Protocol

注: ここで使用されるすべてのアミノ酸は、L 構成。アミノ酸およびアミノ酸誘導体の略語は、iub 秘匿の命名法委員会と生化学命名法に関する IUPAC iub 秘匿合同委員会の勧告に従って使用されました。

1. 固相ペプチド合成 (SPP)

注: は、固相ペプチド合成装置で合成を実行します。ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC NH2 9 fluorenylmethyloxycarbonyl (fmoc 保護) 化学の標準的なプロトコルを使用して一般的な順序の線形ペプチド前駆体の合成を実行します。次の保護されたアミノ酸を適用: Pyr (Boc (tert butyloxycarbonyl))、Arg (Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-スルホニル))、Asn(Trt)、Asp(tBu)、Hyp(tBu)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Gln(Trt)、Glu(tBu)、Trp(Boc)、Tyr(tBu)、Thr(tBu) と彼(Trt)。意図した二硫化接続によると Trt、Acm、またはtBu グループのシステインのペアを保護します。

  1. 準備
    1. Fmoc 保護スケート リンク-アミド樹脂の乾燥 (読み込み: 0.28 ミリ モル/g) 一晩、エアカーテンを使用します。
    2. シンセサイザーのプログラムに必要なペプチド配列 (1 文字コード) を入力します。プログラムすべての個々 の試薬の必要量を計算し、溶剤の量を示します。
    3. プロトコルに従って個々 の試薬 (アミノ酸、HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium ヘキサフルオロリン酸)) の重量を量る、2.4 M (アミノ酸) と 0.6 M (の最終的な集中にジメチルホルムアミド (DMF) にそれらを解消HBTU)、それぞれ。
    4. 異なる試薬を転送 (HBTU、アミノ酸 N-メチルモルホリン (NMM, DMF 中 50%)、ピペリジン (DMF で 20%)、DMF、ジクロロ メタン (DCM)) と対応する血管と固相ペプチド合成装置の適切なラケットに置いて。
    5. 反応カラムに乾燥樹脂の 100 mg を追加し、シンセサイザーのラケットでそれらを置きます。固相ペプチド合成を開始します。
  2. SPP プロトコル (シンセサイザーによって提供される)
    注: プロトコルは、樹脂の 100 mg (読み込み: 0.28 ミリ モル/g) 28 µmol スケールの反応の 1 つの列に追加します。
    1. 樹脂の準備
      1. DMF、DCM の 1400 μ L と DMF の 1400 μ L 2500 μ L で樹脂をすすいでください。
      2. 溶媒を除去するまでに空気と樹脂をフラッシュし、DMF の 2500 μ L で樹脂をすすいでください。
    2. Fmoc 保護グループの保護の胸の谷間
      1. DMF で 20% ピペリジンを追加 (1000 μ L) 樹脂と 6 分待つ樹脂からソリューションを削除します。1.2.2.1 のステップを繰り返します。
      2. DMF (1st 4000 μ L、2nd1400 μ L) で二回リンス、溶媒が除去されるまで、空気と樹脂をフラッシュし、DMF の 2000年 μ L で 2 回すすいでください。
    3. カップリング反応
      1. 別の瓶で次の試薬を混ぜて: HBTU (270 µmol; DMF で 0.6 M 450 μ L 9.6 式)、NMM (568 µmol; 50 %dmf で 125 μ L 20 式)、fmoc 保護アミノ酸 (1.01 モル; DMF で 2.4 M 420 μ L 36 式)。樹脂に混合物を追加し、13 分削除樹脂からソリューションを待ちます。1.2.3.1 のステップを繰り返します。
      2. DMF の 3000 μ L で洗います。DMF の 1400 μ L で 2 回洗浄します。DMF の 2000年 μ L で 2 回洗浄します。
      3. 1.2.2 と 1.2.3 ペプチッド シーケンス中のアミノ酸の数に応じて手順を繰り返します。
    4. 最終的な fmoc 保護の胸の谷間と樹脂の洗浄
      1. DMF で 20% ピペリジンを追加 (1000 μ L) 樹脂と 6 分待つ樹脂からソリューションを削除します。1.2.4.1 のステップを繰り返します。
      2. DMF (1st 4000 μ L、2nd 1400 μ L) で 2 回洗浄し、空気と樹脂をフラッシュします。DCM の 1400 μ L で 4 回 dmf、2000年 μ L で 2 回洗浄し、空気で二回フラッシュします。
  3. 仕事アップ
    1. 列一晩合成が完了したら反応から樹脂を凍結乾燥します。

2. 樹脂 (図 1A) からペプチド胸の谷間

注意: 胸の谷間の中に、Cys(Acm) とシステイン (tBu) を除くすべてのアミノ酸側鎖が deprotected します。プロトコルは、樹脂の 100 mg に適用されます。

  1. 12 ml チューブで凍結乾燥した樹脂を組み合わせるし、氷の上の 0 の ° C に冷却します。
  2. 氷の上、樹脂にスカベン ジャー混合物 (フェノール 0.75 g、0.5 mL thioanisole、0.25 mL エタンジチ準備)、トリフルオロ酢酸 (TFA、水 (H2O) で 95%) 1 mL 150 μ L を追加します。室温で 3 時間ゆっくり揺れを残します。
  3. ガラス釉薬を通して混合物をフィルターし、個別に冷たいジエチル エーテル (ジエチル エーテルの 8-10 mL あたりの胸の谷間の混合物の 1 mL) でいっぱいの濾液を収集します。ペプチドは、白色固体として析出します。
  4. 追加 TFA (H2O、約 1 3 mL で 95%) にフィルター ケーキをすすいでください。
  5. 沈殿物を含んでいる管を閉じると (3400 x g) 1 分の懸濁液を遠心、上清をデカント、8-10 ml の冷たいジエチル エーテルのペレットを洗浄します。この手順を 3 回繰り返します。
  6. ジエチル エーテルの残りのトレースを削除する、ストッパーなし 5 分立っているペレットを残します。Tertの 1 mL の原油製品ペレットを溶解-ブタノール (H2O は 80%)。ペプチド (-80 ° C) を凍結乾燥します。

3. セミ分取高速液体クロマトグラフィー (HPLC) と線形の前駆体の浄化

注: 半分取用逆相 (RP) C18 カラム搭載高速液体クロマトグラフィーによる原油のペプチドを浄化 (5 μ m 粒子径 100 Å の細孔サイズ、250 x 32 mm) と 3.6 mL 注入ループ。0.1% 0.1% (溶離液 A) H2O で TFA のグラジエント システムを使用して、TFA アセトニ トリル (MeCN)/H2O (9:1、溶離液 B)。220 でピークを検出 nm。

  1. 15 mL チューブに粗ペプチドの約 70 mg を追加し、高速液体クロマトグラフィーのサンプル ループ量の固体のペプチドを溶解 (e.g。、3.6 mL)。0.1% の混合物を使用して、TFA MeCN/H2O (1:1)。までの渦は、解散と遠心分離機 (3400 x g) 1 分のためのソリューションを完了します。
  2. 5 mL シリンジでサンプル (3.6 mL) を描画し、空気の泡なしサンプルを注入注入ループ。高速液体クロマトグラフィー システムに挿入します。10 mL/min の流速で 0-50% 溶離液 B 120 分以上の勾配を利用したペプチドの混合物を分離します。
  3. 表示される個々 のチューブの分画を収集します。実行が完了したら、選択した分数に備えて質量分析法 (MS) と高速液体クロマトグラフィー分析 (ステップ 6.1 6.2)。画分を凍結乾燥し、-20 ° C で保存
  4. MS と高速液体クロマトグラフィー分析の後線形ペプチドの純粋な分数を組み合わせて、最初の酸化のサンプルを準備します。

4. 選択ジスルフィド結合形成

  1. 1 st酸化 (図 1B)
    注: 樹脂からペプチド卵割、Cys(Trt)、deprotected、最初のジスルフィド結合を形成するため酸化を受けるその後 2 の無防備なシステイン残余に 。次のプロトコルは、線形の精製ペプチドの 15 mg (2864.5 g/mol; 5.2 µmol 1 式)。
    1. イソプロパノール/H2O 混合物 (1:2; 0.05 mM; 水酸化ナトリウム (NaOH) と調整 pH 8.5) 105 mL に線形ペプチド (15 mg) を溶かし、優しく 12 48 h の基本的な条件の下での空気の揺れのままに。
    2. ヨードアセトアミド (IAA) 誘導体化 (ステップ 6) 高速液体クロマトグラフィーとさん確認最初の橋の形成を介して酸化反応を監視します。
    3. ペプチドをフリーズドライし、2nd酸化さらに精製することがなくそれを使用します。
  2. 2nd酸化 (図 1C)
    注: 2 番目の酸化、Acm で保護されたシステインのおよび第 2 橋の形成によって触媒されますヨウ素。1st酸化後 15 mg のペプチドに適用されるプロトコル (2862.5 g/mol; 5.2 µmol 1 式)
    1. イソプロパノール/H2O/1 M 塩酸 (HCl) 混合物 (80:12.5:7.5) の 105 ml (15 mg; 最終濃度 0.05 mM) ペプチドを溶解します。
    2. メタノール (メタノール) で 0.1 M のヨードの 158 μ L を追加 (15.7 µmol; 3 式) ソリューション。3-52 h、すなわち室温で反応をかき混ぜる。 酸化反応が完了するまで。
    3. ヨードアセトアミド (IAA) 誘導体化 (ステップ 6) 高速液体クロマトグラフィーとさん確認 2 番目のジスルフィド結合の形成を介して酸化反応を監視します。
    4. H2O で 1 M アスコルビン酸溶液 79 μ L の追加によって反作用を停止 (78.8 µmol; 15 式)。反応混合物を凍結乾燥し、3rd酸化粉を使用します。
  3. 3rd酸化 (図 1D)
    注: 最後の酸化つながるtBu で保護されたシステインの脱保護して 3 番目の二硫化物橋の形成。2nd酸化後 15 mg のペプチドに適用されるプロトコル (2718.3 g/mol; 5.5 µmol 1 式)。
    1. TFA の 5.5 ml (15 mg, 最終濃度 1 mM) ペプチドを溶解します。Diphenylsulfoxide の 11.2 mg から成るスカベン ジャーの混合物が含まれています (55 µmol; 10 式)、60.2 アニソールの μ L (0.6 モル; 100 式) と trichloromethylsilane の 97.2 μ L (0.8 mmol; 150 式)。室温で 3-5 h の混合物をかき混ぜなさい。
    2. ヨードアセトアミド (IAA) 誘導体化 (ステップ 6) 高速液体クロマトグラフィーとさん確認 3 番目のジスルフィド結合の形成を介して酸化反応を監視します。
    3. 冷たいジエチル エーテル (0 の ° C、反応液ジエチル エーテルの 8-10 mL あたり 1 mL) を含む管ペプチドを沈殿させます。
    4. (3400 × g、1 分) 懸濁液を遠心、上清をデカント、8-10 ml の冷たいジエチル エーテル (0 ° C) の繰り返し (4 回) のペレットを洗浄します。オンエア (3 分) 乾燥ペレットをしましょう。
    5. 80% tertの 1 mL にペレットを溶解-(H2O) で、ブタノール ペプチドを凍結乾燥し、-20 ° C で保存

5. ペプチド精製

注: セミ分取 C18 カラム装備 RP 高速液体クロマトグラフィーによる酸化ペプチドの浄化 (10 μ m 粒子サイズ、300 Å の細孔サイズ、250 x 22 ミリメートル) と 3.6 mL 注入ループ。0.1% 0.1% (溶離液 A) H2O で TFA のグラジエント システムを使用して、TFA MeCN/H2O (9:1、溶離液 B)。220 でピークを検出 nm。

  1. 15 mL チューブにステップ 4.3.5 から凍結乾燥粗製品の 15 mg を追加します。高速液体クロマトグラフィーのサンプル ループ量の粗製品を溶解 (e.g。、3.6 mL)。0.1% の混合物を使用して、TFA MeCN/H2O (1:1)。までの渦は、解散と遠心分離機 (3400 x g) 1 分のためのソリューションを完了します。
  2. 5 mL シリンジで 3.6 mL 混合物を作成し、空気の泡なしサンプルを注入注入ループ。高速液体クロマトグラフィー システムへの注入を開始します。10 mL/min の流速で 0-50% 溶離液 B 120 分以上の勾配を利用したペプチドの混合物を浄化します。
  3. 表示される個々 のチューブの分画を収集します。実行が完了したら後、は、MS と高速液体クロマトグラフィー分析 (ステップ 6.1 6.2) のため選択した分数を準備します。すべての画分を凍結乾燥し、-20 ° C で保存
  4. 実行が完了したら後、は、MS と高速液体クロマトグラフィー分析 (ステップ 6.1 6.2) のため選択した分数を準備します。すべての画分を凍結乾燥し、-20 ° C で保存

6. ペプチド分析

  1. HPLC 分析
    メモ: C18 カラム装備分析 RP 高速液体クロマトグラフィーによるペプチドの純度の確認 (5 μ m 粒子サイズ、300 Å の細孔サイズ、250 × 4.6 mm) と 500 μ L 注入ループ。0.1% 0.1% (溶離液 A) H2O で TFA のグラジエント システムを使用して、TFA MeCN (溶離液 B) で。220 でピークを検出 nm。
    1. ペプチド画分のサンプルを転送または反応のコントロール、HPLC にバイアルおよび 0.1% の混合物を溶かす MeCN/H2O (1:1、300-500 μ L) で TFA。分析の RP hplc オートサンプラーに HPLC バイアルを配置します。
    2. 各サンプルの 250 μ L を注入します。0.1% 0.1% (溶離液 A) H2O で TFA のグラジエント システムを使用して、TFA MeCN (溶離液 B) で。1.0 mL/min の流量で 10-40% 溶離液 B 30 分以上の勾配を用いたペプチドを浄化します。
  2. MALDI TOF 質量分析法
    注: は、行列としてα- シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を用いた MALDI TOF (飛行時) 質量分析法によるペプチドの id を確認します。
    1. 1.5 mL 遠心チューブにペプチドの可視量を転送し、0.1% の混合物で 37 mM α- シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸溶液 10 μ L に溶解 TFA H2O/MeCN (1:1)。
    2. 渦 10 ソリューション s、鋼地面ターゲットに 2 μ L のサンプルを適用し、サンプルを風乾します。
    3. 測定とペプチド校正基準以下の 6000 g/mol モルの固まりのための反射モードを使用します。
  3. ヨードアセトアミド誘導体化
    注: ヨードアセトアミド チオール基と反応すると、ヨードアセトアミド誘導ペプチドの無料のチオール グループが示されます。したがって、無料のチオール グループがない場合は、1st酸化中に MS による反応制御として機能します。
    1. 1.5 mL 遠心チューブに 10 mM リン酸緩衝 (pH 7.8 0.05 mM; 100 μ L) のペプチドを溶解します。ペプチド ソリューションに 10 mM リン酸バッファー (4 mM) のヨードアセトアミド 100 μ L を追加し、暗闇の中で室温で 2 時間反応を軽く振る。反応混合物を凍結乾燥し、-20 ° C で保存
    2. C18 濃度フィルターのピペット チップを使用し、0% 30% (3 回)、50% (3 回) 80% (3 回) を 10 μ l 添加で先端を条件 (3 回) MeCN H2O (+ 0.1 %tfa)。
    3. 0.1% のステップ 6.3.1 で 1 μ L の試料を溶かし H2O で TFA フィルター ピペット チップにソリューションを追加するとします。ピペットの慎重に上下、ビーズに結合します。H2O ピペット チップからを削除し、0.1% の 10 μ L でフィルター ピペット チップをすすぎ TFA H2o.
    4. 2 μ l 添加 0.1% の H2O/MeCN (1:1)、ペプチドが含まれているビーズの上に (フィルター) を使用せず別のピペット チップで TFA。鋼地面ターゲットに濾液を適用し、サンプルを風乾します。
    5. 0.1% TFA H2O/MeCN (1:1) と地面鋼のサンプルをターゲットとサンプルを空気乾燥の混合物で 37 mM α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸溶液 1 μ L を適用します。
    6. 測定とペプチド校正基準以下の 6000 g/mol モルの固まりのための反射モードを使用します。
  4. アミノ酸分析
    注: 正確なペプチド濃度だけでなく、アミノ酸分析計を用いたペプチドのアミノ酸組成を分析します。
    1. 1.5 mL 遠心チューブに純粋なペプチド (2604 g/mol; 0.04 µmol) の 100 μ g を転送し、6 M 塩酸を 200 μ l 添加の粉溶解します。
    2. ガラス アンプルにソリューションの 200 μ L を転送し、リンス 1.5 mL 遠心チューブを 2 倍の 6 M HCl。 200 μ L でガラス アンプルと同様に洗浄ソリューションを転送します。
    3. ブンゼン バーナーの炎でアンプルの首を加熱して、アンプルを閉じます。アンプルをガラス管に入れます。加水分解の 110 ° C で 24 時間加熱ブロックに配置します。
    4. アンプルを開き、2 mL 遠心チューブにソリューションを転送します。アンプル (3 × 200 μ L) とダブル蒸留 H2O キャップ (3 x 100 μ L) を洗って、遠心チューブにそれを転送します。
    5. 遠心分離機の 60 ° C および回転真空濃縮 210 x g で 6 時間のためのソリューション。サンプル希釈バッファー (200 μ M) の 192 μ L で加水分解し、マイクロ遠心フィルターにソリューションを転送します。
    6. 2300 g と転送濾液 100 μ x、アミノ酸分析のサンプル チューブに 1 分のサンプルを遠心します。アミノ酸分析計にチューブを置き、分析を開始します。アミノ酸標準は校正に使用されます。

7 二硫化接続の・ MS/MS 分析

  1. 部分的な減少およびアルキル化17
    1. 1.2 mL の 0.05 M クエン酸バッファー (pH 3.0; 0.14 mM ペプチド濃度) で純粋なペプチド (2604 g/mol; 0.23 µmol) 600 μ g を溶解の 7.5 mg を含有 tris(2-carboxyethyl) ホスフィン (TCEP; 0.02 M 0.03 ミリ モル)。
    2. 常温混合物をインキュベートし、コントロールのサンプル (100 μ L) 0 分から 30 分に至るまでいくつか反応を取る。
    3. アルキル化バッファーの 300 μ L で 1.5 mL 遠心チューブにサンプルをミックス (0.5 M トリス酢酸; pH 8.0; 2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA); 1.1 M ヨードアセトアミド) 無料チオール グループの carbamidomethylation を行い、反応を停止します。
    4. 10 %tfa (H2O) とストアの 100 μ L を追加して 5 分後に反応を停止ドライアイスのサンプル。6.1.2 のステップで説明されている HPLC サンプルを準備し、注入 400 μ L です (図 2A)。
    5. 0.1% 0.1% (溶離液 A) H2O で TFA のグラジエント システムを使用して、TFA MeCN (溶離液 B) で。アイソクラティック (15 分 10% 溶媒 B) の組み合わせを使用してペプチドを分析し、10-35% 溶離液 B 10 mL/分の流量で 25 分以上の後続のグラデーションが 220 でピークを検出し nm。
    6. 1.5 mL 遠心チューブに分数を収集し、ペプチドをフリーズドライします。(図 2B)
    7. 各画分の少量を (ステップ 7.1.12 で続いて) 酸化フォームの MS/MS 分析 1.5 mL 遠心チューブに転送します。
    8. 0.1% で残りペプチド (10-100 μ g) を溶解 TFA H2O (10-50 μ L) し、10 mM の最終的な TCEP 集中を取得する (H2O) の 100 mM TCEP ソリューションの適切なボリュームを追加。
    9. 37 ° c (図 2C) 1 h の反作用を孵化させなさい。反応混合物を凍結乾燥し、-20 ° C で保存
    10. MS/MS サンプル手順 6.3.2-6.3.5 で説明されているように準備します。
    11. MALDI TOF/TOF 質量分析計で MS/MS 測定を実行します。ペプチドの断片化の MS/MS 蓋 (レーザー誘起腐食) を使用し、2 〜 4 回 carbamidomethylated 種の前駆体の塊を選択します。プロセス データを評価し、MALDI 目的二硫化接続を確認します。

8. NMR 実験と構造解析

  1. 500 μ L H2外径2O の (90: 10) や NMR チューブに混合物を転送で純粋なペプチド製品のディゾルブ約 0.3 2 mg。
  2. NMR 分光計の測定のため、サンプルを準備します。
  3. レコード 2 次元 [1H,1H] - DQF - 居心地の良い (ダブル フィルター量子相関分光) [1H,1H] - 非 (合計相関分光法) [1H,1H] - NOESY (核オーバーハウザー強化分光学) と [1H、13C]-(25pxn-1 異核単一量子コヒーレンス) HSQC スペクトル水抑制を使用して。
  4. 記録されたスペクトルのプロトンの共鳴を割り当て、NOESY スペクトルから atom の割り当てを作成します。ペプチドの異なる原子間上限距離の制約を設定する NOESY スペクトルの強度を比較します。ピーク強度校正のため胚の陽子の強度を使用します。
  5. 構造計算を行い、分子を可視化するコンピュータ プログラムに改良と追加の制約 (図 3) として識別された二硫化接続手順 7 を使用します。
  6. 最低のエネルギーと構造を選択し、分子動力学 (MD) シミュレーションのために使用します。

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Representative Results

μ-コノトキシン PIIIA のジスルフィド架橋 15 の異なる異性を合成して、詳細 (図 1)。ジスルフィド結合は部分的な削減と後続の MS/MS 分析 (図 2) によって識別されます。(図 3) 個々 のペプチドの構造を明らかにする別の異性体の NMR 解析が実行されます。特に、RP 高速液体クロマトグラフィー、フラグメンテーション、NMR 解析の組み合わせは二硫化接続の明白な識別に必要です。

Figure 1
図 1: 保護のグループ戦略を使ってネイティブ μ PIIIA の選択的なジスルフィド結合の形成。(A)樹脂からペプチド胸の谷間の中に Trt で保護されたシステインの難病。(B)最初の二硫化物橋の無防備なシステインの形成。(C)および Acm の二硫化物橋形成システインを保護されています。(D)およびtBu の二硫化物橋形成システインを保護されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2:/タンデム質量分析法によるジスルフィド結合代入の部分還元ワークフロー。(A)部分的な減少およびアルキル化ペプチドの。(B)異なる反応コントロール サンプルの高速液体クロマトグラフィーの浄化。精製した試料の(C)の削減。部分的に carbamidomethylated 種 (途中で 2 つのペプチド) 港/タンデム質量分析によって決定される二硫化接続に関する情報です。この図はヘイメル、P.らからの許可に適応されています。立体配座 μ-コノトキシン PIIIA 異性体再訪: システイン ペアリング ジスルフィド結合の割り当てと構造上の影響。分析化学。90 (5) 3321-3327 (2018 年)。著作権 (2018 年) アメリカ化学会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: シーケンシャルは、徒歩と剛 (左) と柔軟な (右) μ PIIIa 異性体の NMR ソリューション構造。別の異性体の二硫化接続と同様、最低エネルギー 20 構造が表示されます。二乗平均平方根の偏差 (RMSD) 値の比較剛体ペプチドが大抵良い解決 NMR 構造につながることを明らかにします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

Μ PIIIA は、同じアミノ酸配列からジスルフィド結合異性体を選択的に生成する可能性を表すなど、システインに富むペプチドの合成のためここに記載されているメソッド。したがって、fmoc 保護ベース固体等相ペプチド合成18とジスルフィド結合の選択的形成のための定義された保護グループ戦略が使用される16を設立しました。固相ペプチド合成は、自動合成高分子担体 (樹脂) をアミノ酸配列を生成できます。これらのアミノ酸は、樹脂からペプチド胸の谷間に deprotected - 使用するプロトコルによっては、彼らの側鎖に特別な保護グループによってシーケンスの組み立て中に望ましくない副反応から保護されます。この保護は、例えばペプチド鎖内システイン側鎖にも適用されます。、トリチル保護。ただし、acetamidomethyl などtertシステインの個々 のペアのグループ明確な保護-ブチルがこの除去手順を付随して切断されるないです。これらの保護基は、deprotected チオール基のジスルフィド結合を形成することによりその後の酸化を許可する条件下でオフ切断することができます。この方法で六つのシステインを含むペプチドの全 15 ジスルフィド異性体が選択的に形成された7,16をすることができます。制限要因は、目的のジスルフィド架橋ペプチドの収量に高い影響を与える異なる直交保護グループ合成努力の増加の増加する数とします。したがって、選択した場合、以下の特定のみ 1 つまたは 2 つのジスルフィド結合を有する複雑なペプチド酸化自己折り畳み方法確かに可能性がありますより優先されます保護グループ戦略。

ここで、1 つのシステインのペアの Trt グループは、最終的な N 末端アミノ酸 fmoc 保護-難病とペプチド組み立て完了後 TFA のアクションによって削除されます。酸性条件、しかし、そのまま Acm とtBu のシステイン残基の他の 2 つのペアで保護グループ。その後、プロトン化フォームのチオール グループを維持するためにわずかに酸性条件下で分取 HPLC を使って保護されていない 2 つのシステインを含む線形のペプチドの精製を行います。プロトコルは分析 HPLC 及び MS 分析検証の合成に成功し、関心のシステインのペアで Trt の脱保護後最初の酸化ステップを続行します。脱保護のそれ以上のステップと 2 番目と 3 番目のジスルフィド結合の酸化に行われそれぞれ Acm のtBu、適切なプロトコルを使用して同じ方法で確認します。これらの酸化反応は、このように高価な試薬を必要としないソリューションで実行される単純なの湿式化学反応です。デメリットは、しかしは、特定の反応、すなわちします。 異なるシステイン残基の接続がスムーズに続行しないでください、ジスルフィド結合接続をスクランブルの副産物に完全にリード。これらは個々 の酸化反応が完了した後削除されませんので、そのような副産物は粗生成物混合物の蓄積できます。これらのいくつかが実際のペプチド、例えばとして類似の物理化学的性質を持っている。、HPLC 溶出を正しく折られたペプチドの精製のための努力を増加させる。合成・精製は、μ PIIIA の場合と同様に、困難かもしれない、このメソッドが正常に使用することができます、まだ良いマニュアルと観察のスキルが必要です。最後に、それはすべてのペプチッド シーケンスが異なるし、したがって正しい二硫化接続の生成に成功するためには、異なる扱われる可能性がする必要があります。

挑戦的な合成に加えて生成される二硫化物結束が正しいかどうかを確認が不可欠ですすなわち。、それぞれジスルフィド異性体の目的のバージョンを表します。これは本 MALDI MS/MS 解析と NMR 構造解析の組み合わせを使用して実行されます。タンデム質量分析は、異なる部分的に減少およびアルキル化誘導体 (carbamidomethylation) 完全に酸化ペプチド17を使用して実行されます。MALDI MS/MS ふた TOF/TOF スペクトル carbamidomethylated システインの偶数番号は常に発見、すなわち2、4 または 6 回の carbamidomethylated。これは説明できる完全に酸化ペプチドの段階ごとの還元によって以来各機会ジスルフィド結合ごとに 2 つのチオール関数常に減少している (オープン) とその場でヨードアセトアミドを用いたアルキル化します。2 つのシステインのこの carbamidomethylation は MALDI MS/MS スペクトルでそれぞれ検出できるし、ターンでは、これらのシステインがそのままペプチドに従事していたそれぞれジスルフィド結合を指します。たとえば、3 つ二硫化を一連の 4 つの carbamidomethylated システインの発生債での反応時間の間に開かれた 2 つの非-アルキル化のシステイン、間で形成される特定の結合、すなわち 1 つ 1 つを識別するのに役立ちます、他の 2 つの債券を開くための十分な部分還元。したがって、MALDI MS/MS による様々 なペプチド ジスルフィド異性体 2-4 回 carbamidomethylated 誘導体のジスルフィド結合接続を完全に解明し、確認することができます。

ジスルフィド結合パターンを明らかにするもう一つの可能性は、ペプチドが生より小さいフラグメントを生成する異なるアミノ酸に裂かれる、酵素によって消化ペプチドの MS/MS 分析です。これらの短い断片は二硫化物パターン、これらのリンクのフラグメントの MS/MS 分析から解明されうるという理由であるジスルフィド結合を介してもリンクできます。Μ-PIIIA の場合ただし、この戦略適用できませんでしたのでシーケンスのいくつかのシステインが互いに隣接して直接、したがって、ペプチドの消化は、互いからのシステインは区別がありません。特定の二硫化物橋の同定困難です。

この知識特定陽子、すなわち核オーバーハウザー効果 (NOE) の割り当てを可能にするため知られている二硫化接続の場合明らかにその 2次元 NMR による構造解明を容易します, 空間的に言及。NOESY 信号 (空間を通して NMR 実験) の強度から決まる 2 つの原子間の距離。分析は、しかし、この方法では、居心地の良い、非、NOESY スペクトルに適用されるシーケンシャル徒歩19から始まります、アミノ酸 (スピン系) シーケンス内の対応する H 原子に特定の信号を割り当てることができます。NOESY 実験から前述の距離制限は、ペプチド7の構造計算で使用されます。識別されるより多くの信号より正確な構造になります。ただし、この割り当ての難しさ増加ペプチド中のアミノ酸の数と隣接するシステインの発生確率増加いくつかの原子の信号が重なり、もはや正確に指定できるに閉鎖近接。さらに、ペプチド鎖の柔軟性は、NMR の信号を簡単にまたはほとんどを特定できるかどうかのために決定的です。柔軟なペプチド領域より変化が発生していることです、同じ原子に対して取得される複数の信号。したがって、バック グラウンド ノイズに消滅する信号を引き起こすコンフォメーションの数と強度が低下します。これは NMR による立体構造解明がシーケンスは、エピガロカテキンやすくなることを意味します。

最後に、このプロトコルの場合、MALDI MS/MS 分析と併用 2次元 nmr による構造解明7によってジスルフィド結合形成を監視することによって複数のジスルフィド架橋ペプチドを生成することが可能になります。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

A. Resemann、f. j. マイヤー、ブルカー ・ ダルトニクス社ブレーメン; から + Suckau に感謝したいと思いますD. 人、A. A. 人、v. シュミッツ ・、ダルムシュタット工科大学; C. シールFLI イエナ、ボン大学から m. Engeser から o. OhlenschlägerK. Kramer、A. Harzen およびマックス ・ プランク植物育種研究、ケルン; から H. 中頭ケルン; 動物学研究所からスザンヌ Neupertブランクフルトの大学の生体磁気共鳴分光設備技術のサポート、トレーニング、および楽器へのアクセスします。直噴にボン大学による財政援助は感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin Varian, Inc. PL3867-3764 AmphiSpheres 40 RAM
Pyr(Boc) Bachem A-3850
Arg(Pbf) Iris Biotech FSC1010
Asn(Trt) Bachem B-1785
Asp(tBu) Iris Biotech FSP1020
Hyp(tBu) Iris Biotech FAA1627
Lys(Boc) Bachem B-1080
Ser(tBu) Iris Biotech FSC1190
Gln(Trt) Iris Biotech FSC1043
Glu(tBu) Iris Biotech FSP1045
Trp(Boc) Iris Biotech FSC1225
Tyr(tBu) Sigma Aldrich 47623
Thr(tBu) Iris Biotech FSP1210
His(Trt) Iris Biotech FDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat Sigma Aldrich 8510060 Flammable
DMF Fisher Scientific D119 Flammable, Toxic
DCM Fisher Scientific D37 Carcinogenic
Piperidine Alfa Aesar A12442 Flammable, Toxic, Corrosive
N-Methyl-Morpholin Sigma Aldrich 224286
Cys(Acm) Iris Biotech FAA1506
Cys(Trt) Bachem E-2495
Cys(tBu) Bachem B-1220
trifluoruacetic acid Sigma Aldrich 74564 Toxic, Corrosive
phenol Merck 1002060 Toxic
thioanisol Alfa Aesar A14846
ethanedithiol Fluka Analytical 2390
diethyl ether VWR 100,921 Flammable
tert-butanol Alfa Aesar L12338 Flammable
acetonitrile Fisher Scientific A998 Flammable
water Fisher Scientific W5
isopropanol VWR ACRO42383 Flammable
sodium hydroxide AppliChem A6579,1000 Corrosive
iodoacetamide Sigma Aldrich I6125
iodine Sigma Aldrich I0385
Hydrochloric acid Merck 110165 Corrosive
ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
diphenylsulfoxide Sigma Aldrich P35405
anisol Sigma Aldrich 96109 Flammable
trichloromethylsilane Sigma Aldrich M85301 Flammable
sample dilution buffer Laborservice Onken
sodium dihydrogen phosphate Sigma Aldrich 106370
disodium hydrogen phosphate Sigma Aldrich 795410
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706
citric acid Sigma Aldrich 251275
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
tris-acetate Carl Roth,  7125
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E26282 
peptide calibration standard II Bruker Daltonics GmbH 8222570
Name of Equipment Company
solid-phase peptide synthesizer Intavis Bioanalytical Instruments AG EPS 221
lyophilizer  Martin Christ GmbH  Alpha 1-2 Ldplus
semipreparative HPLC Jasco system PV-987
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) Knauer 25QE181E2J purification of the linear peptide
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) Hichrom-VWR HICH218TP1022 purification of the oxidized peptide
analytical HPLC  Shimadzu system LC-20AD
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm)  Hichrom-VWR HICH218TP54 analytical column
ground steel target (MTP 384) Bruker Daltonics GmbH NC0910436 MALDI preparation 
C18-concentration filter (ZipTip) Merck KGaA ZTC18S096 MALDI preparation 
MALDI mass spectrometer Bruker Daltonics GmbH ultraflex III TOF/TOF
amino acid analyzer Eppendorf-Biotronik GmbH LC 3000 system
NMR spectrometer Bruker Avance III Bruker Daltonics GmbH Bruker Avance III 600 MHz
computer program for molecular visualising YASARA Biosciences GmbH Yasara structures NMR structure calculation
computer program for MALDI data evaluation  Bruker Daltonics GmbH flexAnalysis, BioTools MS/MS fragmentation
analog vortex mixer VWR VM 3000
Microcentrifuge Eppendorf 5410
Centrifuge Hettich EBA 20
Rotational vacuum concentrator Christ 2-18 Cdplus
Analytical Balance A&D Instruments GR-202-EC

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References

  1. Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
  2. Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  3. Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
  4. Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
  5. Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
  6. Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
  7. Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
  8. Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).
  9. Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
  10. Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
  11. Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
  12. Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
  13. Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
  14. Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
  15. Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
  16. Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
  17. Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
  18. Kates, S. A., Albericio, F. Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , Marcel Dekker Inc. New York. (2000).
  19. Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).

Tags

化学、問題 140、ペプチド、システインに富む二硫化接続、合成、保護グループ戦略、構造解析、2次元 NMR (核磁気共鳴)、MS/MS (タンデム質量分析法)

Erratum

Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for:Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.

Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

to:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

Step 1.2 in the Protocol section was updated from:

NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.

to:

NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.

Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:

HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).

to:

HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).

The first item in the Materials table was updated from:

Fmoc Rink amide resin Novabiochem 855001

to:

PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin Varian, Inc. PL3867-3764 AmphiSpheres 40 RAM
合成と異なる二硫化接続と μ-コノトキシン PIIIA 異性体の構造決定
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Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, C. A., Imhof, D. Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. J. Vis. Exp. (140), e58368, doi:10.3791/58368 (2018).

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