Summary
يهدف هذا البروتوكول لوصف تتمثل الخنزير العزلة و السابقين فيفو إيصال الجينات لعلاج نماذج لأمراض التمثيل الغذائي عن طريق زرع الخلايا ذاتي. على الرغم من أن هذا النموذج خاصة تتمتع بمزايا فريدة من نوعها لصالح العلاج الناجح، التطبيق مؤسسة ذات صلة لمعالجة أمراض إضافية والمؤشرات.
Abstract
العلاج الجيني اختيار مثالي لعلاج العديد من أخطاء فطرية من الأيض في الكبد. السابقين فيفو، ناقلات لينتيفيرال قد استخدمت بنجاح في معالجة العديد من الأمراض المكونة للدم في البشر، كما يوفر الاستخدام التعبير التحوير مستقرة بسبب متجه القدرة على الاندماج في جينوم مضيف. هذا الأسلوب يوضح التطبيق السابقين فيفو العلاج الجيني لخلايا الكبد لنموذج حيوانات كبيرة من نوع tyrosinemia الوراثية أنا. تتكون هذه العملية من 1) عزل خلايا الكبد الأولية من الحيوان ذاتي الجهات المانحة والمتلقية، 2) السابقين فيفو إيصال الجينات عن طريق توصيل تتمثل مع ناقل لينتيفيرال، وزرع خلايا الكبد تصحيحها عن طريق بوابة 3) ذاتي حقن الوريد. ويعتمد نجاح الأسلوب عموما عند إزالة كفاءة والعقيمة لاستئصال الكبد، حذراً في التعامل مع العينة قصت لعزل خلايا الكبد سليمة كافية لتوصيل إعادة انجرافتينج، ونسبة عالية من الخلايا المعزولة، و الإجراءات الجراحية معقمة في جميع أنحاء للوقاية من العدوى. عطل فني في أي من هذه الخطوات سيؤدي منخفضة الغلة من خلايا الكبد ترانسدوسيد صالحة للزرع الذاتي أو العدوى من الحيوان المانح والمتلقي. نموذج الخنزير tyrosinemia الوراثية النوع البشري 1 (HT-1) المختارة لهذا النهج فريد قابلة لمثل هذا أسلوب، حتى نسبة مئوية صغيرة من انجرافتمينت خلايا تم تصحيحها سيؤدي إلى إعادة تعمير الكبد مع الخلايا السليمة التي تستند إلى قوي ميزة انتقائية على خلايا الكبد الأم مريضة. على الرغم من أن هذا التحديد النمو لن يكون صحيحاً لجميع المؤشرات، هذا النهج هو أساس للتوسع إلى دلائل أخرى ويسمح بالتلاعب بهذه البيئة معالجة أمراض إضافية، سواء داخل الكبد وما بعدها، في حين التحكم في التعرض لناقلات الأمراض الفيروسية والفرصة لسمية خارج الهدف وتوموريجينيسيتي.
Introduction
أخطاء فطرية من الأيض في الكبد هي عائلة من الأمراض الوراثية التي تؤثر مجتمعة ما يصل إلى 1 في 800 مولود حي1. كثير من هذه الأمراض هي عيوب وحيدة الجين2 ويمكن الشفاء من الناحية الوظيفية بإدخال عدد كاف من خلايا الكبد3نسخة مصححة واحدة من الجينات المتأثرة. يختلف حسب المرض4 النسبة المئوية الفعلية لخلايا الكبد التي يحتاج إلى تصحيح وهو يعتمد إلى حد كبير على طبيعة البروتين من ترميز، على سبيل المثال، أغلبه بروتينات مقابل هيولى. في معظم الحالات، هو جزيئي فعالية أي علاج للأمراض الأيضية بسهولة من خلال وجود المؤشرات الحيوية غالباً ما تتوفر في الدورة الدموية.
HT-1 هو خطأ وراثي في التمثيل الغذائي في الكبد ناجم عن خلل في فوماريلاسيتواسيتاتي هيدرولاز (فاه)5، الانزيمية الخطوة الأخيرة في عملية التمثيل الغذائي تيروزين6. يؤدي نقص فاه للبناء من نواتج الأيض السامة في الكبد يمكن أن يسبب فشل الكبد الحاد والموت أو في شكل المرض المزمن يمكن أن يسبب تليف الكبد وسرطانه الخلية الكبدية. المرض سريرياً تديره إدارة 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (نتبك)، مثبط جزيء صغير من إنزيم المنبع من فاه في التمثيل الغذائي تيروزين. المرض ويوفر بيئة مثالية لاختبار أساليب العلاج الجيني، كتصحيح ناجحة حتى عدد صغير من خلايا الكبد في نهاية المطاف سيؤدي إلى إعادة تعمير الكبد الكامل مع الخلايا المصححة في نماذج حيوانية كل صغيرة وكبيرة 7 , 8. وهذا يحدث بسبب تصحيح خلايا تتمتع بميزة بقاء عميقة على الخلايا التي لم يتم تصحيحها بسبب تراكم نواتج الأيض السامة في الأخير. فقدان خلايا الكبد غير المصححة يسمح للتوسيع الانتقائي لخلايا الكبد المصوبة تتسق مع قدرة التجدد في الكبد. يمكن أن يتبع العلاج بسهولة بقياس الانخفاض في تعميم مستويات التيروزين وسوكسينيلاسيتوني بعد زرع الأعضاء.
يجب أن يكون الهدف من هذا النهج بغية تبرير الطبيعة الغازية من الإجراءات، التي تشمل ظهرت جزئي، علاج دائم. ولذلك، تستخدم النسخ المتماثل غير كفء ناقلات لينتيفيرال نظراً لأنهم سوف ستابلي دمج الجينوم تتمثل9. ضمان إيصال الجينات المصححة لجميع الخلايا الوليدة كالكبد ينمو ويتسع ليحل محل الفقدان السريع للخلايا التي لم يتم تصحيحها. وهذا مفيد على ناقلات (إف) الفيروسية الغدد المرتبطة، والتي توجد أساسا ابيسوميس التي يمكن فقط أن تنتقل إلى خلية ابنه واحدة أثناء الانقسام10 وبالتالي فقدان أي أثر للعلاج في غضون أسابيع.
على الرغم من أن مجموعة متنامية من الأدب يدعم سلامة lentivirus11، المخاوف عبر أحداث سمية جينية تخفف عن طريق الحد من توصيل الخلايا المضيفة لبيئة التي تسيطر عليها في المختبر . ابدأ عناصره هو عرض الحرة ناقل المضيف عندما يتم تنفيذ هذا الأسلوب، الحد من التعرض لخلايا الكبد التي سيتم إعادة عرض مع الزرع الذاتي عن طريق الوريد البابي.
يصف هذا التقرير أسلوب العمليات الجراحية و السابقين فيفو الإجراءات المستخدمة لعزل خلايا الكبد للجينات العلاج السابقين فيفو و الزرع الذاتي اللاحقة12 لعلاج الخنازير HT-18. تتضمن عملية كاملة 1) ظهرت جزئي الذي يخدم كمصدر لخلايا الكبد وتحفيز النمو للكبد للمضيف، 2) عزل خلايا الكبد من الكبد قصت تليها السابقين فيفو تصحيح الجينات، وأخيراً 3) إعادة خلايا الكبد تصحيحها مرة أخرى في البلد المضيف. الطريقة الموصوفة تنطبق على جميع نماذج حيوانية كبيرة مع إدخال بعض التعديلات، ولكن فقط تفتقر إلى فاه خنزير13 سوف تتميز ببيئة انتقائية لخلايا الكبد المصوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات الحيوان أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية واستعراض ووافق على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) قبل إجراء الدراسة. الإجراءات الموصوفة هنا أجريت على الخنازير الذكور والإناث من المزرعة بيضاء كبيرة (50% أبيض كبير Landrace/50% الخلفية الوراثية) تصل إلى 3 أشهر من العمر التي تعتبر صحية ومناسبة لإجراء عملية جراحية. يتم إيواء الحيوانات اجتماعيا إلا إذا نظر موظفي مؤسسات الرعاية البيطرية غير متوافقة. يتم تغذية الحيوانات مستويات مناسبة من تشو مرتين يوميا والملاحظ لعلامات سريرية بموظفي الرعاية على الأقل مرة واحدة يوميا.
1-التحضير لعملية جراحية
- إدارة تيلازول 5 مغ/كغ و xylazine 2 مغ/كغ عضليا للحث على التخدير. إدارة البوبرينورفين ريال تحت الجلد في جرعة من 0.18 مغ/كغ للتسكين بعد العمليات الجراحية (المتوقع سيكون التسكين من هذه الجرعة يصل إلى 72 ساعة). يدوياً التحقق من الحيوان للاستجابات للتحقق من التخدير.
- بمجرد مخدراً، إدراج قسطرة الوريدية في الوريد المحيطي إذن للوصول دوائية.
- إدارة سيفازولين 25 ملغ/كغ عن طريق الحقن الوريدي والعضلي 5 ملغ/كغ من سيفتيوفور بريوبيراتيفيلي.
- إدارة المحلول الملحي العادي عن طريق الوريد للحفاظ على ضغط الدم ومعدل ضربات القلب في حدود الفسيولوجية طبيعية طوال فترة الإجراءات.
- ضع أنبوب أوروجاستريك لضغط المعدة. إجراء التنبيب داخل الرغامى مع أنبوب داخل رغامى حجم مناسب، التحقق من الموضع الصحيح بواسطة ضغط الصدر يدوياً للكشف عن زفير، ومن ثم تهوية ميكانيكية الحيوان مع إيسوفلوراني 1-3%.
- ضع يؤدي رسم القلب (ECG) وضغط الدم الكفة، ومسبار درجة الحرارة ونبضي لرصد وتسجيل العلامات الحيوية. وضع الحيوان في موقف ضعيف وفرك البطن من القفص الصدري للحوض مع تدين ثني ستيريليلي.
- تهوية الموضوع مع إيسوفلوراني 1-3% خلال الإجراء للحفاظ على طائرة جراحية التخدير. مواصلة رصد العلامات الحيوية للتغييرات وضبط isoflurane تبعاً لذلك للحفاظ على معدل ضربات القلب في مستويات ما قبل شق إذا قطرات ضغط الدم الحد isoflurane هائلا، وبدء عملاء المعتمدة مؤسسياً لاستعادة حيويتها، مثل أدرينالين عن طريق الحقن الوريدي.
- تسجيل معدل ضربات القلب ومعدل التنفس وضغط الدم ودرجة حرارة الجسم في سجل إجراء جراحي لتتبع والحفاظ على الرفق بالحيوان وفقا للسياسة الخاصة بالمؤسسة لضمان الامتثال لمعايير رعاية الحيوانات الكبيرة.
2-المناظير ظهرت جزئية
- القيام بإدخال موقع الميناء الأولية استخدام أسلوب حسن فتح سيفالاد للسرة. عندما يتم تصور الصفاق، بأمان إدخال تروكار 12 مم في تجويف البطن. تمرير 5 مم، 30°، ونطاق من خلال هذا المنفذ.
- إينسوفلاتي في البطن مع CO2 إلى 15 ملم زئبق. إطار التصور مباشرة مع الكاميرا المنظار، مكان اثنين منافذ إضافية 5 مم تثليث على الفص الجانبي الأيسر للكبد. الموضع الدقيق للمنافذ سيعتمد على حجم وتشريح الحيوان.
- عند هذه النقطة، ضع منظار البطن في أحد الموانئ 5 ملم.
- تحديد الجزء الجانبي الأيسر للكبد عند نقطة الشق الرئيسي من الفص الأيسر. هذا شرخ يفصل الجزء الجانبي الطبي واليسار. تأمين هياكل المدخل جنبا إلى جنب مع الوريد الكبدي على طول هذا الشق باستخدام دباسة جراحية (انظر الجدول للمواد). قطاع حمة من خلال هذا الشق استخدام إطلاق النار متسلسلة من دباسة استخدام 60، 45 أو 30 ملم يحمل الأوعية الدموية منذ وقت طويل.
- عند الانتهاء من بتر متني، تقييم الكبد بقايا لضمان الأرقاء كافية. التحكم في أي نزيف من حمة بالكي أو خياطة الجروح.
- استرداد قسم الكبد باستخدام جراسبيرس بالمنظار وحقيبة استرجاع أنسجة بالمنظار.
- إزالة المنافذ وإغلاق شق منفذ 12 مم في ثلاث طبقات مع توقف حجم 0 خياطة اللفافة خط الوسط، خياطة 2-0 قيد تشغيل لطبقة الجلد العميقة وخياطة 4-0 قيد تشغيل لطبقة سوبكوتيكولار. قد يتم إغلاق المنافذ 5 ملم في طبقة واحدة مع 2-0.
- مكان خلع ملابس معقمة في الشقوق (انظر الجدول للمواد).
- عندما الخلايا ستكون جاهزة في أقل من 4 ساعات، الحفاظ على الحيوانات تحت التخدير العام قد حتى وقت سرطانات.
- بدلاً من ذلك، إذا كان التلاعب الخلية تتطلب فترات أطول (مثل السماح بتشكيل الماغنيسيوم تتمثل أو فترات أطول في توصيل/التحديد استناداً إلى التطبيقات الفردية من هذا الأسلوب) تسمح الحيوان للتعافي من التخدير، وكرر خطوات الاستقراء مخدر قبل سرطانات عند الخلايا على استعداد.
3-تتمثل عزلة
- توصيل مضخة تمعجية مع نضح لتقديم حلول تشتت الحارة (صيانتها في حوض ماء 43 درجة مئوية) بالقسطرة لتوضع في الأوعية المكشوفة الكبيرة قسم الكبد، ويكون الحل درجة الحرارة 38 درجة مئوية عند مقدمة للأنسجة. يجب الاحتفاظ جميع الأنابيب والمعدات، والحلول العقيمة لضمان مناسبة لزرع الخلايا.
- رئيس الوزراء بمضخة وأنابيب مع "كل الثاني" حتى محبس الحنفية المتمركزة للتبديل بين كل الأول و "الثاني كل" تسليم للأنسجة. قم بالتبديل محبس الحنفية إلى في الموقف، ورئيس الوزراء بقية مجموعة أنابيب، ملء فخ فقاعة في خط تماما لمنع إدخال الهواء فقاعات في الأنسجة.
- تحضير عرضي نظيفة قطع خط عمودي لتداول الكبد الكشف عن المقاطع العرضية لفروع الوريد البابي والاوردة الخمائر لقسطرة.
- كاثيتيريزي الأوردة المكشوفة المتوفرة مع دافئ لتركيب قسطرة لتجنب تسرب بيرفوساتي. كانولاتي بوابة 1 على الأقل والوريد الكبدي 1 التأكد من نضح كافية للأنسجة.
- ضمان catheter(s) معبي/خالية هواء قبل وضع القسطرة في الوريد.
- نتخلل مع الحارة الواحدة وأنا في 100 مل/دقيقة، تحريك أنبوب منفذ من الوريد إلى الوريد كل 30 ثانية إلى 1 دقيقة دورة عن طريق الأوردة المتاحة كافة لمدة 15-20 دقيقة. خلال تعيين التسريب، لدى أنبوب إجلاء لإفراغ الدرج الداخلي في حاوية نفايات تحت الفراغ.
- قم بالتبديل إلى "كل الثاني" في 100 مل/دقيقة، ركوب الدراجات عن طريق الأوردة كما مع كل الأول، لما مجموعة 30 دقيقة. خلال "الثانية الواحدة"، استخدام مضخة لعودة إلى سلة "الواحدة والثاني" العودة إلى الخزان لإعادة الإدارة للحفاظ على إعداد الإنزيم النشط. تعيين مضخة العودة إلى أقل من المضخة إلى الخارج (أي 94 مل/دقيقة)، مع الحرص على عدم العودة الجوي المفرط إلى الزجاجة المصدر.
- إذا فواصل الكبسولة الكبد، ويمكن تخفيض هذه المرة.
- إذا كان الكبد لا يهضم تماما (لا تزال مدمل مع ضغط تنسيق لطيف) يمكن أن يؤديها 5 دقائق إضافية التروية.
- أحياناً (تقريبا كل 5 دقائق) الوثيقة درجة الحرارة السطحية فخ فقاعة و/أو الكبد التأكد من خلايا الكبد لا يحصلون على البارد. إذا كان الكبد هو الحصول على البارد (< 35 درجة مئوية) زيادة حرارة حمام الماء لاستعادة درجة حرارة الكبد أقرب إلى 38 درجة مئوية. وينبغي أن الكبد بلانش كعائدات التروية.
- إزالة الكبد إلى لوحة العقيمة أو طبق بيتري للنقل إلى خلية ثقافة هود. تغطي ميدان العقيمة مع ثني عقيمة الحفاظ على سلامة أثناء المعالجة تتمثل.
- يعرض المقطع الكبد من ثني العقيمة وتغرق في الكبد مع تتمثل البارد يغسل وسائط الإعلام (HWM). تعطيل الكبسولة بواسطة سحب المقص عبر الجزء العلوي. ارتداء القفازات المعقمة، بلطف تدليك الكبد إلى إطلاق سراح خلايا الكبد في المتوسط.
- تصفية HWM يحتوي على خلايا الكبد من خلال شاش معقم في زجاجات للطرد المركزي الكبيرة (~ 200 مل). أغسل خلايا الكبد من خلال الإجراء التالي في ثلاث نسخ، الجمع بين بيليه الخلية من الزجاجات متعددة بعد استثارة الأولى (حسب التطبيق):
- أجهزة الطرد المركزي في 50 س ز، دقيقة 5، 4 درجة مئوية.
- نضح وريسوسبيند في 150 مل HWM.
- اترك بيليه في HWM بعد الغسيل 3rd .
- عد تركيز الخلية باستخدام هيموسيتوميتير أو أي جهاز آخر، حسب توافرها. هذه الخلايا جاهزة الآن للتلاعب السابقين فيفو بالاهتمام، بما في ذلك العلاج الجيني، وفرز الخلايا، أو التخصص الأخرى قبل سرطانات. يمكن ضبط الحجم النهائي ل HWM لاستهداف تركيز محدد (خلايا/مل).
4-تتمثل توصيل
- ريسوسبيند خلايا الكبد في وسائل الإعلام (في دولبيكو النسر المعدل المتوسط [دميم]، 10% مصل بقرى الجنين [FBS]، البنسلين والستربتوميسين 4-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك [حبيس]، الديكساميتازون، وعامل نمو البشرة [لو]، وحامض نتبك) في 1-2 ملايين الخلايا كل مل في أنبوب مخروطي على الجليد.
- ذوبان الجليد متجه لينتيفيرال في درجة حرارة الغرفة وإضافة إلى أنبوب مخروطي على الجليد في تعدد 20 هدفا للعدوى (وزارة الداخلية) لربط الخلايا. قم بتدوير الخلايا عند 4 درجة مئوية 10 لفة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة لربط ناقلات الأمراض الفيروسية إلى سطح الخلية.
- نقل أنابيب إلى 37 درجة مئوية عن 30 – 40 دقيقة عكس لخلط كل 5 دقائق لتسهيل ناقل ترانسدوسينج الخلايا منضم.
- الطرد المركزي خلايا في ز x 50 في 4 درجات مئوية للحد الأدنى 4 ريسوسبيند خلية بيليه في المحلول الملحي بتركيز المطلوب على الجليد. كرر هذه المياه والصرف الصحي ضمان التخلص من أي ناقل غير منضم من التحضير.
- إذا كان ذلك ممكناً، لوحة مختبرين كافية من الخلايا (أي، 500,000 الخلايا الواحدة وكذلك في 6 الخلية أيضا لوحة الثقافة) للتحقق من صلاحية، الالتصاق، كفاءة توصيل، إلخ
ملاحظة: من الممكن غالباً لا لتقييم هذه المعلمات قبل سرطانات، خاصة بالنسبة للإجراءات في نفس اليوم. على سبيل المثال، يعمل الإجراء الموضح هنا كدنا فاه مميز تحت سيطرة المروج الخاصة بالكبد أنتيتريبسين ألفا-1، الذي لم يكن أسايابل سهولة في خلايا الكبد قبل الزرع. ومع ذلك، يمكن جزيئي هذه الخلايا مطلي بعد سرطانات كمؤشر على نجاح توصيل (أي، عن طريق النشاف الغربية) أو مؤشرا للنجاح العام للإجراء.
5-تتمثل زرع الأعضاء
- تحديد الوريد البابي عن طريق الموجات فوق الصوتية باستخدام محول 2 إلى 5 ميغاهرتز. المباشر 18 جرام، إبرة 5 بوصة نحو الدانية إلى التشعب في الوريد البابي الرئيسي.
- تبدأ ضخ يدوية بطيئة حتى 1 × 109 خلايا الكبد (حوالي 10 غ) استخدام المحاقن. مراقبة الضغوط المدخل أثناء زرع الأعضاء باستخدام قسطرة ضخ.
- في حالة زيادة الضغوط المدخل أكثر من 8 مم زئبق فوق خط الأساس، توقف ضخ والسماح للضغط من أجل العودة إلى مستويات خط الأساس.
- في حال عدم عودة الضغوط المدخل لخط الأساس بعد الإيقاف المؤقت التسريب لمدة خمس دقائق، وقف التسريب.
- بعد زرع الأعضاء وإزالة القسطرة، استخدام الموجات فوق الصوتية لتقييم لحضور الأحداث الخثاريه وإعادة توجيه تدفق في الوريد البابي.
6-بعد عملية الاسترداد والصيانة
- نقل تخضع منطقة إنعاش سليم ومراقبة حتى الحيوان تماما الإسعافية، رصد معدل ضربات القلب، وتشبع الأكسجين ودرجة حرارة الجسم كل 15 – 30 دقيقة المحافظة على درجة حرارة الجسم ببطانية دافئة أو التفاف تسخين الهواء، حسب الحاجة.
- إدارة اوميبرازول 1 مغ/كغ عن طريق الفم يوميا (من خلال نهاية الدراسة) تقليل فرص تقرح المعدة التي يمكن أن تحدث مع نوبات إينابيتينسي.
- بعد، يراقب عن كثب مختبر والموظفين البيطريين الحيوان وعادة لا يتطلب الدواء الألم إضافية منفصلة من الجرعة البوبرينورفين قبل العملية. إذا كانت علامات الشدة/ألم يتم مراقبتها من قبل الموظفين المؤهلين الرعاية البيطرية (شق حراسة، إينابيتينسي، الخمول)، يمكن أن تدار العوامل المضادة للالتهابات (أي، والايبوبروفين).
7-وصفات
- انظر الجدول 1 للوصفات المستخدمة في هذا البروتوكول.
| كاشف | HWM | كاشف | لدى (10 x) | كل الثاني (10 x) |
| ويليامز-مسحوق ه (غرام/لتر) | 10.8 | كلوريد الصوديوم (g/L) | 83 | 39 |
| ناكو3 (غرام/لتر) | 2.2 | بوكل (غرام/لتر) | 5 | 5 |
| هيبيس (غرام/لتر) | 2.6 | حبيس (غرام/لتر) | 24 | 240 |
| القلم/بكتيريا (100 x، مل/لتر) | 10 | عطا (غرام/لتر) | 9.5 | - |
| مصل الدم البقري الجنين (مل/لتر) | 100 | ن-أسيتيل-L-سيستين | 8 | 8 |
| الأس الهيدروجيني | 7.3 | (ن-أ-ج، غرام/لتر) | ||
| نيتروغليسرين (مل/لتر) | 5 | 5 | ||
| كاكل2 ح 22س (غرام/لتر) | - | 7 | ||
| كولاجيناز د (mg/mL) | - | 0.2 | ||
| الأس الهيدروجيني | 7.4 | 7.6 |
الجدول 1: وصفات للحلول المستخدمة في تتمثل في معزل عن أقسام الكبد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استئصال الكبد وزرع ذاتي تمثيلاً تخطيطياً في الشكل 1. في مجموعة تمثيلية من الخنازير 5 الذي خضع لاستئصال الكبد، وكان معظم غلة > المطلوب 1 × 109 خلايا الكبد مع حوالي 80% البقاء (الجدول 2)، توفير الكثير من الخلايا لأي نوع من أنواع التلاعب، بما في ذلك الجينات العلاج. الثقافة اللاحقة للجزء غير زرع خلايا الكبد المعدة من كل من تلك 5 الخنازير أظهرت جدوى جيدة والالتصاق، مع نموذجية تتمثل مورفولوجيا 46 ساعة بعد توصيل والطلاء الأولى (الشكل 2). هذه النتائج ممثل الإعداد الناجح، في حين أن الإشارة إلى نتائج سيئة مع انخفاض عدد الخلايا أو استمرارية التزام الحد الأدنى من الخلايا في أحادي الطبقة.
عينة من كبد قبل معالجة الخنزير-/- فاهيظهر أي تعبير عن فاه عن طريق إيمونوهيستوتشيميستري (الشكل 3). سوف تختلف انجرافتمينت الأولية بمقدار مجددا خلال زرع الخلايا. عادة ما يكون هو توصيل ترددات للخنزير خلايا الكبد في المختبر باستخدام لينتيفيروس في وزارة الداخلية من طراز تي يو/تتمثل 10 70 – 100%. سيتم توسيع الخلايا انجرافتيد كلونالي في الكبد-/- فاهحتى الكبد الكامل هو إعادة ملء خلايا تم تصحيحه. عينة تمثيلية في 2 و 6 و 12 شهرا إثبات تسلسل زمني لايجابية فاه خلية التوسع، الذي عادة كاملة عند 12 شهرا بعد زرع الأعضاء (الشكل 3). يتوقع حتى نسبة منخفضة من انجرافتمينت repopulate في الكبد، في نهاية المطاف على الرغم من أن معدلات engraftment الأولية الفعلية لا قيمت في هذه التجربة.
الخنازير هي زرع بعد رصدها بعناية لزيادة الوزن، كما فشل تزدهر علامة على أنه لا يكفي تصحيح خلايا الكبد موجودة. وفي هذه الحالة يتم تدوير الحيوانات مرة أخرى على نتبك حسب الحاجة حتى السكان تتمثل تصحيحها كافية للسماح بإكمال الفطام من المخدرات. تقييم تعميم المؤشرات الحيوية توفر وصولاً سهلاً لمتابعة العلاج. متى حققت حيوان حوالي 20% سوف تطبيع تعمير لخلايا الكبد تصحيحها في مستويات الكبد، التيروزين، وسوكسينيلاسيتوني بالمقارنة مع الحيوانات البرية من نوع (الشكل 4 أ). وعلاوة على ذلك، يوضح غير المعالجة أو المعالجة بموجب فاه-/- الخنزير مماثلة التغييرات الكبد تليفية موجودة في البشر المتضررين، والتي يمكن أن تتبعها ماسون لتلطيخ trichrome خزعات المسلسل8. يمكن تقييم علامات بديلة لإصابة الكبد الجارية بالمعايرة تعميم إنزيمات الكبد، مثل اسبارتاتي aminotransferase والفوسفاتيز القلوية. بينما تظهر الحيوانات التي لم يتم تصحيحها ارتفاع كبير في كل من المعلمات مقارنة بالحيوانات البرية نوع، السابقين فيفو العلاج الجيني بإرجاع هذه القيم المصل إلى وضعها الطبيعي (الشكل 4 باء و جيم 4). أخيرا، تعطل الصحة العامة الأيض الكبد في علاج فاه-/- الخنازير، كما يتبين من المرتفعات في تعميم الأمونيا. إعادة تعمير للكبد مع الخلايا المصححة استعادة مستويات البرية من نوع من الأمونيا (الشكل 4).
رقم 1: ظهرت والزرع الذاتي. (اتجاه عقارب الساعة من أعلى) تتم استئصال كبد جزئي عن الموضوع إلى توفير مصدر لخلايا الكبد، وحفز التجدد الكبد. خلايا الكبد معزولة من الكبد ريسيكتيد (الخلايا الزرقاء)، وزرع أوتولوجوسلي مرة أخرى إلى مصدر الحيوان عن طريق ترانسدوسيد السابقين فيفو مع ناقل لينتيفيرال التي تحتوي على التحوير للفائدة (الخلايا براون)، ومن ثم الخلايا ترانسدوسيد حقن الوريد البابي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: خلايا الكبد خنزير الأولية من أقسام الكبد. خلايا الكبد المزروع من ريسيكشنز الكبد من الخنازير مختلفة 5، ترانسدوسيد مع ناقل لينتيفيرال، وسمح لتنمو على ح 48 لإثبات مورفولوجيا والسلامة والنقاء والالتصاق بأطباق الثقافة. في المختبر نوعية عمليات التقييم هذه بمثابة مؤشرات بديلة لاحتمال engraftment ناجحة في فيفو لكل إعداد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: أعد خلايا الكبد المصوبة إسكان فاه-/- الكبد خنزير. Immunohistochemistry فاه من خزعات الكبد 0، 2 و 6 و 12 شهرا بعد العلاج الجيني فيفو السابقين من خلايا الكبد ذاتي. علاج إظهار الخنازير فاه-/- لا فاه-إيجابية الخلايا في الكبد (A). شهرين بعد زرع الأعضاء (ب)، البؤر الفردية لخلايا الكبد إيجابية فاه ينظر إليها، الذي يخضع ثم التوسع لاستبدال 50 – 60% الكبد في 6 أشهر (ج) متبوعاً باستبدال كامل، شهدت في الأشهر 12 (د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الكيمياء الحيوية المصل في 10 أشهر آخر السابقين فيفو العلاج الجيني في الخنازير فاه -/ . 10 أشهر بعد العلاج، التيروزين، اسبارتاتي أمينوترانسفيراسي14، الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) ومستويات الأمونيا هي أقل بكثير من غير المعالجة فاه الحيوانات قاصرة ولا يمكن تمييزها عن مستويات البرية من نوع. تم تحليل البيانات لأهمية استخدام اختبار مان-ويتني U (قيمp كما قدم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| خنزير | مجموع الخلايا (x 106) | تعيش الخلايا (x 106) | صلاحية (%) |
| 1 | 1,381 | 1,160 | 84 |
| 2 | 1,000 | 770 | 77 |
| 3 | 1,213 | 995 | 82 |
| 4 | 789 | 671 | 85 |
| 5 | 1318 | 975 | 74 |
| في المتوسط | 1,140 | 914 | 80 |
| ديف وشارع | 64° | 194 | 5 |
الجدول 2: نتائج تتمثل تمثيلاً من العزلة الأولية من الخنازير 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف هذا التقرير السابقين فيفو جينات ذاتي علاج نهج لعلاج نموذجا الخنزير HT-1. أنها تنطوي ظهرت جزئية، تليها السابقين فيفو تتمثل العزلة وتوصيل لعزل خلايا الكبد بالفيروس لينتي تحمل التحوير التصحيحية. ثم يتم زرع خلايا الكبد ذاتي المصوبة العودة إلى الحيوان فاه قاصرة عن طريق الوريد البابي8. على الرغم من أن الطريقة الموضحة تنطبق على جميع نماذج حيوانية كبيرة مع بعض التعديل، الخنزير تفتقر إلى فاه مزية فريدة من نوعها من بيئة انتقائية للغاية للخلايا المصححة13،15. هذا الأسلوب علاج فعالة لتقنية HT-1، تظهر الحيوانات محسوبة نتبك النمو المستقل مع تطبيع المتحلل قياس نواتج الأيض والتهاب الكبد من المؤشرات الحيوية والوقاية من تليف الكبد والعقود وعكس كاملة من التليف المبكر رأيت مع نتبك ركوب الدراجات. وعلاوة على ذلك، دراسة حديثة تضم قد أثبت التحليل النسيجي واسعة لا يمكن كشفها الخلايا التي لم يتم تصحيحها والتليف وتليف الكبد أو توموريجينيسيتي 3 سنوات بعد العلاج (مخطوطة في الاستعراض). ومع ذلك، يمكن الأداة المساعدة للخلفية فارغة فاه بمثابة أداة للسماح بتقييم مجموعة واسعة من الاستجوابات في تتمثل مؤشرات فسيولوجيا والمرض خارج HT-1.
ويمكن تقييم النجاح النسبي للإجراء بعدد دورات نتبك المطلوبة قبل أن يمكن أن يكون الموضوع الفطام تماما من هذه العقاقير الوقائية. في تكرارات عديدة مع هذا النموذج، وفي نماذج حيوانية أخرى صغيرة HT-1، حوالي 20% تصحيح مطلوب قبل أن يتحقق النمو نتبك المستقلة. ركوب الدراجات الهوائية أكثر مع نتبك يدل على ضعف الأولى engraftment/الجدوى، متقدمة أمراض الكبد في وقت انجرافتمينت الأولية، أو التحوير سوء التعبير، على الرغم من أن عوامل أخرى قد تلعب أيضا دوراً. علامات الكيمياء الحيوية لصحة الكبد (AST و ALT واﻷمونيا) متوفرة بسهولة وتوفر نظرة ثاقبة مدى التوسع تتمثل المصوبة، ولكن ثبت التحقق النهائي من علاج المظهرية أفضل من تطبيع تيروزين المصل و سوكسينيلاسيتوني وتأكيد نسيجية للإعراب عن فاه خلايا الكبد في حالة عدم وجود التليف. وهذا يتحقق عندما الكبد وقد تم إعادة ملء مع خلايا الكبد تم تصحيحه.
فعالية الإجراء تعتمد أكثر على سلامة خلايا الكبد، التي يجب الحفاظ على العقيمة وقابلة للاستمرار طيلة عملية العزل ونقل وزرع الأعضاء. سوف لا الإنقاذ إعادة خلايا الكبد غير قابل للحياة أو التي لم يتم تصحيحها النمط الظاهري، وإجراء غير ناجحة قد يستغرق أشهر لمراقبة هذا الموضوع للتحقق.
في هذا النموذج، التعبير التحوير جيدة إنزيم فاه الفنية شرط الحد أدنى لإعادة تعمير الكبد. لينتيفيروس طريقة واحدة فقط لتقديم نسخة فعالة للتحوير. سيسمح هذا الأسلوب إمكانية استخدام نظم التسليم الأخرى بما في ذلك النظم غير الفيروسية وتلك التي تهدف إلى تحرير العيب الجينوم محددة. في نهاية المطاف، سوف يسمح هذا النموذج لمجموعة واسعة من الاحتمالات، بما في ذلك تصحيح عيوب أخرى في مفاعل حيوي قاصرة فاه. ما دامت الخلية زرع يعرب إنزيم فاه وظيفية، سيكون أيضا نشر أي تعديل آخر من الخلايا السابقين فيفو . هذا سوف يسمح لأي من أخطاء فطرية من الأيض في الكبد تصويب في الخلفية-/- فاه. كما تقوم التوسع في خلايا الكبد تصحيحها في نهاية المطاف في الكبد، يمكن تحقيق الأرقام ذات الصلة لخلايا الكبد لأي مؤشر على المرض، الذي يؤكد على قيمة هذا النموذج والإجراء كالعلوم الأساسية ونموذج العلاج السريري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون دوان [مياكسنر] للخبرة في أداء حقن الوريد البابي، ستيف كراج، جوان بيدرسون، وهيلين لوري للدعم أثناء الإجراءات الجراحية. هذا العمل كان تدعمها مؤسسة مينيسوتا لمستشفى الأطفال و "الطب التجديدي" مينيسوتا. تم تمويل R.D.H. من خلال جائزة DK106056 K01 المعاهد الوطنية للصحة ومركز عيادة مايو كلينيك "جائزة تنمية مهنة الطب التجديدي".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
References
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S.
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
