Summary
Detta protokoll syftar till att beskriva svin hepatocyte isolering och ex vivo gen leverans för att bota modeller av metabola sjukdomar via autolog stamcellstransplantation. Även om just denna modell har unika fördelar som gynnar framgångsrik terapi, är ansökan en relevant grund att ta itu med ytterligare sjukdomar och beteckningar.
Abstract
Genterapi är ett perfekt val att bota många medfödda metabolism i levern. Ex-vivo, lentiviral vektorer har framgångsrikt använts i behandlingen av många hematopoetiska sjukdomar hos människor, eftersom deras användning erbjuder stabil transgenens uttryck vektorn förmåga att integrera i värd genomet. Denna metod visar tillämpningen av ex vivo genterapi av hepatocyter på en stor djurmodell av hereditär tyrosinemi typ jag. Denna process består av 1) isolering av primära hepatocyter från autologa givare/mottagare djuret, 2) ex vivo gen leverans via hepatocyte transduktion med lentiviral vector och 3) autolog transplantation av korrigerade hepatocyter via portalen ven injektion. Framgången med metoden generellt bygger på effektiv och sterila borttagning av den levern resektion, noggrann hantering av exciderad förlagan för isolering av livskraftiga hepatocyter tillräckligt för åter implantation, hög andel transduktion i isolerade celler, och aseptiska kirurgiska ingrepp hela tiden för att förhindra infektion. Tekniskt fel på någon av dessa steg kommer att resultera i låg avkastning av livskraftiga sensorik hepatocyter för autolog transplantation eller infektion av givare/mottagare djuret. Gris modellen av människans typ 1 hereditär tyrosinemi (HT-1) valt för detta synsätt är unikt mottagliga för denna metod, eftersom även en liten andel av engraftment av korrigerade celler kommer att leda till återinsättning av levern med friska celler baserat på en kraftfull selektiv fördel över native-sjuka hepatocyter. Även om denna tillväxt urval inte kommer vara sant för alla indikationer, detta tillvägagångssätt är en stiftelse för expansion till andra indikationer och tillåter manipulering av denna miljö att ta itu med ytterligare sjukdomar, både i levern och bortom, medan Kontrollera för exponering för virala vektorn och möjlighet för off-target toxicitet och tumorigenicitetsprov.
Introduction
Medfödda rubbningar i ämnesomsättningen i levern är en familj av genetiska sjukdomar som kollektivt påverkar så många som 1 i 800 levande födda1. Många av dessa sjukdomar är enda gen defekter2 och funktionellt kan botas genom att införa en enda korrigerad kopia av drabbade genen i ett tillräckligt antal hepatocyter3. Den faktiska procentuella hepatocyter som måste rättas varierar av sjukdom4 och är till stor del beroende på vilken typ av protein det kodar, exempelvis utsöndras proteinerna kontra cytoplasmiska. I de flesta fall är effekten av någon behandling för metabola sjukdomar enkelt analyseras genom närvaron av biomarkörer ofta tillgängliga i cirkulationen.
HT-1 är ett medfött fel av metabolism i levern som resulterar från en defekt i fumarylacetoacetathydrolas hydrolas (FAH)5, sista enzymatiska steg i tyrosin metabolism6. FAH-brist leder till att bygga upp av toxiska metaboliter i levern som kan orsaka akut leversvikt och död eller i den kroniska formen av sjukdomen kan orsaka skrumplever och Hepatocellulär cancer. Sjukdomen är kliniskt förvaltas av administration av 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), en liten molekyl hämmare av ett enzym uppströms av FAH i tyrosin metabolism. Sjukdomen ger en idealisk miljö att testa genterapimetoder, eftersom framgångsrika korrigering av även ett litet antal hepatocyter kommer så småningom leda till återinsättning av hela levern med korrigerade celler i både små och stora djurmodeller 7 , 8. Detta beror på att korrigeras celler har en djupgående överlevnadsfördel över okorrigerad celler på grund av ansamling av toxiska metaboliter i den senare. Förlusten av okorrigerad hepatocyter tillåter selektiv expansion av korrigerade hepatocyter konsekvent med regenerativ kapacitet av levern. Behandling kan enkelt följas genom mätning av minskningen av cirkulerande tyrosin och succinylaceton nivåer efter transplantation.
För att motivera den invasiva karaktären av förfarandet, som omfattar en partiell hepatectomy, måste målet för denna strategi vara ett varaktigt botemedel. Replikering inkompetenta lentiviral vektorer används därför eftersom de stabilt kommer att integreras i den hepatocyte genom9. att säkerställa leverans av korrigerade genen till alla dotterceller som levern växer och expanderar för att ersätta den snabb förlusten av okorrigerad celler. Detta är fördelaktigt över adeno associerade virala vektorer (AAV), som främst finns som episomes som kan endast skickas till en enda dotter cell under Mitos10 därmed förlora någon effekt av terapin i några veckor.
Även om en växande mängd litteratur stöder säkerhet lentivirus11, oro över mildras genotoxiska händelser genom att begränsa transduktion av värdceller till en kontrollerad in vitro- miljö. Gratis vektor introduceras aldrig systemiskt till värden när denna metod utförs, begränsa exponering för de hepatocyter som kommer att återinföras med autolog transplantation via portalen ven.
Denna rapport beskriver metoden för den kirurgiska och ex vivo förfaranden som används för att isolera hepatocyter för gen terapi ex vivo och efterföljande autolog transplantation12 för behandling av HT-1 gris8. Hela processen inkluderar 1) en partiell hepatectomy som fungerar som en källa av hepatocyter och en tillväxt stimulans för värdens levern, 2) isolering av hepatocyter från exciderad levern följt av ex vivo gen korrigering, och slutligen 3) återinförandet av den korrigerade hepatocyter tillbaka till värden. Den beskrivna metoden är tillämplig på alla stora djurmodeller med några ändringar, men endast FAH-brist gris13 kommer att ha fördelen av selektiv miljön för korrigerade hepatocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden var utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och granskas och godkänns av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) före studien beteende. Procedurerna som beskrivs här utfördes på manliga och kvinnliga stor vit gård svin (50% Landrace/50% stora vita genetisk bakgrund) upp till 3 månaders ålder som anses friska och lämpar sig för kirurgi. Djuren hålls socialt såvida anses oförenlig av institutionella veterinärvård personal. Djuren skall utfodras lämpliga nivåer av chow två gånger dagligen och observerades för kliniska tecken av vårdpersonalen minst en gång dagligen.
1. förberedelser inför kirurgi
- Administrera 5 mg/kg telazol och 2 mg/kg xylazin intramuskulärt för att framkalla sedering. Administrerar buprenorfin SR subkutant med en dos på 0,18 mg/kg för postoperativ analgesi (förväntade analgesi från denna dos kommer att vara upp till 72 h). Kontrollera manuellt djuret för Svaren till verifierar sedering.
- När drogad, infoga en intravenös kateter i en perifer öra ven för farmakologiska åtkomst.
- Administrera intravenös 25 mg/kg cefazolin och intramuskulär 5 mg/kg av ceftiofur före ingreppet.
- Administrera fysiologisk koksaltlösning intravenöst för att hålla blodtrycket och hjärtfrekvensen inom normala fysiologiska gränser under hela förfarandet.
- Placera en orogastric röret för att packa upp magen. Utföra endotrakeal intubering med en lämplig storlek endotrakealtub, kontrollera lämplig placering genom att komprimera bröstkorgen manuellt för att påvisa utandning och sedan mekaniskt ventilera djuret med 1 – 3% isofluran.
- Placera leder elektrokardiogram (EKG), blodtryck manschett, temperatursond och pulsoximeter-att övervaka och registrera vitala tecken. Placera djuret i ryggläge, skrubba buken från bröstkorgen till bäckenet med betadine och drapera sterilely.
- Ventilera ämne med 1-3% isofluran under förfarandet för att upprätthålla ett kirurgiskt plan av anestesi. Fortsätta att övervaka vitala tecken för förändringar och justera isofluran för att bibehålla pulsen vid före incision nivåer om blodtryck sjunker dramatiskt, minska isofluran och initiera institutionellt-godkända agenter att återställa vitalitet, såsom intravenöst adrenalin.
- Registrera hjärtfrekvens, respiration klassar, blodtryck och kroppstemperatur på ett kirurgiskt ingrepp-post för att spåra och bevara djurskydd enligt institutspecifika policy att säkerställa överensstämmelse med stora djurskyddsnormer.
2. laparoskopisk partiell Hepatectomy
- Utföra inledande inskeppningshamnen webbplats med öppen Hassen teknik cephalad till umbilicus. När bukhinnan visualiseras, säkert införa en 12 mm troakar i bukhålan. Passera en 5 mm, 30°, räckvidd genom denna port.
- Insufflate buken med CO2 till 15 mmHg. Under direkt visualisering med laparoskopisk kameran, placera två ytterligare 5 mm portar triangulera på den vänstra laterala LOB i levern. Exakt placering av hamnarna beror på storlek och anatomi av djuret.
- Vid denna punkt, placera laparoskop i en av portarna 5 mm.
- Identifiera den vänstra laterala segmentet av levern vid tidpunkten för den största sprickan i vänster LOB. Denna spricka separerar segmenten medicinsk och vänster laterala. Säkra portal strukturer tillsammans med den nedsatt ven längs denna spricka med en kirurgisk häftapparat (se Tabell för material). Transekt parenkymet genom denna spricka med sekventiell skottlossningar från häftapparat med 60, 45 eller 30 mm lång vaskulär laster.
- När parenkymal resektion är klar, bedöma kvarleva levern för att säkerställa adekvat hemostas. Styr någon blödning från parenkymet med diatermi eller sutur.
- Hämta avsnittet lever med endoskopisk greppare och en endoskopisk vävnad hämtning väska.
- Ta bort portar och Stäng 12 mm port snittet i tre lager med avbrutna storlek 0 sutur för mittlinjen fascian, en kör 2-0 sutur för djupa dermala skiktet och en kör 4-0 sutur för resorberbar skiktet. 5 mm portar kan vara stängt i ett lager med 2-0.
- Placera ett sterilt förband på de snitt (se Tabell för material).
- När celler kommer att vara redo i mindre än 4 timmar, behålla djuren under narkos postoperativt fram till tidpunkten för autotransplantation.
- Alternativt, om cell manipulationer kräver längre perioder (till exempel tillåta bildandet av hepatocyte spheroids eller längre transduktion/urval perioder baserat på enskilda tillämpningar av denna metod) tillåter djuret att återhämta sig från anestesi och upprepa den bedövningsmedel induktion steg före autotransplantation när cellerna är redo.
3. hepatocyte isolering
- Anslut en Peristaltisk pump med perfusion att leverera varm dispersion lösningar (underhålls i 43 ° C vattenbad) till katetrar placeras i avsnittet lever stora utsatta fartyg så att lösningen temperatur är 38 ° C vid introduktion till vävnaden. Alla slangar, utrustning och lösningar måste bibehållas steril att säkerställa cellerna är lämplig för transplantation.
- Prime pump och slangar med Per II upp till en Avstängningskranen positionerade för att växla mellan Per jag och Per II leverans till vävnaden. Växla Avstängningskranen till Per jag placera och prime resten av slangar set, fylla en kabelmonterad bubbelfälla helt för att förhindra att införa luftbubblor i vävnaden.
- Förbered en ren tvärgående skär vinkelrätt till det hepatiska blodflödet att avslöja tvärsnitt av portalen ven grenar och nedsatt vener för kateterisering.
- Catheterize finns utsatta venerna med en tätt åtsittande kateter att undvika läckage av perfusatet. Cannulate minst 1 portal och 1 nedsatt ven att säkerställa adekvat perfusion av vävnad.
- Se till att catheter(s) primade/fri luft innan du placerar katetern en ven.
- BEGJUTA med varm Per I 100 mL/min, flytta outlet röret från ven till ven varje 30 sekunder till 1 min. cykel genom alla tillgängliga vener för 15 – 20 min. Per I infusion, Ställ in under en evakuering tube att tömma förfarande facket i en avfallsbehållare under vakuum.
- Växla till Per II på 100 mL/min, cykling genom venerna som med Per I, för totalt 30 min. Under Per II, använda en återvändande pump för att återvinna Per II tillbaka till behållaren för återadministrering att bevara beredning av aktiva enzymet. Ställ tillbaka pumpen till mindre än utflödet pumpen (dvs 94 mL/min), var noga med att inte återvända överdriven luft till källa flaskan.
- Om levern kapseln går sönder, kan denna tid minskas.
- Om levern inte är helt smält (inte förblir dimpled med mild focal Press) en ytterligare 5 min av perfusion kan utföras.
- Ibland (ungefär var 5: e minut) dokumentera yttemperatur bubbelfälla eller levern att säkerställa hepatocyterna inte blir kall. Om levern blir kall (< 35 ° C) öka värmen i vattenbadet återställa levern temperaturen närmare till 38 ° C. Levern bör blanche som perfusionen fortsätter.
- Ta bort levern till steril platta eller petriskål för transport till cell kultur huva. Täcka sterila fältet med en steril draperi att upprätthålla integritet under hepatocyte bearbetningen.
- Exponera avsnittet lever från steril duk och doppa levern med kall hepatocyte wash media (HWM). Störa kapseln genom att dra sax över toppen. Sterila handskar, massera varsamt levern att släppa hepatocyterna i mediet.
- Filtrera den HWM innehållande hepatocyter via steril kompress i stora (~ 200 mL) centrifug flaskor. Tvätta hepatocyterna via följande procedur i tre exemplar, kombinera cellpelleten från flera flaskorna efter första resuspension (om tillämpligt):
- Centrifugera vid 50 x g, 5 min, 4 ° C.
- Aspirera och återsuspendera i 150 mL HWM.
- Lämna pelleten i HWM efter 3rd tvätten.
- Räkna cellkoncentrationen med en hemocytometer eller annan enhet, som tillgänglig. Dessa celler är nu redo för ex vivo manipulation av intresse, inklusive genterapi, cell sortering eller annan specialisering före autotransplantation. Slutvolymen av HWM kan justeras för att rikta en viss koncentration (celler/mL).
4. hepatocyte transduktion
- Återsuspendera hepatocyter i media (Dulbeccos modifierade eagle medium [DMEM], 10% fetalt bovint serum [FBS], Penicillin-Streptomycin, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra [HEPES], dexametason, epidermal tillväxtfaktor [EGF] och NTBC) på 1 – 2 miljoner celler per mL i ett koniskt rör på is.
- Tina lentiviral vektor vid rumstemperatur och tillsätt i koniska rör på isen vid målet 20 multiplicity av infektion (MOI) för att binda cellerna. Rotera celler vid 4 ° C på 10 rpm i 90 min binda virala vektorn till cellytan.
- Överföra rören till 37 ° C i 30 – 40 min. Invertera att blanda varje 5 minuter för att underlätta vektorn transducing bundna cellerna.
- Centrifugera celler vid 50 x g vid 4 ° C i 4 min. Omsuspendera cellpelleten i saltlösning vid önskad koncentration på is. Upprepa denna tvätt för att säkerställa borttagande av varje obundna vektor från förberedelse.
- Om möjligt, tallrik tillräckliga portioner av celler (dvs. 500 000 celler per brunn i ett 6 cell väl kultur plattan) att kontrollera vidhäftning, transduktion effektivitet, lönsamhet, osv
Obs: Det är ofta inte möjligt att bedöma dessa parametrar före autolog, särskilt för samma dag förfaranden. Det förfarande som beskrivs häri anställd exempelvis ett otaggat Fah cDNA under kontroll av alfa-1 antitrypsin levern-specifika promotorn, vilket inte var lätt assayable i hepatocyter före transplantation. Dessa guldpläterade celler kan dock analyseras efter autotransplantation som en indikator på framgång för transduction (dvs. via Western blotting) eller en prediktor för den allmänna framgången av förfarandet.
5. hepatocyte Transplantation
- Identifiera portalen ven via ultraljud använder en givare med 2 till 5 MHz. Direkt en 18 G, 5 tums nålen mot huvudsakliga portalen ven proximalt dess bifurkation.
- Börja långsamt manuell infusion av upp 1 x 109 hepatocyter (ca 10 g) med hjälp av en spruta. Övervaka portal tryck under transplantation med hjälp av en infusion kateter.
- Om portal trycket ökar mer än 8 mmHg över baslinjen, pausa infusion och låt trycket att återgår till baslinjenivåerna.
- Om portal tryck inte tillbaka till utgångsvärdet efter paus infusion i fem minuter, avbryta infusionen.
- Efter transplantation och katetern avlägsnats, använda Ultraljudet att utvärdera för närvaro av trombotiska händelser och framåt flödet i portalen ven.
6. postoperativ återhämtning och underhåll
- Flytta föremål för en tillfredsställande återvinning område och observera tills djuret är fullt ambulatory, övervakning puls, syremättnad och kroppstemperatur varje 15 – 30 min. upprätthålla kroppstemperaturen med varma filtar eller en luft-uppvärmd sjal, som behövs.
- Administrera 1 mg/kg omeprazol genom munnen dagligen (fram till slutet av studien) för att minska risken för magsår som kan uppstå med anfall av aptitlöshet.
- Postoperativt, djuret övervakas noggrant av lab och veterinära personalen och vanligtvis kräver inte ytterligare smärtstillande separat från preoperativ buprenorfin dosen. Om tecken på ångest/smärta observeras av kvalificerad veterinärvård personal (snitt vaktar, aptitlöshet, slöhet), kan antiinflammatoriska medel (dvs. karprofen) ges.
7. recept
- Se tabell 1 för recept som används i detta protokoll.
| Reagens | HWM | Reagens | Per I (10 x) | Per II (10 x) |
| Williams-E pulver (g/L) | 10,8 | NaCl (g/L) | 83 | 39 |
| NaHCO3 (g/L) | 2.2 | KCl (g/L) | 5 | 5 |
| HEPES (g/L) | 2.6 | HEPES (g/L) | 24 | 240 |
| Penna/Strep (100 x, mL/L) | 10 | EGTA (g/L) | 9,5 | - |
| Fetalt bovint Serum (mL/L) | 100 | N-acetyl-L-cystein | 8 | 8 |
| pH | 7,3 | (N-A-C, g/L) | ||
| Nitroglycerin (mL/L) | 5 | 5 | ||
| CaCl2 2 H2O (g/L) | - | 7 | ||
| Kollagenas D (mg/mL) | - | 0,2 | ||
| pH | 7,4 | 7,6 |
Tabell 1: Recept för lösningar som används i Hepatocyte isolering från levern sektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De lever resektion och autolog transplantation är representerade schematiskt i figur 1. I en representativ kohort av 5 grisar som genomgick nedsatt resektion, de flesta hade avkastningarna av > 1 x 109 hepatocyter med cirka 80% viabilitet (tabell 2), vilket ger gott om celler för någon typ av önskad manipulationer, inklusive gen terapi. Efterföljande kultur av den icke-transplanterade delen av beredda hepatocyter från var och en av dessa 5 svin visade god lönsamhet och vidhäftning, med typiska hepatocyte morfologi 46 timmar efter transduktion och inledande plätering (figur 2). Dessa resultat är representativa för en framgångsrik beredning, medan dåliga resultat skulle anges med lågt antal celler, livskraft eller minimal följsamhet av celler i en enskiktslager.
En leverbiopsi före behandling av Fah- / - grisen visar inga uttryck för FAH via immunohistokemi (figur 3). Inledande engraftment varierar beroende på mängden celler återinfört under transplantation. Transduktion frekvenser av svin hepatocyter in vitro- som använder lentivirus på en MOI av 10 TU/hepatocyte är vanligtvis 70 – 100%. Engrafted cellerna kommer klonalt expandera i Fah- / - levern tills hela levern fylls av korrigerade celler. Representativa biopsier på 2, 6 och 12 månader visar en tidslinje över FAH-positiv cell expansion, vilket är normalt klar vid 12 månader efter transplantation (figur 3). Även en låg andel engraftment skulle förväntas så småningom återbefolka levern, även om faktiska ursprungliga engraftment priser inte utvärderades i detta experiment.
Grisar är noggrant övervakade efter transplantation för viktökning, eftersom underlåtenhet att blomstra är ett tecken på att inte tillräckligt korrigeras hepatocyter är närvarande. I detta fall är djur cyklade tillbaka på NTBC tills den korrigera hepatocyte befolkningen är tillräcklig för att möjliggöra fullständig avvänjning från drogen. Utvärdering av cirkulerande biomarkörer ger enkel åtkomst för att följa behandlingen. När ett djur har uppnått ca 20% återinsättning av korrigerade hepatocyter i levern, tyrosin och succinylaceton nivåer kommer att normalisera jämfört med vilda djur (figur 4A). Dessutom visar under-behandlade eller obehandlade Fah- / - gris liknande fibrotiska leverförändringar hos drabbade människor, vilket kan följas av Massons trikrom färgning av seriell biopsier8. Surrogatmarkörer för pågående leverskada kan utvärderas av testmetoder cirkulerande leverenzymer, såsom aspartataminotransferas och alkaliskt fosfatas. Medan okorrigerad djur visar betydande höjd i båda parametrarna jämfört med vildtyp djur, återgår ex vivo genterapi dessa serum värden till normal (figur 4B och 4 C). Slutligen störs lever metaboliska allmänhälsa hos obehandlade Fah- / - svin, som indikeras av förhöjda cirkulerande ammoniak. Återinsättning av levern med korrigerade celler återställer vildtyp nivåer av ammoniak (figur 4 d).
Figur 1: Hepatectomy och autolog Transplantation. (Medurs uppifrån) En partiell lever resektion utförs på motivet för att ge en källa av hepatocyter och stimulera levern regenerering. Hepatocyter är isolerade från opererande levern (blå celler), sensorik ex vivo med lentiviral vector som innehåller transgenens sevärdheter (brun celler), och sedan transduced cellerna transplanteras autologously tillbaka till källan djuret via portalen ven injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: primära gris hepatocyter från levern sektioner. Hepatocyter var odlade från levern resektioner från 5 olika grisar, sensorik med lentiviral vector och tillåts växa för 48 h att demonstrera morfologi, livskraft, renhet och vidhäftning till kultur rätter. Dessa in vitro- kvalitativa bedömningar fungera som surrogat indikatorer för sannolikheten för framgångsrik engraftment i vivo för tillredningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Korrigerade hepatocyter återbefolka Fah- / - gris levern. FAH immunohistokemi från leverbiopsier 0, 2, 6 och 12 månader efter ex vivo genterapi av autologa hepatocyter. Obehandlade Fah- / - svin Visa inga FAH-positiva celler i levern (A). Två månader efter transplantation (B), ses enskilda foci av FAH positiva hepatocyter, som sedan genomgår expansion att ersätta 50 – 60% av levern vid 6 månader (C) följt av komplett ersättning, sett på 12 månader (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Serumbiokemi på 10 månader post ex vivo genterapi i Fah - / - grisar. 10 månader efter behandling, tyrosin, aspartataminotransferas14, alkaliskt fosfatas (ALP) och ammoniaknivåerna är betydligt lägre än obehandlade FAH bristfällig djur och är omöjlig att skilja från vildtyp nivåer. Data analyserades för betydelse i Mann-Whitney U test (p -värden som presenteras). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Gris | Totalt celler (x 106) | Levande celler (x 106) | Lönsamhet (%) |
| 1 | 1 381 | 1 160 | 84 |
| 2 | 1 000 | 770 | 77 |
| 3 | 1 213 | 995 | 82 |
| 4 | 789 | 671 | 85 |
| 5 | 1318 | 975 | 74 |
| Genomsnitt | 1 140 | 914 | 80 |
| St-Dev | 64° | 194 | 5 |
Tabell 2: Representativa hepatocyte resultat från primära isoleringar från 5 svin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna rapport beskriver en ex vivo autolog gen terapi metod för att bota en svin modell av HT-1. Det handlar om en partiell hepatectomy, följt av ex vivo hepatocyte isolering och transduktion av isolerade hepatocyter med lenti virus bär den korrigerande transgenens. Korrigerade autolog hepatocyter transplanteras sedan tillbaka till FAH bristfällig djuret via portvenen8. Även om den beskrivna metoden är tillämplig på alla stora djurmodeller med några ändringar, har FAH-brist grisen den unika fördelen av en mycket selektiv miljö för korrigerade celler13,15. Denna metod är ett effektivt botemedel för HT-1, som doserade djuren Visa NTBC oberoende tillväxt med normalisering av biokemiskt uppmätta metaboliter och inflammatorisk leversjukdom biomarkörer, förebyggande av cirros och HCC och fullständig återföring av tidig fibros ses med NTBC cykling. Dessutom en nyare studie som inbegriper omfattande histologisk analys visat inga detekterbara okorrigerad celler, fibros, cirros eller tumorigenicitetsprov 3 år bokföra terapi (manuskript i review). Nyttan av FAH-null bakgrunden kan dock fungera som ett verktyg för att möjliggöra bedömning av ett brett spektrum av förhör under hepatocyte fysiologi och sjukdom indikationer bortom HT-1.
Relativa framgång av förfarandet kan utvärderas av antalet cykler av NTBC krävs innan ämnet kan vara helt avvanda från detta skyddande läkemedel. I många iterationer med denna modell och i andra små djurmodeller av HT-1 krävs cirka 20% korrigering innan NTBC oberoende tillväxt uppnås. Mer cykling med NTBC är ett tecken på dålig inledande engraftment/livskraft, avancerad leversjukdom vid tidpunkten för inledande engraftment eller dålig transgenens uttryck, även om andra faktorer kan också spela en roll. Biokemiska markörer för lever hälsa (ASAT, ALAT och ammoniak) är lätt tillgängliga och inblick i omfattningen av korrigerade hepatocyte expansion, men slutlig verifiering av fenotypiska bota bevisas bäst av normalisering av serum tyrosin och succinylaceton och histologisk bekräftelse av FAH-uttryckande hepatocyter i avsaknad av fibros. Detta uppnås när levern har varit nyinsatta med korrigerade hepatocyter.
Effekten av förfarandet är tyngst beroende av integriteten hos de hepatocyter, som måste bibehållas steril och livskraftiga genom hela isolering, transduktion och transplantation processen. Återinförandet av icke-viabla eller okorrigerad hepatocyter kommer inte rädda fenotypen, och ett misslyckat förfarande kunde ta månader angående observation att verifiera.
I denna modell är bra transgenens uttryck av enzymet funktionella FAH ett minimikrav för levern återinsättning. Lentivirus är bara ett sätt att leverera en effektiv kopia av transgenens. Denna metod kommer att ge möjlighet för användning av andra leveranssystem inklusive icke-virala system och de syftar till att redigera specifika genetiska defekten. Slutligen, denna modell möjliggör en mängd olika möjligheter, inklusive korrigering av andra defekter i den FAH bristfällig bioreaktor. Så länge den transplanterade cellen uttrycker en fungerande FAH-enzym, skulle någon annan ändring av den celler ex vivo också spridas. Detta skulle göra det möjligt för någon av de medfödda rubbningar i ämnesomsättningen av levern för att korrigeras i FAH- / - bakgrunden. Utbyggnaden av korrigerade hepatocyter förses i slutändan levern, kan relevanta numren av hepatocyter för någon sjukdom indikation uppnås, som understryker värdet av denna modell och förfarande som grundläggande vetenskap och prekliniska terapi modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Duane Meixner för expertis inom utför den portalen ven injektion, Steve Krage, Joanne Pederson och Lori Hillin för stöd under de kirurgiska ingrepp. Detta arbete stöds av Children's Hospital of Minnesota Foundation och regenerativ medicin Minnesota. R.D.H. finansierades genom en NIH K01 DK106056 utmärkelse och en Mayo Clinic Center för regenerativ medicin karriär Development Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
References
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S.
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
