Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Syntes och strukturbestämning av µ-Conotoxin PIIIA isomerer med olika disulfid Connectivities

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58368
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Pharmaceutical Biochemistry and Bioanalytics, Pharmaceutical Institute, University of Bonn
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Cystein-rika peptider vik distinkta tredimensionella strukturer beroende på deras disulfid anslutning. Riktade syntes av enskilda disulfid isomerer krävs när bufferten oxidation inte leder till önskad disulfid anslutning. Protokollet behandlar selektiv syntesen av 3-disulfid-bundna peptider och deras strukturella analys med hjälp av NMR- och MS/MS studier.

Abstract

Peptider med ett stort antal cysteines påverkas vanligtvis angående tredimensionella strukturen av deras disulfid anslutning. Det är alltså mycket viktigt att undvika oönskad disulfide bond bildas under peptid syntes, eftersom det kan resultera i en helt annan peptid struktur, och följaktligen ändras bioaktivitet. Rätt bildandet av flera disulfide obligationer i en peptid är dock svårt att få med hjälp av egna fällbara standardmetoder som konventionella buffert oxidation protokoll, eftersom flera disulfid connectivities kan bildas. Detta protokoll representerar en avancerad strategi som krävs för riktade syntes av flera disulfid-bridged peptider som inte kan syntetiseras via buffert oxidation i hög kvalitet och kvantitet. Studien visar tillämpningen av en distinkt skydda koncernens strategi för syntesen av alla möjliga 3-disulfid-bundna peptid isomerer av µ-conotoxin PIIIA på ett målinriktat sätt. Peptiderna är beredda genom Fmoc-baserade fasta fasen peptid syntes med en skyddande koncernstrategi för definierade disulfide bond bildandet. Respektive parar av cysteines skyddas med trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) och tert-butyl (tBu) skydda grupper för att kontrollera att endast de nödvändiga cysteines under varje oxidation steg är deprotected och länkade. Utöver riktade syntesen används en kombination av flera analysmetoder att klargöra rätt vikning och generation av önskad peptid strukturerna. Jämförelse av de olika 3-disulfid-bundna isomererna indikerar vikten av noggrann bestämning och kunskap om disulfid anslutning för beräkningen av den tredimensionella strukturen och för tolkning av biologiskt aktivitet av de peptid isomererna. Analytiska karakterisering innehåller den exakta disulfide bond klarlägga via tandem masspektrometri (MS/MS) analys som utförs med delvis nedsatt och alkylerade derivat av intakt peptid isomeren produceras av ett anpassat protokoll. Dessutom bestäms strukturerna som peptiden med 2D kärnmagnetisk resonans (NMR) experiment och den kunskap som erhållits från MS/MS-analys.

Introduction

Användning av bioaktiva peptider i farmaceutisk forskning och utveckling redovisas mycket, eftersom de representerar potent och mycket selektiv föreningar för specifika biologiska mål1. För deras bioaktivitet är tredimensionella struktur dock av stor betydelse för att kunna utföra struktur-aktivitetssamband relation studier2,3,4. Förutom den primära aminosyrasekvens som påverkar totala konformation, stabilisera disulfide obligationer avsevärt strukturen av cystein-rika peptider5. Flera disulfid-bridged peptider inkluderar conotoxins såsom µ-PIIIA från Conus purpurascens som innehåller sex cysteines i dess sekvens. Detta höga cystein innehåll kan teoretiskt bildandet av 15 disulfid isomerer. Den rätta disulfid connectivity är mycket viktigt för biologisk aktivitet6,7. Frågan är dock om det finns mer än en bioaktiva konformation av naturligt förekommande peptider och om så, vilken av dessa isomerer äger den högsta biologiska aktiviteten? När det gäller µ-conotoxins, de biologiska målen är spänningskänsliga natriumkanaler jonkanaler och µ-PIIIA i synnerhet är mest potenta för subtyper NaV1.2, NaV1.4 och NaV1,73.

Syntesen av disulfid-bridged peptider kan uppnås med olika metoder. Den mest praktiska metoden för bildandet av disulfide obligationer inom en peptid är den så kallade oxidativa själv fällbara metoden. Här, syntetiseras linjär föregångaren till den önskade cyklisk peptiden först använda fasta fasen peptid syntes, som är efter klyvning av Polymera stöd utsätts för oxidation i ett buffertsystem. Redox-aktiva ämnen såsom minskad och oxiderade glutation (GSH/GSSG) läggs ofta för att främja bildandet av disulfide obligationer. Den största nackdelen med buffert-stödda själv vikning är att de disulfide obligationerna inte bildas selektivt i en stegvis sätt. Jämfört med de infödda peptid, som ofta beskrivs endast en specifik disulfid isomer, är det möjligt att få många andra isomerer med denna metod8. µ-PIIIA har redan visat sig resultera i minst tre olika vikta isomerer vid själv vika i en tidigare studie3. Separation av sådan en isomer blandning är ganska svårt på grund av liknande retentionstiderna om använder kromatografisk rening metoder9. Riktade syntesen av en specifik isomeren är därför en fördel. Att specifikt producera en isomer med definierade disulfid anslutning, en särskild strategi krävs i som disulfide obligationer stängt successivt. Därför syntetiseras linjär föregångare bär distinkta skydda grupper på individuella cystein paren med polymer-stöd. Efter eliminering, cystein paren är individuellt och successivt deprotected och kopplade i ett oxidationsreaktionen ge önskad disulfide obligationer10,11,12,13, 14 , 15 , 16. efter syntesen och rening av reaktionsprodukten, det krävs att bekräfta identitet och disulfid anslutning av lämpliga analysmetoder. Det finns många analysmetoder för förtydligandet av den primära aminosyrasekvensen, t.ex., MS/MS, medan fastställandet av disulfid anslutning är fortfarande mycket mindre undersökta. Bortsett från komplexiteten i sådana flera disulfid-bundna peptider, produktrelaterade föroreningar (t.ex., från disulfid scrambling), på grund av prov förberedelse och arbete-up kan ytterligare komplicera analysen. I detta papper visar vi att användningen av en kombination av olika analysmetoder är nödvändigt att entydigt klargöra identiteten på de disulfide obligationerna i de µ-PIIIA isomererna. Vi har kombinerat kromatografiska metoder med masspektrometri och gett de samma proverna till NMR spektroskopi. Matrix-assisted laser desorption/ionization(MALDI) MS/MS-analys identifierade vi de disulfide obligationerna med partiell minskning och iodoacetamide derivatisering eftersom top-down-analys inte är möjligt för denna peptid. 2D NMR experiment utfördes för att erhålla en tredimensionell struktur för varje isomer. Således, genom att kombinera olika sofistikerade analysmetoder, det är möjligt att belysa ordentligt disulfid connectivity och tredimensionella strukturen på komplex flera disulfid-bundna peptider7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: Alla aminosyror som används häri var i L-konfigurationen. Förkortningarna av aminosyror och amino syra derivat användes enligt rekommendationerna från den nomenklatur kommittén av IUB och IUPAC-IUB gemensamma kommissionen på biokemisk nomenklatur.

1. fasta fasen peptidsyntesen (SPPS)

Obs: Utför syntesen med en fasta fasen peptid synthesizer. Utföra syntesen av linjära peptid prekursorer av allmänna sekvens ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 använder ett standardprotokoll för 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) kemi. Tillämpa följande skyddade aminosyror: Pyr (Boc (tert-butyloxycarbonyl)), Arg (Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl)), Asn(Trt), Asp(tBu), Hyp(tBu), Lys(Boc), Ser(tBu), Gln(Trt), Glu(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), Thr(tBu) och hans (Trt). Skydda cystein paren med Trt-, Acm- eller tBu-grupper enligt den avsedda disulfid connectivity.

  1. Beredning
    1. Torka Fmoc Rink-amide kådan (lastning: 0.28 mmol/g) använder en lyophilizer över natten.
    2. Ange önskad peptid sekvensen (kod 1-bokstäver) i programmet av syntet. Programmet beräknar det erforderliga beloppet för varje enskild reagens och anger kvantiteterna som lösningsmedel.
    3. Väger de enskilda reagenserna (aminosyror, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorofosfat)) enligt protokollet och lös upp dem i dimetylformamid (DMF) till en slutkoncentration av 2,4 M (aminosyror) och 0,6 M ( HBTU), respektive.
    4. Överföra de olika reagenserna (aminosyror, HBTU, N-methylmorpholine (NMM, 50% i DMF), Piperidin (20% i DMF), DMF, diklormetan (DCM)) till motsvarande fartyg och placera dem i lämplig tennisracketar av den fasta fas peptid synthesizer.
    5. Lägga till 100 mg torr kåda i kolumnerna reaktion och sätta dem i racketen av syntet. Starta den fasta fasen peptidsyntesen.
  2. SPPS-protokoll (tillhandahålls av synthesizer)
    Observera: Protokollet gäller för 100 mg av harts (lastning: 0.28 mmol/g) tillsätts en reaktion kolumn för 28 µmol skala.
    1. Beredning av kådan
      1. Skölj kådan med 2500 µL av DMF, 1400 µL av DCM och 1400 µL av DMF.
      2. Skölj kådan med luft tills lösningsmedlet avlägsnas och skölj kådan med 2500 µL av DMF.
    2. Klyvning av den Fmoc skydda gruppen
      1. Lägg till 20% Piperidin i DMF (1000 µL) till harts och vänta på 6 min. ta bort lösningen från kådan. Upprepa steg 1.2.2.1.
      2. Skölj två gånger med DMF (1st 4000 µL, 2nd1400 µL), skölj kådan med luft tills lösningsmedlet avlägsnas och skölj två gånger med 2000 µL av DMF.
    3. Koppling reaktion
      1. Blanda följande reagenser i en separat injektionsflaska: HBTU (450 µL; 0,6 M i DMF; 270 µmol; 9,6 ekv.), NMM (125 µL; 50% i DMF; 568 µmol; 20 ekv.), Fmoc-amino syra (420 µL; 2,4 M i DMF; 1,01 mmol; 36 ekv.). Tillsätt blandningen till harts och vänta 13 min. ta bort lösningen från kådan. Upprepa steg 1.2.3.1.
      2. Tvätta med 3000 µL av DMF. Tvätta två gånger med 1400 µL av DMF. Tvätta två gånger med 2000 µL av DMF.
      3. Upprepa steg 1.2.2 och 1.2.3 beroende på antalet aminosyror i sekvensen peptid.
    4. Sista Fmoc klyvning och harts tvätta
      1. Lägg till 20% Piperidin i DMF (1000 µL) till harts och vänta på 6 min. ta bort lösningen från kådan. Upprepa steg 1.2.4.1.
      2. Skölj två gånger med DMF (1st 4000 µL, 2nd 1400 µL) och spola kådan med luft. Skölj två gånger med 2000 µL av DMF, 4 gånger med 1400 µL av DCM och spola två gånger med luft.
  3. Upparbetning
    1. Lyophilize kådan från reaktionen kolumner över natten efter syntesen är klar.

2. peptid klyvning från kådan (figur 1A)

Obs: Under förfarandet för klyvning, kommer alla aminosyra sida kedjor utom Cys(Acm) och Cys (tBu) vara deprotected. Protokollet gäller för 100 mg av harts.

  1. Kombinera den frystorkade hartset i en 12 ml tub och kyla den till 0 ° C på is.
  2. Tillsätt 150 µL av en gatsopare blandning (beredd från 0,75 g fenol, 0,5 mL thioanisole, 0,25 mL ethanedithiol) och 1 mL trifluorättiksyra (TFA, 95% i vatten (H2O)) på is till harts. Lämna försiktigt skaka för 3 h i rumstemperatur.
  3. Filtrera blandningen genom en fritta och samla upp filtratet i rören individuellt fylld med iskall dietyleter (1 mL av klyvning blandningen per 8-10 mL dietyleter). Peptiden fällningar som en vit solid.
  4. Skölj filtret kakan med ytterligare TFA (95% i H2O, ca 1-3 mL).
  5. Nära rören som innehåller fällningen och centrifugera (3400 x g) suspensioner för 1 min, Dekantera supernatanten och tvätta pellets med 8-10 mL iskallt dietyleter. Upprepa detta 3 gånger.
  6. Lämna pellets står utan propp för 5 min att ta bort spår av dietyleter. Lös upp rå produkt pellets i 1 mL tert-butanol (80% i H2O). Kaseinbanden peptiderna (-80 ° C).

3. rening av linjära föregångaren med semi preparativ högpresterande vätskekromatografi (HPLC)

Obs: Rena råa peptiderna genom semi preparativ med omvänd fas (RP) HPLC utrustad med en C18 kolumn (5 µm partikelstorlek, 100 Å porstorlek, 250 x 32 mm) och en 3,6 mL injektionsslinga. Använda en gradient eluering system av 0,1% transfettsyror i H2O (Elueringslösning A) och 0,1% transfettsyror i acetonitril (MeCN) h2O (9:1, elueringslösning B). Upptäcka topparna på 220 nm.

  1. Lägga till ca 70 mg av rå peptiden i en 15 mL tub och upplösa solid peptiden i volymen av HPLC prov slingan (t.ex., 3,6 mL). Använd en blandning av 0,1% transfettsyror i MeCN/H2O (1:1). Vortex tills fullständig upplösning och centrifugera (3400 x g) lösningen för 1 min.
  2. Rita upp provet (3,6 mL) i en 5 mL spruta och injicera injektionsslinga provet utan eventuella luftbubblor. Injicera i HPLC systemet. Separata peptid blandningen med en gradient av 0-50% elueringslösning B över 120 min med en flödeshastighet av 10 mL/min.
  3. Samla fraktionerna i enskilda rör som de visas. När körningen är klar, förbereda valda fraktioner för masspektrometri (MS) och HPLC analys (steg 6.1-6.2). Kaseinbanden fraktioner och lagra dem vid-20 ° C.
  4. Efter MS och HPLC analys, kombinera de rena fraktionerna av linjära peptid och bereda proverna för första oxidationen.

4. selektiv bildandet av Disulfide obligationer

  1. 1 st Oxidation (figur 1B)
    Obs: Under peptid klyvning från kådan, Cys(Trt) är deprotected, leder till två oskyddade Cys-rester som genomgår därefter oxidation bildar den första disulfide bond. Följande protokoll gäller till 15 mg av linjära renat peptid (2864.5 g/mol; 5,2 µmol; 1 ekv.).
    1. Lös den linjära peptiden (15 mg) i 105 mL en isopropanol/H2O-blandning (1:2; 0,05 mM; pH 8,5 justeras med natriumhydroxid (NaOH)) och lämna försiktigt skaka i luften under grundförutsättningarna för 12-48 h.
    2. Övervaka oxidationsreaktionen via HPLC och MS. Confirm bildandet av den första bron genom iodoacetamide (IAA) derivatisering (steg 6).
    3. Kaseinbanden peptiden och använda den utan ytterligare rening för 2nd oxidationen.
  2. 2nd Oxidation (figur 1C)
    Obs: Under andra oxidationen, deprotection av de Acm-skyddade cysteines och bildandet av den andra bron är katalyseras av jod. Protokollet som gäller till 15 mg av peptid efter 1st oxidation (2862.5 g/mol; 5,2 µmol; 1 ekv.)
    1. Lös peptiden (15 mg; slutlig koncentration på 0,05 mM) i 105 mL en isopropanol/H2O/1 M saltsyra (HCl) blandning (80:12.5:7.5).
    2. Tillsätt 158 µL av en 0,1 M jodlösning i metanol (MeOH) (15,7 µmol; 3 ekv) till lösningen. Rör om reaktionen i rumstemperatur i 3-52 h, dvs., tills oxidationen är slutförd.
    3. Övervaka oxidationsreaktionen via HPLC och MS. Confirm bildandet av den andra disulfide bond iodoacetamide (IAA) derivatisering (steg 6).
    4. Stoppa reaktionen genom att lägga till 79 µL av en 1 M askorbinsyra lösning i H2O (78,8 µmol; 15 ekv.). Kaseinbanden reaktionsblandningen och använda pulvret för 3rd oxidation.
  3. 3rd Oxidation (figur 1D)
    Obs: Sista oxidation leder till deprotection av de tBu-skyddade cysteines och bildandet av den tredje disulfid bron. Protokollet som gäller till 15 mg av peptid efter 2nd oxidation (2718.3 g/mol; 5,5 µmol; 1 ekv.).
    1. Lös peptiden (15 mg, slutlig koncentration på 1 mM) i 5,5 mL TFA. Den innehåller en gatsopare blandning bestående av 11,2 mg diphenylsulfoxide (55 µmol; 10 ekv.), 60,2 µL av anisole (0,6 mmol; 100 ekv) och 97,2 µL av trichloromethylsilane (0,8 mmol; 150 ekv.). Rör blandningen för 3-5 h i rumstemperatur.
    2. Övervaka oxidationsreaktionen via HPLC och MS. Confirm bildandet av den tredje disulfide bond iodoacetamide (IAA) derivatisering (steg 6).
    3. Fällningen peptiden i rören som innehåller kall dietyleter (0 ° C, 1 mL reaktion lösning per 8-10 mL dietyleter).
    4. Centrifugera suspensioner (3400 x g, 1 min), Dekantera supernatanten och tvätta pellets upprepade gånger (4 gånger) med 8-10 mL kall dietyleter (0 ° C). Låt pellets torka på luft (3 min).
    5. Lös upp pellets i 1 mL 80% tert-butanol (i H2O), kaseinbanden peptiden och lagra den på-20 ° C.

5. peptid rening

Obs: Rena de oxiderade peptiderna genom semi förberedande RP HPLC utrustad med en C18 kolumn (10 µm partikelstorlek, 300 Å porstorlek, 250 x 22 mm) och en 3,6 mL injektionsslinga. Använda en gradient eluering system av 0,1% transfettsyror i H2O (Elueringslösning A) och 0,1% transfettsyror i MeCN/H2O (9:1, elueringslösning B). Upptäcka topparna på 220 nm.

  1. Lägga till 15 mg frystorkade rå produkten från steg 4.3.5 i en 15 mL tub. Lös upp rå produkten i volymen av HPLC prov slingan (t.ex., 3,6 mL). Använd en blandning av 0,1% transfettsyror i MeCN/H2O (1:1). Vortex tills fullständig upplösning och centrifugera (3400 x g) lösningen för 1 min.
  2. Rita upp 3,6 mL blandningen i 5 mL spruta och injicera injektionsslinga provet utan eventuella luftbubblor. Starta injektionen i HPLC system. Rena peptid blandningen med en gradient av 0-50% elueringslösning B över 120 min med en flödeshastighet av 10 mL/min.
  3. Samla fraktionerna i enskilda rör som de visas. När körningen är klar, förbereda valda fraktioner för MS och HPLC analys (steg 6.1-6.2). Kaseinbanden alla fraktioner och lagra dem vid-20 ° C.
  4. När körningen är klar, förbereda valda fraktioner för MS och HPLC analys (steg 6.1-6.2). Kaseinbanden alla fraktioner och lagra dem vid-20 ° C.

6. peptid Analytics

  1. Analytiska HPLC
    Obs: Kontrollera renheten av en peptid genom analytiska RP HPLC utrustad med en C18 kolumn (5 µm partikelstorlek, 300 Å porstorlek, 250 x 4.6 mm) och en 500 µL injektionsslinga. Använda en gradient eluering system av 0,1% transfettsyror i H2O (Elueringslösning A) och 0,1% transfettsyror i MeCN (elueringslösning B). Upptäcka topparna på 220 nm.
    1. Överföra ett urval av peptid fraktioner eller reaktion kontroller i en HPLC injektionsflaska och lös upp det i en blandning av 0,1% transfettsyror i MeCN/H2O (1:1, 300-500 µL). Placera injektionsflaskan med HPLC i autosampler för den analytiska RP HPLC.
    2. Injicera 250 µL av varje prov. Använda en gradient eluering system av 0,1% transfettsyror i H2O (Elueringslösning A) och 0,1% transfettsyror i MeCN (elueringslösning B). Rena peptiden med en lutning av 10-40% elueringslösning B över 30 min med en flödeshastighet av 1,0 mL/min.
  2. MALDI TOF masspektrometri
    Obs: Bekräfta identiteten på en peptid genom MALDI TOF (time av flyg) masspektrometri med α- cyano-4-hydroxycinnamic acid som matris.
    1. Överföra en synlig belopp av peptiden i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och lös upp den i 10 µL av en 37 mM α- cyano-4-hydroxycinnamic acid lösning i en blandning av 0,1% transfettsyror i H2O/MeCN (1:1).
    2. Vortex lösningen för 10 s, applicera 2 µL av provet till ett slipat stål mål, och lufttorka provet.
    3. Använda reflektor läge för mätningarna och en peptid kalibrering standard för molar massorna under 6000 g/mol.
  3. Iodoacetamide derivatisering
    Obs: Som iodoacetamide reagerar med thiol grupper, anger iodoacetamide derivatisering av peptiderna gratis thiol grupper. Därav, avsaknad av gratis thiol grupper fungerar som en reaktion kontroll via MS under 1st oxidation.
    1. Lös upp peptiden i 10 mM fosfatbuffert (100 µL, 0,05 mM, pH 7,8) i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Tillsätt 100 µL av iodoacetamide i 10 mM fosfatbuffert (4 mM) till peptid lösningen och skaka försiktigt reaktionen för 2 h i rumstemperatur i mörkret. Kaseinbanden reaktionsblandningen och lagra den på-20 ° C.
    2. Använda en C18-koncentration filter pipettspetsen och vårda spetsen med 10 µL av 80% (3 gånger), 50% (3 gånger), 30% (3 gånger) och 0% (3 gånger) MeCN i H2O (+ 0,1% TFA).
    3. Lösa upp provet från steg 6.3.1 i 1 µL 0,1% transfettsyror i H2O och lägga till lösningen i filtret pipettspetsen. Pipettera försiktigt upp och ner så att peptiden binder till pärlan. Avlägsna den H2O av pipettspetsen och skölj filtret pipettspetsen med 10 µL 0,1% transfettsyror i H2O.
    4. Tillsätt 2 µl 0,1% transfettsyror i H2O/MeCN (1:1) med en annan pipettspetsen (utan filter) ovanpå den pärla som innehåller peptiden. Applicera filtratet till målet för marken stål och lufttorka provet.
    5. Applicera 1 µL av en 37 mM α-cyano-4-hydroxycinnamic acid lösning i en blandning av 0,1% transfettsyror i H2O/MeCN (1:1) till marken stål rikta med provet och lufttorka provet.
    6. Använda reflektor läge för mätningarna och en peptid kalibrering standard för molar massorna under 6000 g/mol.
  4. Aminosyra analys
    Obs: Analysera den exakta peptid koncentrationen samt aminosyra sammansättning av peptiden med hjälp av en aminosyra analysator.
    1. Överför 100 µg av ren peptiden (2604 g/mol; 0,04 µmol) till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och lös upp pulvret i 200 µL 6 M HCl.
    2. Överför 200 µL av lösningen till en glasampull och skölj 1,5 mL mikrocentrifug röret två gånger med 200 µL 6 M HCl. överför skölja lösningen till glasampullen samt.
    3. Stäng ampullen genom att värma halsen på ampullen med en bunsenbrännare låga. Sätta ampullen i ett glasrör. Placera den i ett värmeblock för 24 h vid 110 ° C för hydrolys.
    4. Öppna ampullen och överför lösningen till en 2 mL mikrocentrifug rör. Tvätta ampullen (3 x 200 µL) och den gemensamma jordbrukspolitiken (3 x 100 µL) med dubbeldestillerat H2O och överför det till mikrocentrifug röret.
    5. Centrifugera lösningen för 6 h vid 60 ° C och 210 x g i en roterande vakuum koncentrator. Lös upp hydrolyserat produkten i 192 µL prov utspädning bufferten (200 µM) och överför lösningen till en mikro-centrifugal filter.
    6. Centrifugera provet för 1 min vid 2300 x g och överföring 100 µL av filtratet i en aminosyra analys prov röret. Placera röret i aminosyran analyzer och starta analysen. En aminosyra standard används för kalibrering.

7. MS/MS-analys av disulfid Connectivity

  1. Partiell nedsättning och alkylering17
    1. Lös upp 600 µg av ren peptiden (2604 g/mol; 0,23 µmol) i 1,2 mL 0,05 M citratbuffert (pH 3,0; 0,14 mM peptid koncentration) innehållande 7,5 mg tris(2-carboxyethyl) fosfin (TCEP; 0,02 M; 0,03 mmol).
    2. Inkubera blandningen i rumstemperatur och ta flera reaktion kontrollprover (100 µL) sträcker sig från 0 min till 30 min.
    3. Blanda proverna i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör med 300 µL av alkylering buffert (0,5 M tris-acetat; pH 8,0; 2 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA); 1,1 M iodoacetamide) att stoppa reaktionen och utföra carbamidomethylation i grupperna gratis thiol.
    4. Stoppa reaktionen efter 5 min genom att lägga till 100 µL 10% TFA (i H2O) och lagra proverna på torris. Förbereda HPLC prover som beskrivs i steg 6.1.2 och injicera 400 µL. (figur 2A)
    5. Använda en gradient eluering system av 0,1% transfettsyror i H2O (Elueringslösning A) och 0,1% transfettsyror i MeCN (elueringslösning B). Analysera de peptider som använder en kombination av en Isokratisk separation (10% elueringslösning B för 15 min) och sedan en efterföljande lutning av 10-35% elueringslösning B över 25 min med en flödeshastighet på 10 mL/min. upptäcka topparna på 220 nm.
    6. Samla fraktionerna i 1,5 mL mikrocentrifugrör och kaseinbanden peptiderna. (Bild 2B)
    7. Överföra en liten mängd av respektive fraktion till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör för MS/MS-analys av formulären oxiderat (fortsätta på steg 7.1.12).
    8. Lös upp de återstående peptiden (10-100 µg) i 0,1% transfettsyror i H2O (10-50 µL) och lägga till en lämplig volym av en 100 mM TCEP lösning (i H2O) för att få en slutlig TCEP koncentration på 10 mM.
    9. Inkubera reaktionen för 1 h vid 37 ° C (figur 2C). Kaseinbanden reaktionsblandningen och lagra den på-20 ° C.
    10. Förbereda MS/MS prover som beskrivs i steg 6.3.2-6.3.5.
    11. Utföra mätningarna som MS/MS på en MALDI TOF/TOF masspektrometer. Använd MS/MS locket (laserinducerad decay) för fragmentering av peptiden och välj föregångare massorna av 2 - och 4-gånger carbamidomethylated arter. Behandla och utvärdera MALDI data för att bekräfta önskat disulfid anslutning.

8. NMR experiment och strukturanalys

  1. Lös upp ca 0,3-2 mg av ren peptid produkten i 500 µL av H2ö/v2O (90: 10) och överföring blandningen i ett NMR mikrorör.
  2. Förbereda provet för mätningar vid en NMR spectrometeren
  3. Post 2-dimensionella [1H,1H] - DQF - COSY (dubbel quantum filtreras korrelation spektroskopi), [1H,1H] - TOCSY (totalt korrelerad spektroskopi), [1H,1H] - NOESY (nuclear Overhauser enhancement spektroskopi), och [1H,13C]-HSQC (heteronuclear enda quantum samstämmighet) Spektra med vatten dämpning.
  4. Tilldela proton resonanser av inspelade spektra och skapa atom uppdraget från NOESY spectra. Jämför stödnivåerna i NOESY spektra att ställa in de övre gränsen avstånd begränsningarna mellan olika atomer i peptiden. Använd intensiteten av germinal protonsna för peak-intensitet kalibrering.
  5. Utför beräkning av struktur och förfiningen med ett datorprogram för molekylära visualisering och använda de identifierade disulfid connectivities i steg 7 som ytterligare begränsningar (figur 3).
  6. Välj strukturerna med lägsta energier och använda den för molekyldynamik (MD) simulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

15 olika disulfid-bridged isomerer av den µ-conotoxin PIIIA är syntetiserade och kännetecknas i detalj (figur 1). Disulfide obligationer identifieras genom partiell nedsättning och efterföljande MS/MS-analys (figur 2). NMR analys av de olika isomererna utförs (figur 3) för att avslöja de enskilda peptid strukturerna. Bland annat krävs en kombination av RP HPLC, MS/MS fragmentering och NMR analys för entydig identifiering av disulfid anslutning.

Figure 1
Figur 1 : Selektiv disulfide bond bildandet av infödda µ-PIIIA via den skydda koncernens strategin. (A) deprotection av de Trt-skyddade cysteines under peptid klyvning från kådan. (B) den första disulfid bron bildandet av de oskyddade cysteines. (C) Deprotection och disulfid bron bildandet av ACMEN skyddade cysteines. (D) Deprotection och disulfid bron bildandet av tBu skyddade cysteines. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Partiell minskning arbetsflöde för disulfide bond tilldelningen av MS/MS-analys. (A) partiell nedsättning och alkylering av peptiden. (B) HPLC rening av olika reaktion kontrollprover. (C) minskning av renat proverna. Delvis carbamidomethylated arter (två peptider i mitten) hamnen information på det disulfid connectivity som bestäms av MS/MS-analys. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Heimer, P. et al. Konfirmerande µ-Conotoxin PIIIA isomerer Revisited: inverkan av cystein kopplingen på disulfid-Bond uppdrag och struktur klargörande. Analytisk kemi. 90 (5), 3321-3327 (2018). Upphovsrätt (2018) American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Den sekventiella promenaden och den resulterande NMR lösning strukturen av en styv (vänster) och en flexibel (höger) µ-PIIIa-isomer. De 20 strukturerna med de lägsta energierna samt disulfid anslutning av de olika isomererna visas. Jämförelse av de kvadratiska medelvärde avvikelse (RMSD) värdena klargör att en styv peptid mestadels leder till en bättre löst NMR struktur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metod som beskrivs häri för syntesen av cystein-rika peptider som µ-PIIIA representerar en möjlighet att selektivt producera disulfid-bundna isomerer från den samma aminosyrasekvensen. Därför etablerade metoder såsom Fmoc-baserade fast fas peptid syntes18 och en definierad skydda koncernens strategi för regioselective bildandet av disulfide obligationer var används16. Den fasta fasen peptidsyntesen kan producera amino syra ordnar på en polymer support (kåda) via automatiserad syntes. Dessa aminosyror är skyddade mot oönskad sidoreaktioner under sekvens montering av skydda specialgrupper på deras sida kedjor, som - beroende på protokollet används - deprotected vid peptid klyvning från kådan. Detta skydd gäller även cystein sida kedjorna inom kedjan peptid, t.ex., trityl skydd. Dock skiljer sig skydda grupper för enskilda par cysteines såsom acetamidomethyl och tert-butyl klyvs inte samtidigt genom detta avskaffande steg. Dessa skydda grupper kan vara klyvs av villkor som tillåter efterföljande oxidation genom att bilda disulfide obligationer från deprotected thiol grupper. På detta sätt kan alla 15 disulfid isomerer av en peptid som innehåller sex cystein rester vara selektivt bildade7,16. Den begränsande faktorn, är dock att med ett ökande antal olika ortogonala skydda grupper den syntetiska ansträngning ökar, som har en hög inverkan på avkastningen av önskad disulfid överbryggas peptiden. Således i utvalda fall och i synnerhet för mindre komplexa peptider som har endast en eller två disulfide obligationer den oxidativa själv fällbara metoden kan verkligen vara rekommenderad över den skydda koncernens strategin.

Häri, avlägsnas Trt grupperna av ett cystein par genom inverkan av TFA efter slutförandet av peptid församlingen och sista Fmoc-deprotection av N-terminala aminosyran. De sura förhållandena, dock lämna Acm och tBu skydda grupper på de andra två par av cystein rester intakt. Därefter utförs rening av linjära peptiden innehållande två oskyddade cysteines med preparativ HPLC under något sura förhållanden för att upprätthålla thiol grupperna i formuläret protonerade. Protokollet fortsätter med första oxidation steg efter analytiska HPLC och MS analys verifierade framgångsrika syntes och deprotection av Trt på cystein para av intresse. Ytterligare steg i deprotection oxidation av den andra och tredje disulfide bond utförs och bekräftade på samma sätt med lämpliga protokollet för Acm och tBu, respektive. Dessa oxidationsreaktioner är alltså enkel våt-kemiska reaktioner i lösning som inte kräver dyra reagenser. Nackdelen, är dock att vissa reaktioner, dvs., anslutningar av distinkta cystein rester, Fortsätt inte smidigt och helt leder till biprodukter av kodade disulfid anslutning. Eftersom dessa inte tas bort efter slutförandet av de enskilda oxidationsreaktioner, kan sådana biprodukter ansamlas i rå produkt blandningen. Några av dessa kan ha liknande fysikalisk-kemiska egenskaper som den faktiska peptiden, t.ex., HPLC eluering, vilket ökar insatserna för rening av korrekt vikta peptiden. Även om syntes och rening kan vara svårt, som är fallet för µ-PIIIA, denna metod kan framgångsrikt användas, men kräver bra manual och observation färdigheter. Slutligen måste det anses att varje peptid sekvens är olika och därför kan behandlas annorlunda för att lyckas skapa den rätta disulfid connectivity.

Förutom den utmanande syntesen, är det viktigt att kontrollera huruvida de disulfide obligationer produceras är korrekta, dvs., representerar den avsedda versionen av respektive disulfid isomeren. Detta utförs häri med en kombination av VITEK MS/MS-analys och NMR struktur klargörande. MS/MS-analys utförs med hjälp av olika delvis nedsatt och alkylerade derivat (carbamidomethylation) av fullt oxiderat peptid17. Den VITEK MS/MS locket TOF/TOF hittade spectra ett jämnt antal carbamidomethylated cysteines är alltid, dvs2-, 4- eller 6-gånger carbamidomethylated. Detta kan förklaras genom en stegvis minskning av de fullständigt oxiderat peptiderna, sedan i varje tillfälle två tiol funktioner per disulfide bond alltid minskas (öppnat) och i situ alkylerade använder iodoacetamide. Denna carbamidomethylation av två cysteines varje kan upptäckas i VITEK MS/MS spektra och, i sin tur refererar till den respektiva disulfide bond dessa cysteines var engagerade i i intakt peptiden. Till exempel förekomsten av fyra carbamidomethylated cysteines i en sekvens med tre disulfide obligationer hjälper till att identifiera en specifik bond, nämligen den som bildas mellan de två icke-alkylerade cysteines, som inte öppnade under reaktionstiden för de partiell minskning tillräckligt att öppna de andra två Obligationerna. VITEK MS/MS analys av de olika 2 - och 4-gånger carbamidomethylated derivat av peptid disulfid isomeren, kan de disulfid connectivities således helt klarlagd och bekräftade.

En annan möjlighet att belysa disulfide bond mönstret är MS/MS analysen av enzymatiskt smält peptider, där peptiden har till vara proteolytically klyvs på olika aminosyror för att producera mindre fragment. Dessa korta fragment kan fortfarande vara kopplad via disulfide obligationer, vilket är anledningen till att disulfid mönstret kan belysas från MS/MS-analys av dessa länkade fragment. Vid µ-PIIIA, men kan denna strategi inte tillämpas eftersom vissa cysteines av sekvensen angränsar direkt till varandra och nedbrytning av peptiderna skiljer därför inte cysteines från varandra. Identifiering av specifika disulfid bron är därför svårt.

Struktur förtydligandet av 2D NMR analys underlättas tydligt vid en känd disulfid-anslutning, eftersom denna kunskap gör tilldelningen av nukleära Overhauser verkställer (NOE'S) till specifika protoner, dvs., hänskjutande till den rumsliga avståndet mellan två atomer bestäms från stödnivåerna NOESY signalerna (genom-space NMR experiment). Analysen, men börjar med den sekventiella promenad19 tillämpas på mysiga TOCSY och NOESY spektra, på detta sätt är det möjligt att tilldela en specifik signal till motsvarande H-atom av aminosyror (spin system) i sekvensen. De ovan nämnda avstånd begränsningarna från NOESY experiment används i beräkningen struktur av peptid7. Fler signaler identifieras, desto mer exakt strukturen kommer att vara. Men ökar svårigheten att detta uppdrag med antalet aminosyror i peptiden och förekomsten av intilliggande cysteines, eftersom sannolikheten ökar att signaler av flera atomer överlappar varandra och kan inte längre just tilldelas på grund av att stänga närhet. Flexibiliteten i kedjan peptid är dessutom avgörande för huruvida signaler i NMR är enkelt eller knappast identifierbara. Ju mer flexibel en peptid-region, de mer konfirmerande förändringarna sker, tillåter flera signaler ska erhållas för en och samma atom. Således minskar intensiteten med antal konformationer, som orsakar signaler att försvinna in bakgrundsljud. Detta innebär att tredimensionella struktur klargörande via NMR blir mycket enklare om sekvensen tvings conformationally.

Slutligen gör detta protokoll det möjligt att generera flera disulfid-bridged peptider genom att övervaka disulfide bond bildandet av VITEK MS/MS-analys och samtidig 2D NMR struktur klarläggande7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka A. Resemann, F. J. Mayer och D. Suckau från Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts och C. Thiele från Darmstadt tekniska högskolan; O. Ohlenschläger från den FLI Jena, M. Engeser från universitetet i Bonn; K. Kramer, A. Harzen och H. Nakagami från Max Planck-institutet för avel växtforskning, Köln; Susanne Neupert från Institutet för zoologi, Köln; och till Biomolekylär magnetisk resonans spektroskopi på universitetet i Frankfurt för tekniskt stöd, utbildningsmoduler, och tillgång till instrument. Ekonomiskt stöd av universitetet i Bonn till D.I. är erkänt tacksamt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin Varian, Inc. PL3867-3764 AmphiSpheres 40 RAM
Pyr(Boc) Bachem A-3850
Arg(Pbf) Iris Biotech FSC1010
Asn(Trt) Bachem B-1785
Asp(tBu) Iris Biotech FSP1020
Hyp(tBu) Iris Biotech FAA1627
Lys(Boc) Bachem B-1080
Ser(tBu) Iris Biotech FSC1190
Gln(Trt) Iris Biotech FSC1043
Glu(tBu) Iris Biotech FSP1045
Trp(Boc) Iris Biotech FSC1225
Tyr(tBu) Sigma Aldrich 47623
Thr(tBu) Iris Biotech FSP1210
His(Trt) Iris Biotech FDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat Sigma Aldrich 8510060 Flammable
DMF Fisher Scientific D119 Flammable, Toxic
DCM Fisher Scientific D37 Carcinogenic
Piperidine Alfa Aesar A12442 Flammable, Toxic, Corrosive
N-Methyl-Morpholin Sigma Aldrich 224286
Cys(Acm) Iris Biotech FAA1506
Cys(Trt) Bachem E-2495
Cys(tBu) Bachem B-1220
trifluoruacetic acid Sigma Aldrich 74564 Toxic, Corrosive
phenol Merck 1002060 Toxic
thioanisol Alfa Aesar A14846
ethanedithiol Fluka Analytical 2390
diethyl ether VWR 100,921 Flammable
tert-butanol Alfa Aesar L12338 Flammable
acetonitrile Fisher Scientific A998 Flammable
water Fisher Scientific W5
isopropanol VWR ACRO42383 Flammable
sodium hydroxide AppliChem A6579,1000 Corrosive
iodoacetamide Sigma Aldrich I6125
iodine Sigma Aldrich I0385
Hydrochloric acid Merck 110165 Corrosive
ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
diphenylsulfoxide Sigma Aldrich P35405
anisol Sigma Aldrich 96109 Flammable
trichloromethylsilane Sigma Aldrich M85301 Flammable
sample dilution buffer Laborservice Onken
sodium dihydrogen phosphate Sigma Aldrich 106370
disodium hydrogen phosphate Sigma Aldrich 795410
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706
citric acid Sigma Aldrich 251275
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
tris-acetate Carl Roth,  7125
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E26282 
peptide calibration standard II Bruker Daltonics GmbH 8222570
Name of Equipment Company
solid-phase peptide synthesizer Intavis Bioanalytical Instruments AG EPS 221
lyophilizer  Martin Christ GmbH  Alpha 1-2 Ldplus
semipreparative HPLC Jasco system PV-987
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) Knauer 25QE181E2J purification of the linear peptide
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) Hichrom-VWR HICH218TP1022 purification of the oxidized peptide
analytical HPLC  Shimadzu system LC-20AD
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm)  Hichrom-VWR HICH218TP54 analytical column
ground steel target (MTP 384) Bruker Daltonics GmbH NC0910436 MALDI preparation 
C18-concentration filter (ZipTip) Merck KGaA ZTC18S096 MALDI preparation 
MALDI mass spectrometer Bruker Daltonics GmbH ultraflex III TOF/TOF
amino acid analyzer Eppendorf-Biotronik GmbH LC 3000 system
NMR spectrometer Bruker Avance III Bruker Daltonics GmbH Bruker Avance III 600 MHz
computer program for molecular visualising YASARA Biosciences GmbH Yasara structures NMR structure calculation
computer program for MALDI data evaluation  Bruker Daltonics GmbH flexAnalysis, BioTools MS/MS fragmentation
analog vortex mixer VWR VM 3000
Microcentrifuge Eppendorf 5410
Centrifuge Hettich EBA 20
Rotational vacuum concentrator Christ 2-18 Cdplus
Analytical Balance A&D Instruments GR-202-EC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
  2. Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  3. Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
  4. Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
  5. Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
  6. Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
  7. Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
  8. Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).
  9. Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
  10. Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
  11. Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
  12. Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
  13. Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
  14. Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
  15. Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
  16. Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
  17. Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
  18. Kates, S. A., Albericio, F. Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , Marcel Dekker Inc. New York. (2000).
  19. Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).

Tags

Kemi fråga 140 peptider cystein-rika disulfid connectivity syntes skydda koncernens strategi strukturanalys 2D NMR (kärnmagnetisk resonans) MS/MS (tandem mass spectrometry)

Erratum

Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for:Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.

Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

to:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

Step 1.2 in the Protocol section was updated from:

NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.

to:

NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.

Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:

HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).

to:

HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).

The first item in the Materials table was updated from:

Fmoc Rink amide resin Novabiochem 855001

to:

PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin Varian, Inc. PL3867-3764 AmphiSpheres 40 RAM
Syntes och strukturbestämning av µ-Conotoxin PIIIA isomerer med olika disulfid Connectivities
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, … More

Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, C. A., Imhof, D. Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. J. Vis. Exp. (140), e58368, doi:10.3791/58368 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter