Summary
इस प्रोटोकॉल को ऑटोलॉगस कोशिका प्रत्यारोपण के माध्यम से चयापचय रोगों के मॉडल का इलाज करने के लिए सुअर का hepatocyte अलगाव और पूर्व vivo जीन डिलीवरी का वर्णन करने के लिए करना है । हालांकि इस विशेष मॉडल है कि सफल चिकित्सा एहसान अद्वितीय लाभ प्राप्त है, आवेदन एक प्रासंगिक करने के लिए अतिरिक्त बीमारियों और संकेत पता नींव है ।
Abstract
जीन थेरेपी जिगर के चयापचय के कई अजन्मा त्रुटियों का इलाज करने के लिए एक आदर्श विकल्प है । पूर्व vivo, lentiviral वैक्टर सफलतापूर्वक मानव में कई टेम रोगों के उपचार में इस्तेमाल किया गया है, के रूप में उनके उपयोग स्थिर transgene है वेक्टर को मेजबान जीनोम में एकीकृत करने की क्षमता के कारण अभिव्यक्ति प्रदान करता है । इस विधि हेपैटोसाइट्स के पूर्व vivo जीन थेरेपी के आवेदन वंशानुगत tyrosinemia प्रकार I के एक बड़े पशु मॉडल को दर्शाता है । इस प्रक्रिया के होते है 1) ऑटोलॉगस दाता से प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के अलगाव/प्राप्तकर्ता पशु, 2) एक lentiviral वेक्टर के साथ hepatocyte transduction के माध्यम से पूर्व vivo जीन डिलिवरी, और 3) पोर्टल के माध्यम से सही ऑटोलॉगस के हेपैटोसाइट्स प्रत्यारोपण नस इंजेक्शन । विधि की सफलता आम तौर पर जिगर लकीर के कुशल और बाँझ हटाने पर निर्भर करता है, व्यवहार्य हेपैटोसाइट्स के अलगाव के लिए पर्याप्त engrafting, अलग कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत transduction के लिए अपर्याप्त के लिए उत्पाद का नमूना हैंडलिंग, और अपूतित संक्रमण को रोकने के लिए भर में शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं । इन कदमों में से किसी पर तकनीकी विफलता ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण या दाता के संक्रमण के लिए व्यवहार्य transduced हेपैटोसाइट्स की कम उपज में परिणाम होगा/ मानव प्रकार के सुअर मॉडल 1 वंशानुगत tyrosinemia (एचटी-1) इस दृष्टिकोण के लिए चुना विशिष्ट इस तरह के एक विधि के लिए उत्तरदाई है, के रूप में भी सही कोशिकाओं के engraftment का एक छोटा सा प्रतिशत स्वस्थ एक शक्तिशाली के आधार पर कोशिकाओं के साथ जिगर की जनसंख्या को बढ़ावा मिलेगा देशी-रोगग्रस्त हेपैटोसाइट्स पर चुनिंदा लाभ. हालांकि यह वृद्धि चयन सभी संकेतों के लिए सही नहीं होगा, यह दृष्टिकोण अंय संकेतों में विस्तार के लिए एक नींव है और इस पर्यावरण के हेरफेर के लिए अनुमति देता है के लिए अतिरिक्त रोगों का पता, दोनों जिगर के भीतर और परे, जबकि बंद लक्ष्य विषाक्तता और tumorigenicity के लिए वायरल वेक्टर और अवसर के लिए जोखिम के लिए नियंत्रित.
Introduction
जिगर के चयापचय की जन्मजात त्रुटियां आनुवंशिक रोगों के एक परिवार है कि सामूहिक रूप से प्रभावित के रूप में कई के रूप में 1 में ८०० जीवित जंमों1। इन रोगों के कई एकल जीन दोष2 और कार्यात्मक हेपैटोसाइट्स3की एक पर्याप्त संख्या में प्रभावित जीन की एक भी सही प्रतिलिपि शुरू करने से ठीक हो सकता है । हेपैटोसाइट्स को सही करने की जरूरत है कि वास्तविक प्रतिशत रोग4 से भिन्न होता है और काफी हद तक यह encodes प्रोटीन की प्रकृति पर निर्भर है, उदाहरण के लिए, cytoplasmic बनाम प्रोटीन उत्सर्जित. ज्यादातर मामलों में, चयापचय रोग के लिए किसी भी उपचार की प्रभावकारिता आसानी से रक्त परिसंचरण में अक्सर उपलब्ध की उपस्थिति के माध्यम से परख की जाती है ।
एचटी-1 fumarylacetoacetate hydrolase (फह)5, tyrosine चयापचय6में पिछले एंजाइमी कदम में एक दोष से परिणाम है कि जिगर के चयापचय का एक अजन्मा त्रुटि है । फह कमी जिगर में विषाक्त चयापचयों के निर्माण की ओर जाता है कि तीव्र जिगर की विफलता और मौत या रोग के जीर्ण रूप में पैदा कर सकता है सिरोसिस और hepatocellular कार्सिनोमा पैदा कर सकता है । रोग चिकित्सकीय 2 के प्रशासन द्वारा प्रबंधित किया जाता है-(2-नाइट्रो-4-trifluoromethylbenzoyl)-1, 3-cyclohexanedione (NTBC), tyrosine चयापचय में फह के एक एंजाइम नदी के ऊपर एक छोटे से अणु अवरोधक । रोग एक आदर्श वातावरण में जो जीन चिकित्सा विधियों का परीक्षण करने के लिए, हेपैटोसाइट्स की भी एक छोटी संख्या के सफल सुधार के रूप में अंततः दोनों छोटे और बड़े पशु मॉडल में सही कोशिकाओं के साथ पूरे जिगर की जनसंख्या में परिणाम होगा प्रदान करता है 7 , 8. यह तब होता है क्योंकि सही कोशिकाओं के बाद में विषाक्त चयापचयों के संचय के कारण सुधारित कोशिकाओं पर एक गहरा अस्तित्व का लाभ है । सुधारित हेपैटोसाइट्स की हानि जिगर की अपक्षयी क्षमता के अनुरूप सही हेपैटोसाइट्स के चयनात्मक विस्तार के लिए अनुमति देता है । उपचार आसानी से परिसंचारी tyrosine और succinylacetone स्तर के बाद प्रत्यारोपण में कमी को मापने के द्वारा पीछा किया जा सकता है ।
आदेश में प्रक्रिया है, जो एक आंशिक hepatectomy शामिल की इनवेसिव प्रकृति का औचित्य साबित करने के लिए, इस दृष्टिकोण का लक्ष्य एक टिकाऊ इलाज होना चाहिए । इसलिए, प्रतिकृति अक्षम lentiviral वैक्टर उपयोग किया जाता है क्योंकि वे छुरा hepatocyte जीनोम9में एकीकृत करेंगे । सभी बेटी कोशिकाओं को सही जीन के वितरण सुनिश्चित करने के रूप में जिगर बढ़ता है और सुधार कोशिकाओं के तेजी से नुकसान की जगह फैलता है । इस adeno जुड़े वायरल (AAV) वैक्टर, जो मुख्य रूप से episomes है कि केवल10 बँटवारा के दौरान एक ही बेटी सेल को पारित कर सकते है जिससे सप्ताह के एक मामले में चिकित्सा के किसी भी प्रभाव के रूप में मौजूद है पर लाभप्रद है ।
हालांकि साहित्य की बढ़ती शरीर11lentivirus की सुरक्षा का समर्थन करता है, genotoxic घटनाओं पर चिंताओं को एक नियंत्रित इन विट्रो वातावरण में मेजबान कोशिकाओं के transduction सीमित द्वारा कम कर रहे हैं । मुक्त वेक्टर कभी नहीं प्रणालीबद्ध मेजबान के लिए शुरू की है जब इस विधि का प्रदर्शन किया है, हेपैटोसाइट्स है कि फिर से किया जाएगा के लिए जोखिम सीमित पोर्टल नस के माध्यम से ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण के साथ शुरू की ।
इस रिपोर्ट में शल्य चिकित्सा और पूर्व vivo के लिए जीन थेरेपी के लिए हेपैटोसाइट्स अलग करने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं की विधि का वर्णन है vivo और बाद में एचटी-1 सुअर8के उपचार के लिए ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण12 . पूर्ण प्रक्रिया शामिल है 1) एक आंशिक hepatectomy कि हेपैटोसाइट्स के एक स्रोत के रूप में कार्य करता है और मेजबान के जिगर के लिए एक वृद्धि उत्तेजना, 2) उत्पादेड जिगर से पूर्व vivo जीन सुधार के बाद से हेपैटोसाइट्स के अलगाव, और अंत में 3) के पुनर्परिचय वापस मेजबान में हेपैटोसाइट्स सही । वर्णित विधि कुछ संशोधन के साथ सभी बड़े पशु मॉडलों के लिए लागू है, लेकिन केवल फह की कमी सुअर13 सही हेपैटोसाइट्स के लिए चयनात्मक वातावरण का लाभ होगा ।
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Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अध्ययन करने से पहले की समीक्षा की और अनुमोदित किया गया आचरण । प्रक्रियाओं यहां वर्णित पुरुष और महिला बड़े सफेद खेत सूअरों पर प्रदर्शन किया गया (५०% Landrace/50% बड़ी सफेद आनुवंशिक पृष्ठभूमि) को स्वस्थ और शल्य चिकित्सा के लिए उपयुक्त समझा रहे है कि उंर के 3 महीने के लिए । पशु सामाजिक रूप से जब तक संस्थागत पशु चिकित्सा देखभाल कर्मचारियों द्वारा असंगत माना जाता है । जानवरों चाउ के उचित स्तर पर दो बार खिलाया और दैनिक देखभाल स्टाफ द्वारा नैदानिक लक्षण के लिए मनाया जाता है ।
1. सर्जरी के लिए तैयारी
- प्रशासन 5 मिलीग्राम/किलो telazol और 2 मिलीग्राम/xylazine पेशी बेहोशी पैदा करने के लिए । प्रशासन buprenorphine SR की एक खुराक पर चमड़े के नीचे ०.१८ मिलीग्राम/kg के लिए पोस्ट ऑपरेटिव analgesia (इस खुराक से प्रत्याशित analgesia ७२ ज तक हो जाएगा) । मैंयुअल रूप से प्रतिक्रिया के लिए जानवर की जांच बेहोश करने की क्रिया ।
- एक बार बेहोश, औषधीय पहुंच के लिए एक परिधीय कान नस में एक नसों कैथेटर डालें ।
- प्रशासन ने नसों में 25 मिलीग्राम/किग्रा cefazolin और इंट्रामस्क्युलर 5 मिलीग्राम/किग्रा ceftiofur पूर्व-ऑपरेटिव ।
- नसों में सामांय खारा प्रशासन प्रक्रिया भर में सामांय शारीरिक सीमा के भीतर रक्तचाप और दिल की दर रखने के लिए ।
- एक orogastric ट्यूब पेट दबाव हटाना करने के लिए जगह है । एक उचित आकार endotracheal ट्यूब के साथ endotracheal इंटुबैषेण प्रदर्शन, समाप्ति का पता लगाने के लिए मैन्युअल छाती को संपीड़ित करके उचित स्थान की पुष्टि, और फिर यांत्रिक रूप से 1 – 3% isoflurane के साथ पशु हवादार.
- प्लेस इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम (ईसीजी) बिक्रीसूत्र, रक्तचाप कफ, तापमान की जांच, और पल्स-oximeter की निगरानी और महत्वपूर्ण संकेत रिकॉर्ड करने के लिए । एक लापरवाह स्थिति में पशु प्लेस, रिब पिंजरे से पेट साफ़ betadine के साथ श्रोणि के लिए, और कपड़े sterilely ।
- प्रक्रिया के दौरान 1-3% isoflurane के साथ विषय वेंटिलेशन संज्ञाहरण के एक सर्जिकल विमान बनाए रखने के लिए । परिवर्तन के लिए महत्वपूर्ण संकेत की निगरानी करने के लिए जारी रखें और तदनुसार isoflurane समायोजित हृदय की दर को बनाए रखने के लिए पूर्व चीरा के स्तर पर अगर रक्तचाप नाटकीय रूप से गिरता है, कम isoflurane और आरंभ करने के लिए संस्थागत-अनुमोदित एजेंटों जीवन शक्ति, बहाल करने के लिए जैसे नसों में एड्रेनालाईन ।
- रिकॉर्ड दिल दर, श्वसन दर, रक्तचाप, और एक शल्य प्रक्रिया रिकॉर्ड पर शरीर के तापमान को ट्रैक और संस्था के अनुसार पशु कल्याण को बनाए रखने के लिए विशेष नीति के लिए बड़े पशु कल्याण मानकों का अनुपालन सुनिश्चित करते हैं ।
2. लेप्रोस्कोपिक आंशिक Hepatectomy
- नाभि करने के लिए cephalad खोलें हेसेन तकनीक का उपयोग कर प्रारंभिक पोर्ट साइट प्रविष्टि निष्पादित करें । जब योनि, सुरक्षित रूप से उदर गुहा में एक 12 मिमी trocar परिचय । इस बंदरगाह के माध्यम से एक 5 मिमी, 30 डिग्री, गुंजाइश पास ।
- Insufflate के साथ पेट को2 से 15 mmHg । लेप्रोस्कोपिक कैमरा के साथ प्रत्यक्ष दृश्य के तहत, जिगर के बाईं पार्श्व पालि पर दो अतिरिक्त 5 मिमी बंदरगाहों triangulating जगह है । बंदरगाहों की सटीक स्थान आकार और जानवर के शरीर रचना विज्ञान पर निर्भर करेगा ।
- इस बिंदु पर, 5 मिमी बंदरगाहों में से एक में लेप्रोस्कोप प्लेस ।
- बाएं पालि के प्रमुख विदर के बिंदु पर जिगर के बाएं पार्श्व खंड की पहचान करें । यह विदर चिकित्सा और बाएं पार्श्व खंडों को अलग करता है । इस विदर एक शल्य स्टेपलर का उपयोग कर के साथ यकृत नस के साथ पोर्टल संरचनाओं सुरक्षित ( सामग्री की तालिकादेखें) । Transect ६०, ४५ या 30 मिमी लंबे संवहनी भार का उपयोग कर स्टेपलर से क्रमिक गोलीबारी का उपयोग इस विदर के माध्यम से पैरेन्काइमा ।
- जब parenchymal लकीर पूरी हो गई है, पर्याप्त रक्तस्तम्भन सुनिश्चित करने के लिए अवशेष जिगर का आकलन करें । दाग़ना या सीवन के साथ पैरेन्काइमा से किसी भी रक्तस्राव को नियंत्रित ।
- इंडोस्कोपिक लोभी और एक इंडोस्कोपिक ऊतक पुनर्प्राप्ति बैग का उपयोग कर जिगर अनुभाग पुनः प्राप्त ।
- बंदरगाहों को हटा दें और बाधित आकार 0 के साथ तीन परतों में 12 मिमी बंदरगाह चीरा midline प्रावरणी, गहरे चमड़े का परत के लिए एक चल रहे 2-0 सीवन और subcuticular परत के लिए चल रहे 4-0 टांका के लिए बंद । 5 मिमी बंदरगाहों 2-0 के साथ एक परत में बंद हो सकता है ।
- चीरा पर बाँझ ड्रेसिंग प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें).
- जब कोशिकाओं से कम 4 घंटे में तैयार हो जाएगा, सामांय संज्ञाहरण के तहत पशुओं को बनाए रखने के बाद-ऑपरेटिव के समय तक ।
- वैकल्पिक रूप से, यदि सेल जोड़तोड़ अब समय की आवश्यकता (जैसे hepatocyte spheroids या अब transduction के गठन की अनुमति के रूप में/इस विधि के व्यक्तिगत अनुप्रयोगों के आधार पर चयन अवधि) जानवर संज्ञाहरण से उबरने के लिए और दोहराने की अनुमति संवेदनाहारी प्रेरण कदम पूर्व प्रत्यारोपण करने के लिए जब कोशिकाओं के लिए तैयार हैं ।
3. Hepatocyte अलगाव
- छिड़काव सेट के साथ एक सिकुड़नेवाला पंप कनेक्ट गर्म फैलाव समाधान उद्धार करने के लिए (४३ ° c जल स्नान में बनाए रखा) कैथेटर के लिए जिगर खंड के बड़े उजागर जहाजों में रखा जा करने के लिए, इस तरह के है कि समाधान तापमान ३८ डिग्री सेल्सियस ऊतक के लिए परिचय पर है । सभी टयूबिंग, उपकरण, और समाधान कोशिकाओं प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त हैं सुनिश्चित करने के लिए बाँझ बनाए रखा जाना चाहिए.
- प्रधानमंत्री पंप और टयूबिंग प्रति द्वितीय के साथ एक टोंटी के प्रति मैं और ऊतक के लिए द्वितीय डिलीवरी प्रति के बीच स्विच तैनात करने के लिए । प्रति मैं स्थिति और प्रधानमंत्री टयूबिंग सेट के बाकी के लिए टोंटी स्विच, एक में लाइन बुलबुला जाल पूरी तरह से भरने के लिए ऊतक में हवा बुलबुले शुरू रोकने के लिए ।
- एक स्वच्छ अनुप्रस्थ यकृत संचलन के लिए सीधा कटौती के लिए पोर्टल नस शाखाओं और कैथीटेराइजेशन के लिए यकृत नसों के पार वर्गों प्रकट तैयार करते हैं ।
- perfusate के रिसाव से बचने के लिए एक सुखद फिटिंग कैथेटर के साथ उपलब्ध उजागर नसों Catheterize । Cannulate के ऊतकों की पर्याप्त छिड़काव को सुनिश्चित करने के लिए 1 से कम पोर्टल और 1 यकृत नस ।
- सुनिश्चित करें कि कैथेटर (एस) एक नस में कैथेटर रखने से पहले एयर के/
- १०० मिलीलीटर/मिनट पर प्रति मैं गर्म के साथ Perfuse, नस से शिरा ट्यूब हर 30 सेकंड के लिए 1 मिनट के लिए सभी उपलब्ध नसों के माध्यम से 15-20 मिनट के लिए चक्र के लिए ले जा । प्रति मैं अर्क के दौरान, वैक्यूम के तहत एक अपशिष्ट कंटेनर में प्रक्रिया ट्रे खाली करने के लिए एक निकासी ट्यूब सेट ।
- प्रति मैं के साथ के रूप में नसों के माध्यम से १०० मिलीलीटर/मिनट, साइकिल पर स्विच 30 मिनट की कुल के लिए । प्रति द्वितीय के दौरान, एक वापसी पंप का उपयोग करने के लिए द्वितीय पुन: के लिए जलाशय को वापस रीसायकल के लिए सक्रिय एंजाइम की तैयारी के संरक्षण के लिए प्रशासन । वापस बहिर्वाह पंप से कम करने के लिए सेट (यानी, ९४ एमएल/मिनट), के लिए स्रोत की बोतल को अत्यधिक हवा वापस नहीं सावधान किया जा रहा है ।
- लिवर कैप्सूल टूटता है, तो इस समय कम किया जा सकता है ।
- अगर जिगर पूरी तरह से पच नहीं है (कोमल फोकल दबाव के साथ डिंपल नहीं रहता है) छिड़काव के एक अतिरिक्त 5 मिनट प्रदर्शन किया जा सकता है ।
- कभी-कभार (लगभग हर 5 मिनट) दस्तावेज़ की सतह के तापमान को बबल ट्रैप और/या जिगर को सुनिश्चित करने के लिए हेपैटोसाइट्स ठंड नहीं हो रही है । जिगर ठंड (< 35 ° c) हो रही है, तो ३८ डिग्री सेल्सियस के करीब जिगर का तापमान बहाल करने के लिए पानी स्नान की गर्मी में वृद्धि । लिवर को छिड़काव की आय के रूप में उबालना चाहिए ।
- कोशिका संस्कृति हूड के परिवहन के लिए जिगर बाँझ थाली या पेट्री डिश के लिए निकालें । hepatocyte प्रसंस्करण के दौरान अखंडता को बनाए रखने के लिए एक बाँझ कपड़ा के साथ बाँझ क्षेत्र को कवर.
- बाँझ कपड़ा से जिगर अनुभाग बेनकाब और कोल्ड hepatocyte वॉश मीडिया (HWM) के साथ जिगर जलमग्न. शीर्ष भर में कैंची खींचकर कैप्सूल को बाधित. बाँझ दस्ताने पहने हुए, धीरे से मध्यम में हेपैटोसाइट्स जारी करने के लिए जिगर की मालिश ।
- बड़े (~ २०० मिलीलीटर) में बाँझ धुंध के माध्यम से हेपैटोसाइट्स युक्त HWM फिल्टर की बोतलें केंद्रापसारक । तपसिल में निंनलिखित प्रक्रिया के माध्यम से हेपैटोसाइट्स धो, पहले निलंबन के बाद कई बोतलों से सेल गोली के संयोजन (के रूप में लागू):
- ५० x जी, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक ।
- HWM के १५० एमएल में महाप्राण और रिसस्पेंड ।
- HWM में गोली 3rd धोने के बाद छोड़ दें ।
- एक hemocytometer या अंय उपकरण, के रूप में उपलब्ध का उपयोग कर सेल एकाग्रता गिनती । इन कोशिकाओं को अब रुचि के पूर्व vivo हेरफेर के लिए तैयार हैं, जीन थेरेपी सहित, सेल छंटाई, या अंय विशेषज्ञता के लिए पूर्व प्रत्यारोपण । HWM के अंतिम खंड एक विशिष्ट एकाग्रता (कोशिकाओं/एमएल) को लक्षित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है ।
4. Hepatocyte Transduction
- मीडिया में हेपैटोसाइट्स resuspend (Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम [DMEM], 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS], पेनिसिलिन-Streptomycin, 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड [HEPES], डेक्समेतएसॉनी, एपिडर्मल वृद्धि कारक [EGF], और NTBC) पर 1 – 2 बर्फ पर एक शंकु ट्यूब में प्रति मिलीलीटर लाख कोशिकाओं ।
- गल lentiviral वेक्टर के कमरे के तापमान पर और बर्फ पर शंकु ट्यूब संक्रमण (MOI) के लक्ष्य 20 गुणा करने के लिए कोशिकाओं को बांध में जोड़ें । सेल सतह के लिए वायरल वेक्टर बांध करने के लिए ९० मिनट के लिए 10 आरपीएम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं घुमाएँ ।
- स्थानांतरण ट्यूबों के लिए ३७ ° c 30 – 40 min. औंधा करने के लिए हर 5 मिनट मिश्रण करने के लिए वेक्टर transducing बाध्य कोशिकाओं की सुविधा.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर ५० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक बर्फ पर वांछित एकाग्रता में खारा में सेल गोली resuspend । इस धोने को दोहराने की तैयारी से किसी भी असीम वेक्टर को हटाने सुनिश्चित करने के लिए ।
- यदि संभव हो, तो कोशिकाओं की पर्याप्त aliquots प्लेट (यानी, एक 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में प्रति अच्छी तरह से ५००,००० कोशिकाओं) व्यवहार्यता, आसंजन, transduction दक्षता, आदि के लिए जांच करने के लिए
नोट: यह अक्सर संभव नहीं है इन मापदंडों का मूल्यांकन करने से पहले, विशेष रूप से एक ही दिन की प्रक्रियाओं के लिए । उदाहरण के लिए, प्रक्रिया वर्णित इस के साथ साथ एक untaggeded फह सीडीएनए कार्यरत अल्फा के नियंत्रण में-1 antitrypsin जिगर विशेष प्रमोटर, जो प्रत्यारोपण करने से पहले हेपैटोसाइट्स में आसानी से परख नहीं था । हालांकि, इन मढ़वाया कोशिकाओं transduction की सफलता का एक संकेतक के रूप में (यानी, पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से) या प्रक्रिया के सामान्य सफलता का एक कारक के रूप में एक सूचक के रूप में प्रत्यारोपण के बाद परख की जा सकती है ।
5. Hepatocyte ट्रांसप्लांटेशन
- एक 2 से 5 मेगाहर्ट्ज transducer का उपयोग कर अल्ट्रासाउंड के माध्यम से पोर्टल नस की पहचान । प्रत्यक्ष एक 18 जी, अपने विभाजन के लिए समीपस्थ मुख्य पोर्टल नस की ओर 5 इंच सुई ।
- ऊपर की धीमी मैनुअल अर्क शुरू 1 x 109 हेपैटोसाइट्स (लगभग 10 ग्राम) एक सिरिंज का उपयोग कर । एक अर्क कैथेटर का उपयोग कर प्रत्यारोपण के दौरान पोर्टल दबाव मॉनिटर ।
- यदि पोर्टल दबाव बेसलाइन से अधिक 8 mmHg को बढ़ाएं, अर्क को रोकें और आधारभूत स्तर पर लौटने के लिए दबाव की अनुमति दें ।
- पोर्टल दबाव में पांच मिनट के लिए आधान रोकने के बाद आधार रेखा पर वापस नहीं करते हैं, तो अर्क बंद ।
- ट्रांसप्लांटेशन और कैथेटर हटाने के बाद, थ्रोम्बोटिक घटनाओं की उपस्थिति और पोर्टल नस में आगे प्रवाह के लिए मूल्यांकन करने के लिए अल्ट्रासाउंड का उपयोग करें ।
6. पश्चात की वसूली और रखरखाव
- एक उचित वसूली क्षेत्र के लिए विषय ले जाएँ और पशु पूरी तरह से एम्बूलेंस है जब तक निरीक्षण, हृदय की दर, ऑक्सीजन संतृप्ति और शरीर के तापमान हर 15 – 30 min. गर्म कंबल या एक हवा गर्म लपेटो के साथ शरीर के तापमान को बनाए रखने, के रूप में की जरूरत है ।
- प्रशासन 1 मिलीग्राम/omeprazole मुंह से दैनिक (अध्ययन के अंत के माध्यम से) गैस्ट्रिक अल्सर कि inappetence के डटकर के साथ हो सकता है की संभावना को कम करने के लिए ।
- पश्चात, पशु लैब और पशु चिकित्सा कर्मचारियों द्वारा बारीकी से नजर रखी है और आम तौर पर अतिरिक्त दर्द दवा पूर्व ऑपरेटिव buprenorphine खुराक से अलग की आवश्यकता नहीं है । यदि कष्ट/दर्द के लक्षण योग्य पशु चिकित्सा देखभाल कर्मचारियों द्वारा मनाया (चीरा पहरा, inappetence, सुस्ती), विरोधी भड़काऊ एजेंटों (यानी, Carprofen) प्रशासित किया जा सकता है ।
7. व्यंजनों
- इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त व्यंजनों के लिए 1 तालिका देखें ।
अभिकर्मक | HWM | अभिकर्मक | प्रति I (10x) | प्रति द्वितीय (10x) |
Williams'-ए पाउडर (g/L) | १०.८ | NaCl (g/L) | ८३ | ३९ |
NaHCO3 (g/L) | २.२ | KCl (g/L) | 5 | 5 |
HEPES (g/L) | २.६ | HEPES (g/L) | 24 | २४० |
Pen/Strep (100x, एमएल/ | 10 | EGTA (g/L) | ९.५ | - |
भ्रूण गोजातीय सीरम (एमएल/ | १०० | एन-एसिटाइल-एल-cysteine | 8 | 8 |
फोन | ७.३ | (N-A-C, g/L | ||
नाइट्रोग्लिसरीन (एमएल एल/ | 5 | 5 | ||
CaCl2 2H2ओ (g/ | - | 7 | ||
Collagenase डी (mg/ | - | ०.२ | ||
फोन | ७.४ | ७.६ |
तालिका 1: जिगर वर्गों से Hepatocyte अलगाव में इस्तेमाल समाधान के लिए व्यंजनों ।
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Representative Results
जिगर लकीर और ऑटोलॉगस ट्रांसप्लांटेशन योजनाबद्ध रूप से 1 चित्रामें प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । 5 सूअरों कि यकृत लकीर से गुजरा के एक प्रतिनिधि के पलटन में, सबसे अधिक की पैदावार थी > 1 x 109 हेपैटोसाइट्स के साथ लगभग ८०% व्यवहार्यता (तालिका 2), वांछित जोड़तोड़ के किसी भी प्रकार के लिए कोशिकाओं के बहुत सारे प्रदान, जीन सहित चिकित्सा. उन 5 सूअरों में से प्रत्येक से तैयार हेपैटोसाइट्स के गैर प्रत्यारोपण भाग की संस्कृति के बाद transduction और प्रारंभिक चढ़ाना (चित्रा 2) के बाद ठेठ hepatocyte आकृति विज्ञान ४६ घंटे के साथ, अच्छी व्यवहार्यता और आसंजन दिखाया । इन परिणामों के एक सफल तैयारी के प्रतिनिधि हैं, जबकि गरीब परिणाम कोशिकाओं की कम संख्या के साथ संकेत दिया जाएगा, व्यवहार्यता, या एक monolayer में कोशिकाओं के ंयूनतम पालन ।
फह-/ सुअर के उपचार से पहले एक जिगर बायोप्सी immunohistochemistry (चित्रा 3) के माध्यम से फह की कोई अभिव्यक्ति से पता चलता है । प्रारंभिक engraftment प्रत्यारोपण के दौरान पुनः शुरू कोशिकाओं की राशि से भिंन होगा । Transduction आवृत्तियों में सुअर का हेपैटोसाइट्स की एक MOI पर lentivirus का उपयोग कर 10 TU/hepatocyte आमतौर पर 70 – 100% है । पूरे जिगर सही कोशिकाओं द्वारा repopulateded है जब तक engrafted कोशिकाओं क्लोनी फह-/- जिगर में विस्तार होगा । 2, 6, और 12 महीनों में प्रतिनिधि बायोप्सी फह की एक समयरेखा-सकारात्मक सेल विस्तार है, जो आम तौर पर प्रत्यारोपण के बाद 12 महीने में पूरा हो जाता है (चित्रा 3) प्रदर्शित करता है । यहां तक कि engraftment के एक कम प्रतिशत के लिए अंततः जिगर फिर से आबाद उंमीद होगी, हालांकि वास्तविक प्रारंभिक engraftment दरों इस प्रयोग में मूल्यांकन नहीं किया गया ।
सूअरों सावधानी के बाद वजन बढ़ाने के लिए प्रत्यारोपण की निगरानी कर रहे हैं, के रूप में कामयाब विफलता एक संकेत है कि पर्याप्त नहीं सही हेपैटोसाइट्स मौजूद हैं । इस मामले में पशुओं NTBC पर वापस साइकिल के रूप में सही hepatocyte आबादी जब तक की आवश्यकता के लिए दवा से पूरा प्रातः की अनुमति पर्याप्त है । परिचालित के मूल्यांकन के लिए चिकित्सा का पालन करने के लिए आसान पहुंच प्रदान करता है । एक बार एक जानवर जिगर में सही हेपैटोसाइट्स के बारे में 20% जनसंख्या हासिल की है, tyrosine और succinylacetone स्तर जब जंगली प्रकार के जानवरों की तुलना में सामान्य होगा (चित्रा 4a). इसके अलावा, के तहत इलाज या अनुपचारित फह-/ सुअर इसी तरह fibrotic जिगर प्रभावित मनुष्यों में देखा परिवर्तन है, जो Masson सीरियल बायोप्सी8के trichrome धुंधला के बाद किया जा सकता है दर्शाता है । चल रहे जिगर की चोट के किराए मार्करों ऐसे aspartate aminotransferase और alkaline फॉस्फेट के रूप में परिसंचारी जिगर एंजाइमों, परख द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । जबकि अनसही पशु जंगली प्रकार के जानवरों की तुलना में दोनों मापदंडों में महत्वपूर्ण उन्नयन दिखाते हैं, पूर्व वीवो जीन थेरेपी इन सीरम मूल्यों को सामान्य (फिगर 4B और 4c) में लौटाती है. अंत में, सामान्य जिगर चयापचय स्वास्थ्य अनुपचारित फह-/ सूअरों में बाधित है, के रूप में अमोनिया घूम में उन्नयन द्वारा संकेत दिया । सही कोशिकाओं के साथ जिगर की जनसंख्या अमोनिया के जंगली प्रकार के स्तर को पुनर्स्थापित करता है (चित्रा 4d) ।
चित्रा 1: Hepatectomy और ऑटोलॉगस ट्रांसप्लांटेशन । (ऊपर से दक्षिणावर्त) एक आंशिक जिगर लकीर हेपैटोसाइट्स के एक स्रोत प्रदान करते हैं और जिगर पुनर्जनन को उत्तेजित करने के लिए इस विषय पर किया जाता है । हेपैटोसाइट्स से अलग कर रहे है (नीली कोशिकाओं), transduced lentiviral वेक्टर युक्त transgene ब्याज (ब्राउन सेल), और फिर transduced कोशिकाओं के माध्यम से वापस स्रोत पशु के लिए प्रत्यारोपण autologously रहे है के साथ पूर्व vivo पोर्टल नस इंजेक्शन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: प्राथमिक सुअर जिगर वर्गों से हेपैटोसाइट्स । हेपैटोसाइट्स 5 अलग सूअरों से जिगर लकीरें, lentiviral वेक्टर के साथ transduced से, और संस्कृति व्यंजन के लिए आकृति विज्ञान, व्यवहार्यता, पवित्रता, और आसंजन प्रदर्शित करने के लिए ४८ ज के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी गई । इन विट्रो में गुणात्मक आकलन प्रत्येक तैयारी के लिए vivo में सफल engraftment की संभावना के लिए किराए के संकेतकों के रूप में सेवा करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: सही हेपैटोसाइट्स फह-/ सुअर जिगर फिर से भरना । फह immunohistochemistry से लिवर बायोप्सी 0, 2, 6 और 12 महीने के बाद ऑटोलॉगस हेपैटोसाइट्स की पूर्व vivo जीन थेरेपी । अनुपचारित फह-/ सूअरों जिगर में कोई फह-सकारात्मक कोशिकाओं को दिखाने के (क) । प्रत्यारोपण के बाद दो महीने (ख), फह सकारात्मक हेपैटोसाइट्स के व्यक्तिगत घावों को देखा है, जो तो विस्तार से गुजरना के लिए 50 की जगह-6 महीने में जिगर के 60% (ग) पूरा प्रतिस्थापन के बाद, 12 महीने में देखा (डी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: फह में सीरम जैव रसायन 10 महीने के बाद पूर्व vivo जीन थेरेपी -/ सूअरों । 10 महीने के बाद चिकित्सा, tyrosine, aspartate aminotransferase14, क्षारीय फॉस्फेट (ALP) और अमोनिया का स्तर अनुपचारित फह कमी पशुओं की तुलना में काफी कम है और जंगली प्रकार के स्तर से अलग हैं । डेटा मान-Whitney यू परीक्षण (प्रस्तुत के रूप मेंपी मूल्यों) का उपयोग कर महत्व के लिए विश्लेषण किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
सुअर | कुल सेल (x 106) | लाइव सेल (x 106) | व्यवहार्यता (%) |
1 | १,३८१ | १,१६० | ८४ |
2 | १,००० | ७७० | ७७ |
3 | १,२१३ | ९९५ | ८२ |
4 | ७८९ | ६७१ | ८५ |
5 | १३१८ | ९७५ | ७४ |
औसत | १,१४० | ९१४ | ८० |
एसटी देव | २४४ | १९४ | 5 |
तालिका 2: प्रतिनिधि hepatocyte से प्राथमिक अलगाव से परिणाम 5 सूअरों ।
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Discussion
इस रिपोर्ट में एचटी-1 के एक सुअर का मॉडल का इलाज करने के लिए एक पूर्व vivo ऑटोलॉगस जीन थेरेपी के दृष्टिकोण का वर्णन है । यह एक आंशिक hepatectomy शामिल है, पूर्व vivo hepatocyte अलगाव और लेंती वायरस सुधारात्मक transgene ले जाने के साथ अलग हेपैटोसाइट्स के transduction द्वारा पीछा किया । सही ऑटोलॉगस हेपैटोसाइट्स तो पोर्टल नस8के माध्यम से फह कमी जानवर को वापस प्रत्यारोपण कर रहे हैं । यद्यपि विधि वर्णित कुछ संशोधन के साथ सभी बड़े पशु मॉडलों के लिए लागू है, फह की कमी सुअर सही कोशिकाओं13,15के लिए एक उच्च चयनात्मक वातावरण का अनूठा लाभ है । इस विधि एचटी-1 के लिए एक प्रभावी इलाज है, के रूप में खुराक जानवरों जैव रासायनिक मापा चयापचयों और भड़काऊ जिगर के निशान के सामान्यीकरण के साथ NTBC स्वतंत्र वृद्धि दिखाने के लिए, सिरोसिस और HCC की रोकथाम और जल्दी फाइब्रोसिस का पूरा उलटा देखा साथ NTBC साइक्लिंग की । इसके अलावा, एक और अधिक हाल ही में व्यापक ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण शामिल अध्ययन कोई detectable सुधारा कोशिकाओं, फाइब्रोसिस, सिरोसिस या tumorigenicity 3 साल बाद चिकित्सा (समीक्षा में पांडुलिपि) का प्रदर्शन किया है । हालांकि, फह की उपयोगिता-नल पृष्ठभूमि एक उपकरण के रूप में सेवा कर सकते है hepatocyte शरीर विज्ञान और रोग संकेत में पूछताछ की एक विस्तृत सरणी के मूल्यांकन की अनुमति एचटी-1 से परे ।
इस प्रक्रिया के सापेक्ष सफलता विषय पूरी तरह से इस सुरक्षात्मक दवा से छुड़ाया जा सकता है पहले आवश्यक NTBC के चक्र की संख्या द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । इस मॉडल के साथ कई पुनरावृत्तियों में और एचटी-1 के अंय छोटे जानवर मॉडल में, लगभग 20% सुधार NTBC स्वतंत्र विकास हासिल करने से पहले की आवश्यकता है । NTBC के साथ अधिक साइकल चलाना गरीब प्रारंभिक engraftment/व्यवहार्यता, प्रारंभिक engraftment, या गरीब transgene अभिव्यक्ति के समय में उंनत जिगर की बीमारी का संकेत है, हालांकि अंय कारकों को भी एक भूमिका निभा सकता है । जिगर के स्वास्थ्य के जैव रासायनिक मार्कर (AST, ऑल्ट, और अमोनिया) आसानी से उपलब्ध है और सही hepatocyte विस्तार की हद में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, लेकिन phenotypic इलाज के अंतिम सत्यापन सबसे अच्छा सीरम tyrosine के सामान्यीकरण द्वारा सिद्ध है और फाइब्रोसिस के अभाव में फह-व्यक्त हेपैटोसाइट्स की succinylacetone एवं histologic पुष्टि. यह जब जिगर सही हेपैटोसाइट्स के साथ repopulateded किया गया है हासिल की है ।
प्रक्रिया की प्रभावकारिता हेपैटोसाइट्स, जो बाँझ बनाए रखा जाना चाहिए और पूरे अलगाव, transduction और प्रत्यारोपण प्रक्रिया भर में व्यवहार्य की अखंडता पर सबसे भारी निर्भर करता है । गैर का पुनः आरंभ-व्यवहार्य या सुधारित हेपैटोसाइट्स phenotype बचाव नहीं होगा, और एक असफल प्रक्रिया विषय अवलोकन के महीने लग सकता है सत्यापित करने के लिए ।
इस मॉडल में, कार्यात्मक फह एंजाइम की अच्छी transgene अभिव्यक्ति जिगर की आबादी के लिए एक न्यूनतम आवश्यकता है । Lentivirus transgene की एक प्रभावी प्रतिलिपि वितरित करने के लिए केवल एक ही तरीका है । इस विधि गैर वायरल प्रणालियों और विशिष्ट जीनोमिक दोष के संपादन के उद्देश्य से उन सहित अंय वितरण प्रणालियों के उपयोग के लिए संभावना की अनुमति देगा । अंत में, इस मॉडल फह कमी में अंय दोषों के सुधार सहित संभावनाओं का एक विशाल सरणी, के लिए अनुमति देगा प्रतिक्रिया । इतने लंबे समय के रूप में प्रत्यारोपण सेल एक कार्यात्मक फह एंजाइम व्यक्त, कोशिकाओं के किसी भी अन्य संशोधन पूर्व vivo भी प्रचारित किया जाएगा. यह जिगर के चयापचय की जन्मजात त्रुटियों के किसी भी फह में सही किया जा करने की अनुमति होगी / सही हेपैटोसाइट्स के विस्तार के रूप में अंततः जिगर फिर से आबाद, किसी भी रोग संकेत के लिए हेपैटोसाइट्स के प्रासंगिक संख्या प्राप्त किया जा सकता है, जो इस मॉडल और एक बुनियादी विज्ञान और नैदानिक चिकित्सा मॉडल के रूप में प्रक्रिया के मूल्य रेखांकित करता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक Duane Meixner पोर्टल नस इंजेक्शन, स्टीव Krage, Joanne पेडरसन, और लोरी Hillin शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के दौरान समर्थन के लिए प्रदर्शन में विशेषज्ञता के लिए धंयवाद । यह काम मिनेसोटा फाउंडेशन और regenerative चिकित्सा मिनेसोटा के बच्चों के अस्पताल द्वारा समर्थित किया गया । R.D.H. एक NIH K01 DK106056 पुरस्कार के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था और एक मेयो क्लिनिक अपक्षयी दवा कैरियर विकास पुरस्कार के लिए केंद्र ।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
0 PDS | Ethicon | Z340H | |
2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
HEPES | Fisher | BP310-1 | |
Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
(N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
References
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S.
Metabolic liver disease in children. Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008). - Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).