Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Syntese og proteinstrukturer av μ-Conotoxin PIIIA isomerene med forskjellige Disulfide Connectivities

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/58368
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Pharmaceutical Biochemistry and Bioanalytics, Pharmaceutical Institute, University of Bonn
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Cystein-rik peptider brett i forskjellige tredimensjonale strukturer avhengig av disulfide tilkoblingen. Målrettet syntese av personlige disulfide isomerene kreves når bufferen oksidasjon ikke fører til ønsket disulfide tilkobling. Protokollen avtaler med selektiv syntesen av 3-disulfide-limt peptider og strukturell analyse bruker NMR og MS-/ MS studier.

Abstract

Peptider med et høyt antall cysteinene påvirkes vanligvis om tredimensjonale strukturen av disulfide tilkoblingen. Det er derfor svært viktig å unngå uønskede disulfide obligasjon formasjon under peptid syntese, fordi det kan resultere i en helt annen peptid struktur, og derfor endret bioactivity. Riktig dannelsen av flere disulfide obligasjoner i et peptid er imidlertid vanskelig å få ved å bruke standard selv folding metoder som konvensjonelle buffer oksidasjon protokoller, fordi flere disulfide connectivities kan dannes. Denne protokollen representerer en avansert strategi kreves for målrettet syntesen av flere disulfide-bro peptider som ikke kan syntetiseres via buffer oksidasjon i høy kvalitet og kvantitet. Studien viser anvendelsen av en distinkt beskytte gruppe strategi for syntese av alle mulige 3-disulfide-limt peptid en μ-conotoxin PIIIA på en målrettet måte. Peptidene er utarbeidet av Fmoc-basert solid fase peptid syntese bruker en beskyttelse gruppe strategi for definerte disulfide obligasjon formasjon. Respektive parene av cysteinene er beskyttet med trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) og tert-butyl (tBu) beskytte grupper for å sikre at under hvert oksidasjon steg bare de nødvendige cysteinene er deprotected og koblet. I tillegg til målrettet syntese, en kombinasjon av flere analytiske metoder til å avklare riktig folding og generasjon av ønsket peptid strukturer. Sammenligning av de ulike 3-disulfide-limt isomerene indikerer viktigheten av nøyaktig bestemmelse og kunnskap om disulfide tilkobling for beregning av tredimensjonale strukturen og tolkning av biologisk aktivitet av peptid isomerene. Analytiske karakterisering inneholder nøyaktig disulfide obligasjon forklaring via tandem massespektrometri (MS-/ MS) analyse som utføres med delvis redusert og alkylated derivater av intakt peptid-isomer produsert av en tilpasset protokoll. Videre fastsettes peptid strukturer ved hjelp av 2D kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) eksperimenter og kunnskap fra MS-/ MS analyse.

Introduction

Bruk av bioaktive peptider i farmasøytisk forskning og utvikling er anerkjente, fordi de representerer potent og svært selektive forbindelser for bestemte biologiske mål1. For sine bioactivity, men er den tredimensjonale strukturen av stor betydning for å utføre struktur aktivitet forholdet studier2,3,4. Bortsett fra den primære aminosyre sekvensen som påvirker den totale konformasjon, stabilisere disulfide obligasjoner betydelig strukturen til cystein-rik peptider5. Flere disulfide-bro peptider inkluderer conotoxins som μ-PIIIA fra Conus purpurascens som inneholder seks cysteinene i sekvensen. Høy cystein innholdet kan teoretisk dannelsen av 15 disulfide isomerene. Riktig disulfide tilkobling er svært viktig for biological aktivitet6,7. Men spørsmålet som oppstår er om det er flere bioaktive konformasjon av naturlig forekommende peptider og hvis så, hvilke av disse isomerene besitter høyeste biologiske aktivitet? Ved μ-conotoxins, biologiske målene er spenning-gated natrium ionekanaler og μ-PIIIA spesielt er mest potente for subtyper NaV1.2, NaV1.4 og NaV1.73.

Syntese av disulfide-bro peptider kan oppnås ved hjelp av ulike metoder. Den mest hensiktsmessige metoden for dannelsen av disulfide obligasjoner i et peptid er såkalte oksidativt selv folding tilnærming. Her er lineær forløperen til den ønskede syklisk peptid syntetisert først bruker solid-fase peptid syntese, som er etter cleavage fra polymere støtte utsatt for oksidasjon i en buffer system. Redoks-aktive stoffer som redusert og oksidert glutathione (GSH/GSSG) er ofte lagt til fremme dannelsen av disulfide obligasjoner. Det hovedavdeling ulempen av buffer-støttet selv folding er at av disulfide obligasjoner ikke er dannet selektivt i en gradvis mote. Sammenlignet med den opprinnelige peptid, som ofte bare en bestemt disulfide isomer er beskrevet, er det mulig å få mange andre isomerene med denne tilnærmingen8. Μ-PIIIA har allerede vist resulterer i minst tre annerledes foldet isomerene på selv kaste i en tidligere studie3. Separasjon av slik en isomer blanding er ganske vanskelig på grunn av lignende tid hvis bruker brukt kromatografiske rensing metoder9. Målrettet syntesen av en bestemt isomer er derfor en fordel. Spesielt produsere en isomer med definerte disulfide tilkobling, en spesiell strategi er nødvendig som av disulfide obligasjoner er suksessivt lukket. Derfor er lineær forløperen bærer beskyttelse grupper på individuelle cystein parene syntetisert på polymer støtte. Etter eliminering, cystein parene er individuelt og suksessivt deprotected og koblet en oksidasjon reaksjon til ønsket disulfide obligasjoner10,11,12,13, 14 , 15 , 16. etter syntese og rensing av reaksjon produktet, er det nødvendig å bekrefte identiteten og disulfide tilkobling av egnet analytiske metoder. Mange analytiske metoder er tilgjengelige for utviklingen av de primære aminosyresekvens, f.eks., MS-/ MS, mens fastsettelse av disulfide tilkobling fortsatt mye mindre undersøkt. Fra kompleksiteten av slike flere disulfide-limt peptider, produktrelaterte urenheter (f.eks., fra disulfide desperat), på grunn av prøven forberedelse og arbeidet opp kan ytterligere komplisere analyse. I dette papiret viser vi at bruk av en kombinasjon av forskjellige analytiske teknikker er nødvendig å avklare utvetydig identiteten av disulfide obligasjoner i μ-PIIIA isomerene. Vi har kombinert brukt kromatografiske metoder med massespektrometri og gitt samme prøvene å NMR spektroskopi. I matrix-assistert laser desorption/ionization(MALDI) MS-/ MS analyse identifisert vi av disulfide obligasjoner med delvis reduksjon og iodoacetamide derivatization fordi ovenfra og ned analyse ikke er mulig for denne peptid. 2D NMR eksperimenter ble utført for å få en tredimensjonal struktur av hver isomer. Dermed, ved å kombinere forskjellige avanserte analytiske metoder, er det mulig å belyse riktig disulfide tilkobling og tredimensjonale strukturen i komplekse flere disulfide-limt peptider7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Alle aminosyrer brukes her var i L-konfigurasjonen. Initialene til aminosyrer og amino acid derivater ble brukt i henhold til anbefalingene nomenklatur komiteen av IUB og den IUPAC-IUB felleskommisjon for biokjemiske nomenklaturen.

1. solid-fase peptid syntese (SPPER)

Merk: Utføre syntese med en solid-fase peptid synthesizer. Utføre syntesen av lineær peptid forløperne til generelle rekkefølgen ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 bruker en standardprotokoll for 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) kjemi. Bruk følgende beskyttet aminosyrer: Pyr (Boc (tert-butyloxycarbonyl)), Arg (Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl)), Asn(Trt), Asp(tBu), Hyp(tBu), Lys(Boc), Ser(tBu), Gln(Trt), Glu(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), Thr(tBu) og hans (Trt). Beskytte cystein parene med Trt-, Acm- eller tBu-grupper etter tiltenkte disulfide tilkobling.

  1. Forberedelse
    1. Tørr Fmoc Rink-amid harpiks (lasting: 0,28 mmol/g) bruker en lyophilizer over natten.
    2. Angi ønsket peptid sekvensen (1-brev koden) i programmet av synthesizeren. Programmet beregner nødvendig for hver individuelle reagens og angir antall som løsemiddel.
    3. Veie personlige reagenser (aminosyrer, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) i henhold til protokollen og oppløse dem i vannistedenfor (DMF) til en siste konsentrasjon av 2,4 M (aminosyrer) og 0.6 M ( HBTU), henholdsvis.
    4. Overføre ulike reagenser (aminosyrer, HBTU, N-methylmorpholine (NMM, 50% i DMF), piperidine (20% i DMF), DMF, diklormetan (DCM)) til tilsvarende fartøyene og plassere dem i riktig racketer av en solid-fase peptid synthesizer.
    5. Legge til 100 mg av tørr harpiks kolonnene reaksjon og sette dem i racketen av synthesizeren. Starte solid-fase peptid syntese.
  2. SPPER-protokollen (leveres av synthesizer)
    Merk: Protokollen gjelder 100 mg av harpiks (lasting: 0,28 mmol/g) lagt til en reaksjon kolonnen for 28 µmol skala.
    1. Forberedelse av harpiks
      1. Skyll harpiks med 2500 µL DMF, 1400 µL av DCM og 1400 µL av DMF.
      2. Tømme harpiks med luft til løsemiddelet er fjernet og skyll harpiks med 2500 µL av DMF.
    2. Spalting av Fmoc beskytte gruppe
      1. Legge til 20% piperidine i DMF (1000 µL) til harpiks og vente på 6 min. fjerne løsningen fra harpiks. Gjenta trinn 1.2.2.1.
      2. Skyll to ganger med DMF (1st 4000 µL, 2nd1400 µL), tømme harpiks med luft til løsemiddelet er fjernet og skyll to ganger med 2000 µL av DMF.
    3. Kopling reaksjon
      1. Bland følgende reagenser i en separat hetteglass: HBTU (450 µL; 0.6 M i DMF 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL, 50% i DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-aminosyre (420 µL, 2,4 M i DMF; 1.01 mmol; 36 eq.). Legg blandingen til harpiks og vente på 13 minutter fjerne løsningen fra harpiks. Gjenta trinn 1.2.3.1.
      2. Vask med 3000 µL av DMF. Vask to ganger med 1400 µL av DMF. Vask to ganger med 2000 µL av DMF.
      3. Gjenta trinn 1.2.2 og 1.2.3 av antall aminosyrer i peptid sekvensen.
    4. Siste Fmoc cleavage og harpiks vask
      1. Legge til 20% piperidine i DMF (1000 µL) til harpiks og vente på 6 min. fjerne løsningen fra harpiks. Gjenta trinn 1.2.4.1.
      2. Skyll to ganger med DMF (1st 4000 µL, 2nd 1400 µL) og tømme harpiks med luft. Skyll to ganger med 2000 µL av DMF, 4 ganger med 1400 µL av DCM, og skyll to ganger med luft.
  3. Arbeidet opp
    1. Lyophilize harpiksen reaksjonen kolonner natten etter syntese er fullført.

2. peptid Cleavage fra harpiks (figur 1A)

Merk: Under spalting prosedyren, alle aminosyre siden kjeder unntatt Cys(Acm) og Cys (tBu) vil være deprotected. Protokollen gjelder 100 mg av harpiks.

  1. Kombiner frysetørket harpiks i en 12 ml tube og avkjøle den 0 ° c på is.
  2. Legge til 150 µL av en scavenger blanding (forberedt fra 0,75 g fenol, 0,5 mL thioanisole, 0,25 mL ethanedithiol) og 1 mL av trifluoroacetic syre (TFA, 95% i vann (H2O)) på is harpiks. La forsiktig risting for 3t ved romtemperatur.
  3. Filtrere blandingen gjennom et glass frit og samle filtratet i rør individuelt fylt med iskald diethyl Eter (1 mL av cleavage blanding per 8-10 mL diethyl Ether). Peptid precipitates som en hvit solid.
  4. Skyll filteret kaken med ekstra TFA (95% i H2O, ca 1-3 mL).
  5. Lukk rør som inneholder utløse og sentrifuge (3400 x g) suspensjon for 1 min, Dekanter nedbryting og vaske pellets med 8-10 mL iskalde diethyl Ether. Gjenta dette trinnet 3 ganger.
  6. La pellets står uten stopper for 5 min å fjerne gjenværende spor diethyl Ether. Oppløse råolje produktet pellets i 1 mL av tert-butanol (80% i H2O). Freeze-Dry peptider (-80 ° C).

3. rensing av lineær forløperen med semi preparative høyytelses flytende kromatografi (HPLC)

Merk: Rense råolje peptidene ved semi preparative tilbakeførte fase (RP) HPLC utstyrt med en C18 kolonne (5 µm partikkelstørrelse, 100 Å porestørrelse, 250 x 32 mm) og en 3,6 mL injeksjon loop. Bruke en gradient elueringsrør system på 0,1% TFA i H2O (eluent A) og 0,1% TFA i acetonitrile (MeCN) /H2O (9:1, eluent B). Gjenkjenne toppene på 220 nm.

  1. Legge til ca 70 mg av råolje peptid en 15 mL tube og oppløse den solide peptid i volumet av HPLC prøve loop (f.eks., 3,6 mL). Bruke en blanding av 0,1% TFA i MeCN/T2O (1:1). Vortex til komplett oppløsning og sentrifuger (3400 x g) løsningen for 1 min.
  2. Utarbeide prøven (3,6 mL) i en 5 mL sprøyte og injisere prøven uten noen luftbobler i loopen injeksjon. Injisere i HPLC systemet. Skille peptid blandingen med en stigning på 0-50% eluent B over 120 min på en flow rate på 10 mL/min.
  3. Samle fraksjoner i individuelle rør slik de vises. Etter fullført, forberede valgte fraksjoner massespektrometri (MS) og såkalt HPLC-analyse (trinn 6.1-6.2). Freeze-Dry fraksjoner og lagre dem på 20 ° C.
  4. Etter MS og HPLC-analyse, kombinere ren fraksjoner av lineær peptid og forberede prøvene for første oksidasjon.

4. selektiv dannelsen av Disulfide obligasjoner

  1. 1 st oksidasjon (figur 1B)
    Merk: Under peptid cleavage fra harpiks, Cys(Trt) er deprotected, fører til to ubeskyttet Cys rester som deretter utsettes for oksidasjon å danne den første disulfide obligasjonslån. Følgende protokollen gjelder 15 mg av lineær renset peptid (2864.5 g/mol, 5.2 µmol; 1 eq.).
    1. Oppløse den lineære peptid (15 mg) i 105 mL av en isopropanol/T2O-blanding (1:2, 0.05 mM, pH 8.5 justert med natriumhydroksid (NaOH)) og la forsiktig risting i luften under rammevilkårene for 12-48 h.
    2. Overvåke oksidasjon reaksjonen via HPLC og MS. Confirm dannelsen av den første broen ved iodoacetamide (IAA) derivatization (trinn 6).
    3. Freeze-Dry peptid og bruke det uten ytterligere rensing for 2nd oksidasjon.
  2. 2nd oksidasjon (figur 1C)
    Merk: Under andre oksidasjon, deprotection av Acm-beskyttet cysteinene og dannelse av andre broen er katalysert av jod. Protokollen gjelder 15 mg av peptid etter 1st oksidasjon (2862.5 g/mol, 5.2 µmol; 1 eq.)
    1. Oppløse peptid (15 mg, siste konsentrasjon av 0.05 mM) i 105 mL av en isopropanol/H2O/1 M saltsyre (HCl) blanding (80:12.5:7.5).
    2. Legge til 158 µL av en 0.1 M joden løsning i metanol (MeOH) (15,7 µmol; 3 eq.) løsningen. Rør reaksjonen ved romtemperatur for 3-52 h, dvs., til oksidasjon er fullført.
    3. Overvåke oksidasjon reaksjonen via HPLC og MS. Confirm dannelsen av den andre disulfide obligasjonslån ved iodoacetamide (IAA) derivatization (trinn 6).
    4. Stoppe reaksjonen ved å legge til 79 µL av en 1 M askorbinsyre løsning i H2O (78.8 µmol, 15 eq.). Freeze-Dry reaksjonsblandingen og bruk pulver for 3rd oksidasjon.
  3. 3rd oksidasjon (figur 1D)
    Merk: Siste oksidasjon fører til deprotection av tBu-beskyttet cysteinene og til dannelsen av den tredje disulfide bru. Protokollen gjelder 15 mg av peptid etter 2nd oksidasjon (2718.3 g/mol, 5,5 µmol; 1 eq.).
    1. Løses peptid (15 mg, siste konsentrasjon av 1 mM) i 5,5 mL TFA. Den inneholder en scavenger blanding bestående av 11,2 mg diphenylsulfoxide (55 µmol, 10 eq.), 60,2 µL av anisole (0,6 mmol; 100 eq.) og 97.2 µL av trichloromethylsilane (0,8 mmol; 150 eq.). Rør blandingen for 3-5 h ved romtemperatur.
    2. Overvåke oksidasjon reaksjonen via HPLC og MS. Confirm dannelsen av den tredje disulfide obligasjonslån ved iodoacetamide (IAA) derivatization (trinn 6).
    3. Utløse peptid i rør som inneholder kald diethyl Eter (0 ° C, 1 mL av reaksjon løsning per 8-10 mL diethyl Ether).
    4. Virvel av suspensjon (3400 x g, 1 min), Dekanter nedbryting og vaske pellets gjentatte ganger (4 ganger) med 8-10 mL kaldt diethyl Eter (0 ° C). La pellets tørke på luft (3 minutter).
    5. Oppløse pellets i 1 mL av 80% tert-butanol (i H2O), freeze-dry peptid og lagre den på 20 ° C.

5. peptid rensing

Merk: Rense oksidert peptidene ved semi preparative RP HPLC utstyrt med en C18 kolonne (10 µm partikkelstørrelse, 300 Å porestørrelse, 250 x 22 mm) og en 3,6 mL injeksjon loop. Bruke en gradient elueringsrør system på 0,1% TFA i H2O (eluent A) og 0,1% TFA i MeCN/T2O (9:1, eluent B). Gjenkjenne toppene på 220 nm.

  1. Legge til 15 mg av fryse-tørket råolje produktet fra trinn 4.3.5 en 15 mL tube. Oppløse råolje produktet i volumet av HPLC prøve loop (f.eks., 3,6 mL). Bruke en blanding av 0,1% TFA i MeCN/T2O (1:1). Vortex til komplett oppløsning og sentrifuger (3400 x g) løsningen for 1 min.
  2. Utarbeide 3,6 mL blandingen i en 5 mL sprøyte og injisere prøven uten noen luftbobler i loopen injeksjon. Starte injeksjon i HPLC system. Rense peptid blandingen med en stigning på 0-50% eluent B over 120 min på en flow rate på 10 mL/min.
  3. Samle fraksjoner i individuelle rør slik de vises. Etter fullført, forberede valgte fraksjoner MS og HPLC-analyse (trinn 6.1-6.2). Freeze-Dry alle fraksjoner og lagre dem på 20 ° C.
  4. Etter fullført, forberede valgte fraksjoner MS og HPLC-analyse (trinn 6.1-6.2). Freeze-Dry alle fraksjoner og lagre dem på 20 ° C.

6. peptid Analytics

  1. Analytiske HPLC
    Merk: Bekreft renheten av et peptid av analytiske RP HPLC utstyrt med en C18 kolonne (5 µm partikkelstørrelse, 300 Å porestørrelse, 250 x 4.6 mm) og en 500 µL injeksjon loop. Bruke en gradient elueringsrør system på 0,1% TFA i H2O (eluent A) og 0,1% TFA i MeCN (eluent B). Gjenkjenne toppene på 220 nm.
    1. Overføre et utvalg av peptid fraksjoner eller reaksjon kontroller i en såkalt HPLC medisinglass og oppløse den i en blanding av 0,1% TFA i MeCN/H2O (1:1, 300-500 µL). Plass HPLC ampullen i autosampler av den analytiske RP HPLC.
    2. Injisere 250 µL av hvert utvalg. Bruke en gradient elueringsrør system på 0,1% TFA i H2O (eluent A) og 0,1% TFA i MeCN (eluent B). Rense peptid med en stigning på 10-40% eluent B over 30 min på en strømningshastighet på 1,0 mL/min.
  2. MALDI TOF massespektrometri
    Merk: Bekreft identiteten til et peptid ved MALDI TOF (tiden for flygningen) massespektrometri bruker α- cyano-4-hydroxycinnamic syre som matrise.
    1. Overføre en synlig del av peptid til en 1,5 mL microcentrifuge rør og oppløse den i 10 µL av en 37 mM α- cyano-4-hydroxycinnamic syre løsning i en blanding av 0,1% TFA i H2O/MeCN (1:1).
    2. Vortex løsningen for 10 s, bruke 2 µL av utvalget på bakken stål mål og air-dry prøven.
    3. Brukes reflektor for målene og en peptid kalibrering standard molar massene under 6000 g/mol.
  3. Iodoacetamide derivatization
    Merk: Som iodoacetamide reagerer med thiol grupper, viser iodoacetamide derivatization av peptider gratis thiol grupper. Derfor fungerer fravær av gratis thiol grupper som en reaksjon kontroll via MS under 1st oksidasjon.
    1. Oppløse peptid i 10 mM fosfatbuffer (100 µL, 0.05 mM, pH 7,8) i en 1,5 mL microcentrifuge tube. Legg 100 µL av iodoacetamide i 10 mM fosfatbuffer (4 mM) peptid løsningen og forsiktig risting reaksjonen for 2 timer ved romtemperatur i mørket. Freeze-Dry reaksjonsblandingen og lagre den på 20 ° C.
    2. Bruke en C18-konsentrasjon filter pipette tips og tilstanden spissen med 10 µL av 80% (3 ganger), 50% (3 ganger), 30% (3 ganger) og 0% (3 ganger) MeCN i H2O (+ 0,1% TFA).
    3. Oppløse prøven fra trinn 6.3.1 i 1 µL på 0,1% TFA i H2O og legge løsningen til filteret pipette spissen. Pipetter forsiktig opp og ned slik at peptid binder til perlen. Fjern H2O av pipette spissen og skyll filter pipette spissen med 10 µL på 0,1% TFA i H2O.
    4. Legge til 2 µl på 0,1% TFA i H2O/MeCN (1:1) med en annen pipette tips (uten filter) over perlen som inneholder peptid. Bruk filtratet bakken stål målet og air-dry prøven.
    5. Bruke 1 µL av en 37 mM α-cyano-4-hydroxycinnamic syre løsning i en blanding av 0,1% TFA i H2O/MeCN (1:1) til bakken stål målet med prøven og air-dry prøven.
    6. Brukes reflektor for målene og en peptid kalibrering standard molar massene under 6000 g/mol.
  4. Aminosyren analyse
    Merk: Analysere nøyaktig peptid konsentrasjonen samt aminosyre sammensetningen av peptid bruker en aminosyre analyserer.
    1. Overføre 100 µg av ren peptid (2604 g/mol, 0.04 µmol) til en 1,5 mL microcentrifuge rør og oppløse pulveret i 200 µL av 6 M HCl.
    2. Overføre 200 µL av løsningen til et glass ampullen og skyll 1,5 mL microcentrifuge røret to ganger med 200 µL av 6 M HCl. overføre skyllingsprosess løsningen i denne glass ampullen også.
    3. Lukk denne ampullen ved oppvarming av denne ampullen med en Bunsen brenner flamme. Sette denne ampullen i røret. Plassere den i en oppvarming blokk for 24 h på 110 ° C i hydrolyse.
    4. Åpne denne ampullen og overføre løsningen i en 2 mL microcentrifuge tube. Vask denne ampullen (3 x 200 µL) og cap (3 x 100 µL) med dobbel-destillert H2O og overføre den til microcentrifuge røret.
    5. Sentrifuge løsningen for 6 h 60 ° C og 210 x g i en roterende vakuum konsentrator. Oppløse hydrolyzed produktet 192 µL eksempel fortynning bufferstørrelsen (200 µM) og overføre løsningen i et mikro-sentrifugal filter.
    6. Sentrifuge utvalget for 1 min på 2300 x g og overføre 100 µL av filtratet i en aminosyre analyse eksempel rør. Sett røret i aminosyre analyzer og starte analysen. En aminosyre standard brukes for kalibrering.

7. MS/MS analyse av Disulfide tilkobling

  1. Delvis reduksjon og alkylation17
    1. Oppløse 600 µg av ren peptid (2604 g/mol, 0,23 µmol) i 1,2 mL 0,05 M citrate bufferen (pH 3.0, 0,14 mM peptid konsentrasjon) som inneholder 7.5 mg av tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP; 0.02 M; 0,03 mmol).
    2. Inkuber blandingen ved romtemperatur og ta flere reaksjon kontroll prøver (100 µL) mellom 0 min 30 min.
    3. Bland eksemplene i en 1,5 mL microcentrifuge tube med 300 µL alkylation bufferen (0,5 M tris-acetate, pH 8.0; 2 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA), 1,1 iodoacetamide) å stoppe reaksjonen og utføre carbamidomethylation av de gratis thiol.
    4. Stoppe reaksjonen etter 5 min ved å legge til 100 µL av 10% TFA (H2O) og store eksemplene på tørris. Forberede HPLC prøver som beskrevet i trinn 6.1.2 og injisere 400 µL. (figur 2A)
    5. Bruke en gradient elueringsrør system på 0,1% TFA i H2O (eluent A) og 0,1% TFA i MeCN (eluent B). Analysere peptidene med kombinasjonen av en isocratic separasjon (10% eluent B i 15 min) og en påfølgende gradient 10-35% eluent B over 25 min på en strømningshastighet på 10 mL/min. oppdager toppene på 220 nm.
    6. Samle fraksjoner i 1,5 mL microcentrifuge rør og freeze-dry peptidene. (Figur 2B)
    7. Overføre en liten mengde av hver fraksjon til en 1,5 mL microcentrifuge tube for MS-/ MS analyse av oksidert skjemaene (fortsette på trinn 7.1.12).
    8. Oppløse den gjenværende peptid (10-100 µg) på 0,1% TFA i H2O (10-50 µL) og legge til en riktig volum på en 100 mM TCEP løsning (i H2O) for å få en endelig TCEP konsentrasjon av 10 mM.
    9. Inkuber reaksjonen 1t på 37 ° C (figur 2C). Freeze-Dry reaksjonsblandingen og lagre den på 20 ° C.
    10. Forberede MS-/ MS prøver som beskrevet i trinn 6.3.2-6.3.5.
    11. Utføre MS-/ MS målene på en MALDI TOF/TOF masse spectrometer. Bruke MS-/ MS lokk (laser-indusert decay) for fragmentering av peptid og velg forløper massene av 2 - og 4-ganger carbamidomethylated arter. Behandle og vurdere MALDI data bekrefte ønsket disulfide tilkobling.

8. NMR eksperimenter og Strukturanalyse

  1. Oppløse ca 0,3 til 2 mg av ren peptid produktet 500 µL av H2O/D2O (90: 10) og overføring blandingen til en NMR microtube.
  2. Forberede prøven målinger på en NMR spectrometer
  3. Oppføring 2-dimensjonal [1H,1H] - DQF - KOSELIGE (dobbel quantum filtrert korrelasjon spektroskopi), [1H,1H] - TOCSY (totalt korrelert spektroskopi), [1H,1H] - NOESY (kjernefysisk Overhauser ekstrautstyr spektroskopi), og [1H,13C]-HSQC (heteronuclear enkelt quantum sammenheng) spectra bruker vann undertrykkelse.
  4. Tilordne proton resonanser av de innspilte spectra og opprette atom tildelingen fra NOESY spectra. Sammenligne intensiteten i NOESY spectra sette øvre grense avstanden begrensningene mellom forskjellige atomer i peptid. Bruk intensiteten i germinal protoner for topp intensitet kalibrering.
  5. Utføre struktur beregning og raffinement med et dataprogram for molekylær visualisere og bruke de identifiserte disulfide connectivities trinn 7 som ytterligere begrensninger (Figur 3).
  6. Velg strukturer med de laveste energiene og bruke den for molekylære dynamikk (MD) simuleringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

15 forskjellige disulfide-Bridge en μ-conotoxin-PIIIA er syntetisert og preget i detalj (figur 1). Disulfide obligasjoner identifiseres med delvis reduksjon og påfølgende MS-/ MS analyse (figur 2). NMR analyse av de forskjellige isomerene utføres (Figur 3) til å avsløre personlige peptid strukturer. Spesielt, kreves en kombinasjon av RP HPLC, MS-/ MS fragmentering og NMR analyse for entydig identifikasjon av disulfide tilkobling.

Figure 1
Figur 1 : Selektiv disulfide obligasjon dannelsen av innfødte μ-PIIIA via beskytte gruppe strategien. (A) deprotection av Trt-beskyttet cysteinene under peptid cleavage fra harpiks. (B) den første disulfide bro dannelsen av ubeskyttet cysteinene. (C) Deprotection og disulfide bru dannelsen av Acm beskyttet cysteinene. (D) Deprotection og disulfide bru dannelsen av tBu beskyttet cysteinene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Delvis reduksjon arbeidsflyt for disulfide obligasjon tildelingen av MS-/ MS analyse. (A) delvis reduksjon og alkylation av peptid. (B) HPLC rensing av ulike reaksjon kontroll prøver. (C) reduksjon av renset prøvene. Delvis carbamidomethylated arter (to peptider i midten) havn informasjon om disulfide tilkobling som bestemmes av MS-/ MS analyse. Dette tallet er tilpasset med tillatelse fra Heimer, P. et al. Conformational μ-Conotoxin PIIIA isomerene Revisited: virkningen av cystein sammenkobling Disulfide obligasjon tildeling og struktur forklaring. Analytisk kjemi. 90 (5), 3321-3327 (2018). Opphavsrett (2018) American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Sekvensiell turen og den resulterende NMR løsning strukturen av en rigid (venstre) og en fleksibel (høyre) μ-PIIIa-isomer. 20 strukturer med lavest energiene samt disulfide tilkobling av de forskjellige isomerene vises. Sammenligning av rot betyr kvadratisk avvik (RMSD) verdiene tydeliggjør at et rigid peptid hovedsakelig fører til en bedre løst NMR struktur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden beskrevet her for syntese av cystein-rik peptider som μ-PIIIA representerer en mulighet til å produsere selektivt disulfide-limt isomerene fra samme aminosyresekvens. Derfor etablerte metoder som Fmoc-basert solid fase peptid syntese18 og en definert beskytte gruppe strategi for regioselective dannelsen av disulfide obligasjoner ble brukt16. Solid-fase peptid syntese kan produsere amino acid sekvenser på en polymer støtte (harpiks) via automatisert syntese. Disse aminosyrer er beskyttet mot uønsket siden reaksjoner under rekkefølge montering av spesielle beskytte på deres side kjeder, som er - avhengig av protokollen brukes - deprotected på peptid cleavage fra harpiks. Denne beskyttelsen gjelder også cystein siden kjedene i peptid kjeden, f.eks., trityl beskyttelse. Imidlertid forskjellige beskytte grupper for individuelle bokstavpar cysteinene som acetamidomethyl og tert-butyl er ikke samtidig kløyvde dette eliminering-trinnet. Gruppene beskyttelse kan være kløyvde av under forhold som tillater påfølgende oksidasjon ved å danne disulfide obligasjoner fra deprotected thiol grupper. På denne måten kan alle 15 disulfide en et peptid som inneholder seks cystein rester selektivt dannet7,16. Den begrensende faktoren, er imidlertid at med økende antall forskjellige ortogonale beskytte grupper syntetiske innsats øker, som har en høy effekt på avkastningen av ønsket disulfide Brokoblet peptid. Dermed kan i Utvalgte tilfeller og spesielt for mindre komplekse peptider har bare én eller to disulfide obligasjoner oksidativt selv folding tilnærming faktisk være foretrukket over beskytte gruppe strategien.

Her, fjernes Trt gruppene av en cystein par ved handlingen av TFA etter ferdigstillelse av peptid og siste Fmoc-deprotection av aminosyren N-terminal. De Sure forholdene, men la Acm og tBu beskytte grupper på de andre to par cystein rester intakt. Deretter utføres rensing av lineær peptid som inneholder to ubeskyttet cysteinene med skytevåpen HPLC litt sure forhold for å opprettholde thiol gruppene i skjemaet protonerte. Protokollen fortsetter med oksidering steg etter analytiske HPLC og MS analyse bekreftet vellykket syntese og deprotection av Trt på cystein paret av interesse. Den videre skritt av deprotection og oksidasjon av andre og tredje disulfide obligasjon er utført og bekreftet på samme måte bruker den riktige protokollen for Acm og tBu, henholdsvis. Disse reaksjoner er dermed enkel våt-kjemiske reaksjoner i løsning som ikke krever dyre reagenser. Ulempen, er imidlertid at visse reaksjoner, dvs., av forskjellige cystein rester, ikke Fortsett jevnt og helt fører til biprodukter av eggerøre disulfide tilkobling. Siden dette ikke er fjernet etter ferdigstillelse av de personlige reaksjonene, kan slik biprodukter samle i råolje produktet blanding. Noen av disse kan ha lignende mekanisk-egenskaper som den faktiske peptid, f.eks., HPLC elueringsrør, som øker innsatsen for rensing av riktig foldet peptid. Selv om syntese og rensing kan være vanskelig, som er tilfelle for μ-PIIIA, denne metoden kan være brukt, men krever god manuell og observasjon ferdigheter. Til slutt må vurderes at hver peptid sekvensen er forskjellig, og derfor kan behandles annerledes for å lykkes i å generere riktige disulfide tilkobling.

I tillegg til utfordrende syntese, er det viktig å kontrollere om disulfide obligasjoner produsert er riktige, dvs., representerer den tiltenkte versjonen av respektive disulfide isomer. Dette utføres her med en kombinasjon av MALDI MS-/ MS analyse og NMR struktur forklaring. MS-/ MS analyse er utført med ulike delvis redusert og alkylated derivater (carbamidomethylation) fullstendig oksidert peptid17. I MALDI MS-/ MS LOKKET TOF/TOF funnet spectra et likt antall carbamidomethylated cysteinene er alltid, dvs2, 4 eller 6 ganger carbamidomethylated. Dette kan forklares med gradvis reduksjon av fullstendig oksidert peptider, siden i hvert tilfelle to thiol funksjoner per disulfide obligasjon alltid reduseres (åpnet) og i situ alkylated med iodoacetamide. Denne carbamidomethylation av to cysteinene hver kan oppdages i MALDI MS-/ MS spectra og i sin tur refererer til de respektive disulfide obligasjonslån disse cysteinene var engasjert i i intakt peptid. For eksempel forekomsten av fire carbamidomethylated cysteinene i en sekvens med tre disulfide obligasjoner bidrar til å identifisere en bestemt obligasjon, nemlig en dannet mellom de to ikke-alkylated cysteinene, som ikke ble åpnet i løpet av reaksjon på delvis reduksjon tilstrekkelig til å åpne andre to obligasjoner. Dermed kan MALDI MS-/ MS analyse av ulike 2 - og 4-ganger carbamidomethylated derivater av peptid disulfide isomer, disulfide connectivities være helt belyst og bekreftet.

En annen mulighet å belyse disulfide obligasjon mønsteret er MS-/ MS analyse av enzymatisk fordøyd peptider, hvor peptid har å være proteolytically kløyvde på forskjellige aminosyrer å produsere mindre fragmenter. Disse korte fragmentene kan likevel være koblet via disulfide obligasjoner, som er grunnen til at disulfide mønsteret kan bli belyst fra MS-/ MS analyse av disse tilknyttede. Ved μ-PIIIA, men kan denne strategien ikke brukes fordi noen cysteinene av sekvensen er direkte tilstøtende og derfor fordøyelsen av peptider ikke separerer cysteinene fra hverandre. Identifikasjon av bestemte disulfide bru er derfor vanskelig.

Strukturen utviklingen av 2D NMR analyse er tydelig tilrettelagt i en kjent disulfide tilkobling, fordi denne kunnskapen gjør tildelingen av kjernefysiske Overhauser effekt (NOE) til bestemte protoner, dvs., refererer til de romlige avstanden mellom to atomer bestemmes fra intensiteten av NOESY signaler (gjennom rommet NMR eksperimentet). Analysen, men starter med sekvensiell gange19 på de KOSELIGE, TOCSY og NOESY spectra, på denne måten er det mulig å tilordne et bestemt signal til tilsvarende H-atom av aminosyrer (spin system) i sekvensen. Nevnte avstand begrensninger fra NOESY eksperimentet brukes i beregningen av strukturen av peptid7. Flere signaler identifisert, jo mer nøyaktig strukturen blir. Men øker vanskeligheten av denne tildelingen med antall aminosyrer i peptid og forekomsten av tilstøtende cysteinene, som øker sannsynligheten for at signaler av flere atomer overlapper og kan ikke lenger nøyaktig tilordnes grunn til å lukke nærhet. Videre er fleksibilitet peptid kjeden avgjørende for om signaler i NMR er lett eller knapt identifiserbar. Mer fleksibel et peptid område er mer conformational endringene er oppstått, slik at flere signaler innhentes for samme atom. Dermed reduseres intensiteten med antall konformasjonen, som forårsaker signalene forsvinner inn i bakgrunnsstøy. Dette betyr at tredimensjonal struktur elucidation via NMR blir enklere hvis sekvensen er conformationally begrenset.

Til slutt gjør denne protokollen det mulig å generere flere disulfide-bro peptider ved å overvåke disulfide obligasjon dannelsen av MALDI MS-/ MS analyse og samtidig 2D NMR struktur elucidation7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke A. Resemann, F. J. Mayer og D. Suckau fra Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts og C. Thiele fra Darmstadt University of Technology; O. Ohlenschläger fra FLI Jena, M. Engeser fra Universitetet i Bonn; K. Kramer, A. Harzen og H. Nakagami fra Max Planck Institute for planteforskning avl, Köln; Susanne Neupert fra Institute for zoologi, Köln; og Biomolecular magnetisk resonans spektroskopi fasilitetene på universitet i Frankfurt for teknisk støtte, opplæringsmoduler, og tilgang til instrumenter. Økonomisk støtte ved Universitetet i Bonn til di er takknemlig anerkjent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin Varian, Inc. PL3867-3764 AmphiSpheres 40 RAM
Pyr(Boc) Bachem A-3850
Arg(Pbf) Iris Biotech FSC1010
Asn(Trt) Bachem B-1785
Asp(tBu) Iris Biotech FSP1020
Hyp(tBu) Iris Biotech FAA1627
Lys(Boc) Bachem B-1080
Ser(tBu) Iris Biotech FSC1190
Gln(Trt) Iris Biotech FSC1043
Glu(tBu) Iris Biotech FSP1045
Trp(Boc) Iris Biotech FSC1225
Tyr(tBu) Sigma Aldrich 47623
Thr(tBu) Iris Biotech FSP1210
His(Trt) Iris Biotech FDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat Sigma Aldrich 8510060 Flammable
DMF Fisher Scientific D119 Flammable, Toxic
DCM Fisher Scientific D37 Carcinogenic
Piperidine Alfa Aesar A12442 Flammable, Toxic, Corrosive
N-Methyl-Morpholin Sigma Aldrich 224286
Cys(Acm) Iris Biotech FAA1506
Cys(Trt) Bachem E-2495
Cys(tBu) Bachem B-1220
trifluoruacetic acid Sigma Aldrich 74564 Toxic, Corrosive
phenol Merck 1002060 Toxic
thioanisol Alfa Aesar A14846
ethanedithiol Fluka Analytical 2390
diethyl ether VWR 100,921 Flammable
tert-butanol Alfa Aesar L12338 Flammable
acetonitrile Fisher Scientific A998 Flammable
water Fisher Scientific W5
isopropanol VWR ACRO42383 Flammable
sodium hydroxide AppliChem A6579,1000 Corrosive
iodoacetamide Sigma Aldrich I6125
iodine Sigma Aldrich I0385
Hydrochloric acid Merck 110165 Corrosive
ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
diphenylsulfoxide Sigma Aldrich P35405
anisol Sigma Aldrich 96109 Flammable
trichloromethylsilane Sigma Aldrich M85301 Flammable
sample dilution buffer Laborservice Onken
sodium dihydrogen phosphate Sigma Aldrich 106370
disodium hydrogen phosphate Sigma Aldrich 795410
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706
citric acid Sigma Aldrich 251275
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
tris-acetate Carl Roth,  7125
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E26282 
peptide calibration standard II Bruker Daltonics GmbH 8222570
Name of Equipment Company
solid-phase peptide synthesizer Intavis Bioanalytical Instruments AG EPS 221
lyophilizer  Martin Christ GmbH  Alpha 1-2 Ldplus
semipreparative HPLC Jasco system PV-987
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) Knauer 25QE181E2J purification of the linear peptide
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) Hichrom-VWR HICH218TP1022 purification of the oxidized peptide
analytical HPLC  Shimadzu system LC-20AD
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm)  Hichrom-VWR HICH218TP54 analytical column
ground steel target (MTP 384) Bruker Daltonics GmbH NC0910436 MALDI preparation 
C18-concentration filter (ZipTip) Merck KGaA ZTC18S096 MALDI preparation 
MALDI mass spectrometer Bruker Daltonics GmbH ultraflex III TOF/TOF
amino acid analyzer Eppendorf-Biotronik GmbH LC 3000 system
NMR spectrometer Bruker Avance III Bruker Daltonics GmbH Bruker Avance III 600 MHz
computer program for molecular visualising YASARA Biosciences GmbH Yasara structures NMR structure calculation
computer program for MALDI data evaluation  Bruker Daltonics GmbH flexAnalysis, BioTools MS/MS fragmentation
analog vortex mixer VWR VM 3000
Microcentrifuge Eppendorf 5410
Centrifuge Hettich EBA 20
Rotational vacuum concentrator Christ 2-18 Cdplus
Analytical Balance A&D Instruments GR-202-EC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
  2. Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  3. Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
  4. Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
  5. Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
  6. Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
  7. Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
  8. Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).
  9. Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
  10. Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
  11. Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
  12. Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
  13. Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
  14. Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
  15. Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
  16. Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
  17. Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
  18. Kates, S. A., Albericio, F. Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , Marcel Dekker Inc. New York. (2000).
  19. Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).

Tags

Kjemi problemet 140 peptider cystein-rik disulfide tilkobling syntese beskytte gruppe strategi Strukturanalyse 2D NMR (kjernefysiske magnetisk resonans) MS-/ MS (tandem massespektrometri)

Erratum

Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for:Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.

Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

to:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

Step 1.2 in the Protocol section was updated from:

NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.

to:

NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.

Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:

HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).

to:

HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).

The first item in the Materials table was updated from:

Fmoc Rink amide resin Novabiochem 855001

to:

PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin Varian, Inc. PL3867-3764 AmphiSpheres 40 RAM
Syntese og proteinstrukturer av μ-Conotoxin PIIIA isomerene med forskjellige Disulfide Connectivities
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, … More

Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, C. A., Imhof, D. Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. J. Vis. Exp. (140), e58368, doi:10.3791/58368 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter