Summary
يصف لنا داخلية مصممة في المختبر تدفق دائرة نموذجا، الذي يتيح التحقيق البكتيرية التمسك graft الأنسجة.
Abstract
وتستخدم مختلف قنوات المزودة بصمامات وصمامات محمولة على دعامات لاستبدال صمام تدفق البطين الأيمن المسالك (رفوت) في المرضى الذين يعانون من أمراض القلب الخلقية. عند استخدام المواد الاصطناعية ومع ذلك، هذه الطعوم عرضه للعدوى البكتيرية واستجابات المضيف مختلفة.
تحديد العوامل البكتيرية والمضيفة التي تلعب دوراً حيويا في الانضمام اللمفاوية من الكائنات المجهرية ذات أهمية لفهم أفضل الفسيولوجيا المرضية لبداية العدوى مثل عدوى التهاب الشغاف (IE) ووضع الوقائية الاستراتيجيات. ولذلك فمن الضروري تطوير نماذج المختصة للتحقيق في التصاق البكتيريا تحت الظروف الفسيولوجية القص. هنا، يمكننا وصف استخدام المصممة حديثا في المختبر نضح الدائرة استناداً إلى اللوحات الموازية التي تتيح دراسة البكتيريا التمسك بعناصر مختلفة من الأنسجة الاختلاس مكشوف مثل المصفوفة خارج الخلية وخلايا بطانية ومناطق خاملة . هذا الأسلوب جنبا إلى جنب مع تشكيل مستعمرة وحدة (زيمبابوي) عد مناسبة لتقييم ميل مواد الفساد نحو التصاق البكتيريا تحت التدفق. كذلك، يمكن استخدام هذا النظام الدائرة تدفق التحقيق في دور مكونات الدم في التصاق البكتيريا تحت ظروف القص. أظهرنا أن المصدر من الأنسجة ومورفولوجيا السطحية وخصوصية الأنواع البكتيرية ليست العوامل المحددة الرئيسية في البكتيريا التمسك graft الأنسجة باستخدام نموذجنا نضح داخلية مصممة في المختبر .
Introduction
المكوّرات العنقودية الذهبية (S. aureus) وتستخدم مجموعة متنوعة من استراتيجيات الفوعة للتحايل على نظام الدفاع المناعي المضيف استعمار سطوح البيولوجية وغير البيولوجية مزروع في تعميم البشرية، الأمر الذي يؤدي إلى التهابات حادة داخل الأوعية مثل الانتان و أي1،2،3،،من45. إنترنت إكسبلورر ما زال المرتبطة علاج مهم مضاعفات في المرضى بعد زرع صمامات القلب الاصطناعية بينما العوامل الفردية التي تسهم في ظهور إيياري لا غير مفهومة تماما6،في الفترة من7. تحت ظروف التدفق، تواجه البكتيريا قوات القص، وأنهم بحاجة إلى التغلب عليها من أجل التمسك بجدار السفينة8. النماذج، والتي تسمح لدراسة التفاعل بين البكتيريا والأنسجة الاصطناعية صمام أو البطانة تحت التدفق، تعتبر ذات أهمية كما أنها تعكس الحالة في فيفو أكثر.
عدة آليات محددة تيسر البكتيرية الانضمام إلى خلايا بطانية (ECs) والمصفوفة سوبيندوثيليال المكشوفة (ECM) مما أدى إلى استعمار الأنسجة ونضوج تنبتات، يجري اتخاذ خطوات مبكرة أساسيا في إنترنت إكسبلورر9. وصف مختلف البروتينات السطحية العنقوديات أو مسكرامس (مكونات السطح الميكروبية الاعتراف بالجزيئات مصفوفة لاصقة) كوسطاء لالتصاق الخلايا المضيفة وبروتينات ECM من خلال التفاعل مع جزيئات مثل فيبرونيكتين، الفيبرينوجين والكولاجين وفون ويليبراند عامل (فوف)8،،من1011. ومع ذلك، نظراً للطي داخل الجزيئية لبعض عوامل الفوعة، درس معظمهم في ظروف ثابتة، والعديد من هذه التفاعلات قد تكون ذات أهمية مختلفة في الالتهابات اللمفاوية في تعميم الدم.
ولذلك، فإننا نقدم داخلية مصممة في المختبر تدفق مواز-لوحة دائرة نموذجا، مما يسمح تقييم الالتزام البكتيرية إلى مكونات مختلفة لإدارة المحتوى في المؤسسة و ECs في سياق ترقيع الأنسجة مزروع في موقف رفعت. يتمثل الهدف العام للطريقة الموضحة في هذا العمل هو لدراسة آليات التفاعل بين البكتيريا والأنسجة اللمفاوية الكامنة في ظروف التدفق، والتي ترتبط ارتباطاً وثيقا بالبيئة في فيفو مجرى الدم مسببات الأمراض مثل س. في المذهبة. ويركز هذا النهج المبتكر قابلية الاختلاس الأنسجة الأسطح للانضمام البكتيرية لتحديد عوامل الخطر المحتملة لتطوير أي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الأنسجة الابتزاز للدراسات في المختبر
ملاحظة: استخدمت ثلاثة أنواع من الأنسجة: "تامور البقري" التصحيح (BP)، والطعوم Homograft Cryopreserved (CH) و "البقر حبل الوريد" (بجف). وفي حالة قناة بجف والفصل (الأنسجة المجهزة بالضفة هوموجرافت الأوروبية (آب) وتخزينها في النتروجين السائل قبل استخدامها)، استخدمت كلا من الجدار ومنشورات صمامات القلب. وتم شراء BP التصحيح وقناة بجف من الشركات المصنعة. قبل الشروع في الاستخدام، ذوبان الجليد CH بعد تعليمات آب12.
- شطف جميع الأنسجة مع 0.9% كلوريد الصوديوم قبل الاستخدام.
- إعداد خزعات الأنسجة خزعة جلد يمكن التخلص منها باستخدام لكمه قطع قطعة دائرية الأنسجة (10 ملم في القطر).
- قطع جميع الأنسجة بقع بنفس الارتفاع باستخدام المشارط العقيمة المتاح.
- للأنسجة الثابتة مع جلوتارالديهيدي (على سبيل المثال قناة بجف)، احتضان قطع الفساد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 200 غرام/لتر من الزلال البشري لتحييد مثبت.
- أغسل بها بقايا glutaraldehyde مع 0.9% كلوريد الصوديوم في لوحة ميكروتيتير. كرر 3 مرات لمدة 1 دقيقة.
2-إعداد البكتيريا لتجارب التروية
ملاحظة: استخدمت العزلات البكتيرية الثلاثة: كوان (ATCC 12598) S. aureus , S. epidermidis ATCC 149900 و الدم س. NCTC 7864. كانت تزرع المذهبة س. و . س. ابيديرميديس في 37 درجة مئوية في مرق الصويا تريبتيك (TSB) و الدم س. يزرع في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 في الدماغ القلب ضخ مرق (بهي).
- تعد الثقافة بين عشية وضحاها من البكتيريا على طبق أجار الدم صلبة.
- استخدم حلقة عقيمة كشط البكتيريا المجمدة قبالة وتلقيح على طبق أجار الدم مولر هينتون للثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- استخدم حلقة تلقيح معقمة لالتقاط مستعمرة واحدة من ثقافة أجار الدم بين عشية وضحاها، وتطعيم في 10 مل TSB أو بهي في أنبوب 14 مل والثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- الطرد المركزي الثقافات بين عشية وضحاها (3000 × ز، 4 درجة مئوية، 10 دقيقة) وريسوسبيند الكريات في 10 مل من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة (PBS). وضع أنابيب 14 مل على الجليد.
- إعداد قاسمة للحل 3.7 mg/mL 5 (6)-كاربوكسي-فلوريسسين ن-هيدروكسي سوكسينيميديل إستر (CF) في الإيثانول وتخزينها في-20 درجة مئوية. كذلك يؤدي إلى تمييع المخزون من قوات التحالف إلى 150 ميكروغرام/مل تستخدم المياه 'عالي النقاوة'.
ملاحظة: حماية الأنابيب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم وتخزينها في-20 درجة مئوية. - الطرد المركزي البكتيريا (3000 × ز، 4 درجة مئوية، 10 دقيقة) وريسوسبيند الكريات في 800 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميليلتر من الحل CF 150 ميكروغرام/مل (تركيز 30 ميكروغرام/مل تستخدم لنضح التجارب النهائية). حماية الأنابيب من الضوء مع رقائق الألومنيوم واحتضان مدة 30 دقيقة باستخدام شاكر مداري.
- بعد وضع العلامات، كتلة مع 2% حل ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني وتدور (3000 × ز، 4 درجة مئوية، 10 دقيقة). اتبع مع خطوة غسيل باستخدام 10 مل بكتيريا برنامج تلفزيوني وبيليه بالطرد المركزي (3000 × ز، 4 درجة مئوية، 10 دقيقة).
- تضعف البكتيريا مع برنامج تلفزيوني للحصول على الوحدات المكونة للمستعمرة7 10/mL (زيمبابوي) (يتم التحقق من زيمبابوي تعول على لوحات أجار الدم مولر هينتون)، الذي يتوافق مع OD600 (الكثافة البصرية) من 0.65. تبقى الأنابيب في الظلام على الجليد قبل نضح التجارب.
ملاحظة. ضع في اعتبارك أن القياسات600 OD تعكس العدد التقريبي للبكتيريا. لعد جرعة تطعيم فعال، أسلوب تمييع المسلسل خطوة إضافية ضرورية للتحقق من التطوير التنظيمي على أساس الأرقام كما هو موضح في القسم 3.8.
3-"تجارب نضح" في المختبر باستخدام "الدائرة تدفق" مواز-لوحة
- جبل خزعات الأنسجة من 10 ملم في القطر ونفس سمك (أعد الخطوات 1.1-1.5) إلى نظام دائرة تدفق مع السطح الداخلي مواجها لأعلى للحصول على اتصال مع تعليق البكتيرية.
ملاحظة: نفس سمك الأنسجة عبر مختلف الطعوم ويضمن أن يتم التوصل إلى نفس الارتفاع الأنسجة في القناة السماح الاندفاق الصفحي في جميع الظروف. تعرض كافة عناصر الدائرة تدفق وهو موضح في الشكل 1.- للبدء البروتوكول، ضع قطعة النسيج جولة بين شريحة مجهر مع ثقب دائري 8 مم وطوقا مطاط.
ملاحظة: الشريحة المجهر يمتلك الفيلم أسفل رقيقة جداً للسماح بتوليد ثقب 8 مم. جنبا إلى جنب مع ورقة المطاط، وأنه يعمل على إصلاح الأنسجة لتمكين الاتصال المباشر بين العينة والمتوسط المتدفقة ويمنع تفكك الخزعة خلال التجربة أيضا. لا يمكن معالجته على سطح النسيج التحقيق، الذي يتعرض للتدفق (القطر الأصغر) بالملقط. - إدراج حامل مع الأنسجة في الورقة طوقا مضمن في إطار معدني أسفل الدائرة.
- إرفاق الإطار المعدني العلوي مع الورقة طوقا المقابلة على الجزء السفلي من الدائرة مع حامل مناديل تم إدراجه مسبقاً. وفي وقت لاحق جبل الدائرة كاملة مع ثمانية مسامير والمسمار الجوز. تأكد من أن ارتفاع الدائرة هو نفسه دائماً عبر الطعوم.
ملاحظة: ارتفاع الدائرة ينبغي أن يحدد دائماً على تشديد الخناق. استخدام الفرجار أو المسطرة.
- للبدء البروتوكول، ضع قطعة النسيج جولة بين شريحة مجهر مع ثقب دائري 8 مم وطوقا مطاط.
- قم بتوصيل الدائرة تدفق مضخة تمعجية وخزان السائل مع الأنابيب.
- نتخلل الأنسجة مع تعليق7 10 زيمبابوي/مليلتر (التحقق من زيمبابوي العد والمتصلة بالقياسات600 OD) البكتيريا المسماة فلوريسسينتلي في برنامج تلفزيوني مع إجهاد القص 3 داين/سم2 (داين كل وحدة الضغط سنتيمتر مربع) من يعني مضخة تمعجية (معدل تدفق 4 مل/دقيقة) لاستخدام خزان 400 مل بكتيرية (تصميم داخلي، الشكل 1) مكيفة على 37 درجة مئوية باستخدام لوحة الحرارة (جدول المواد) ح 1.
- أوافيكم باستمرار تعليق 100 مل البكتيرية استخدام خزان جمع نفسه.
- بعد نضح، تفكيك الدائرة للإفراج عن الاختلاس وتغسل قطعة النسيج مرتين مع 4 مل من برنامج تلفزيوني في صفيحة 12-جيدا باستخدام المختبر المداري شاكر لمدة 3 دقائق. بعد ذلك قص الجزء الداخلي من الابتزاز استخدام خزعة جلد لكمه قطر أصغر.
- ضع كل خزعة النسيج في أنبوب مل 14 منفصلة تحتوي على 1 مل العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم. قم بتسمية الأنبوب # 1.
- فصل البكتيريا من الأنسجة باستخدام حمام سونيكيشن لمدة 10 دقائق (السعة = 100% والتردد = 45 كيلو هرتز).
ملاحظة: بالمقارنة مع مفرزة كاملة من البكتيريا من الأنسجة ينبغي تقييم الطعوم عند احتضان بقع بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في المتوسط TSB السائل يليه OD600 قياسات مراقبة بقع تعامل مع حل حرة بكتيريا. - استخدام أسلوب تمييع مسلسل على لوحات أجار الدم مولر هينتون لعد كفوس.
- إعداد أنبوب مل 14 واحد مع 10 مل من المحلول الملحي العقيمة جعل تخفيف مسلسل تعليق البكتيرية التي تم الحصول عليها بعد sonication. قم بتسمية هذا الأنبوب كما #2.
ملاحظة: لكل الأنسجة تجربة أنبوب واحد مع 10 مل من 0.9% ضروري كلوريد الصوديوم. - إعداد ثلاثة أنابيب 14 مل مع 10 مل من العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم لتخفيف المسلسل من تعليق البكتيرية الأولية من الخطوة 2.7. قم بتسمية هذه الأنابيب على النحو التالي #3، #4، #5.
ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لمعرفة عدد زيمبابوي الحقيقية في تعليق البكتيرية المستخدمة في التجربة التروية. - مزيج دوامة كل أنبوبة لدوامة س. 15 الأنابيب مع خزعة النسيج، فضلا عن تعليق البكتيرية الأولية جعل تخفيف المسلسل.
- إعداد لوحات أجار ثلاثة، اثنان للتجربة الأنسجة (نضح بكتيريا ونضح التحكم من برنامج تلفزيوني)، والثلث لتعليق البكتيرية الأولية المستخدمة بيرفوسيونس.
- قم بتسمية ثلاثة قطاعات كل لوح للتجربة الأنسجة في نحو 10 التالية-1، 10-3 و 10-4. لحساب العدد كفوس في perfusates البكتيرية، تسمية اللوحة كما يلي: 10-1، 10-3، 10-5 و 10-7.
ملاحظة: جميع المؤشرات في أجار لوحات مثل 10-1و 10-3 وهكذا تشير إلى أن العدد النهائي لزيمبابوى/مل حساب في اليوم التالي. لوحة التحكم لا يحتاج إلى أي القطاعات. قبل الاستخدام، ينبغي أن توضع تحت غطاء محرك السيارة الصفحي لوحات أجار الدم وفتح لإزالة الرطوبة الزائدة. - الاستمرار في إعداد تخفيف المسلسل، نقل 100 ميليلتر من أنبوب #1 إلى أنبوب #2 ومزيج من قوة مع دوامة.
- نشر 100 ميليلتر لمحتويات الأنبوبة #1 و #2 على قطاعات 10 المقابلة-1 و 10-3 لصفيحة أجار. وبالمثل، انتشرت 10 ميليلتر من أنبوب #2 في القطاع 10-4، كرر هذه الخطوة أربع مرات للحصول على 4 زوائد منفصلة من كل حجم من 10 ميليلتر.
ملاحظة: نظراً لصغر حجم المستخدمة للطلاء على قطاع 10-4، ينصح أن يكون عدد متعددة من قطرات جعل عدد متوسط من كفوس نمت. - إعداد تخفيف المسلسل الثقافة الأولية ونقل 100 ميليلتر من تعليق البكتيرية من الخطوة 2.7 إلى أنبوب #3 والمزيج بقوة مع دوامة. إضافة 100 ميليلتر من أنبوب #3 إلى أنبوب #4 ومزيج جيد، كرر هذا الإجراء لأنبوب اللاحقة #5.
- نشر 100 ميليلتر من محتويات الأنابيب #3، #4، #5 وتعليق البكتيرية المعدلة (الخطوة 2.7)، على التوالي، على قطاعات 10-3، 10-5، 10-7 و 10-1 من لوحة أجار الدم.
- ترك لوحات أجار الدم في هود الصفحي للهواء الجاف ينتشر البكتيرية، عادة لمدة 10 دقائق. وبعد ذلك وضع اللوحات في 37 درجة مئوية للحضانة بين عشية وضحاها.
- بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، عد المستعمرات البكتيرية للحصول على عدد كفوس الناتجة من الالتصاق خزعات الأنسجة، فضلا عن كفوس مليلتر في انطلاق تعليق البكتيرية المستخدمة التروية. التعبير عن النتائج كزيمبابوي/سم2.
- إعداد أنبوب مل 14 واحد مع 10 مل من المحلول الملحي العقيمة جعل تخفيف مسلسل تعليق البكتيرية التي تم الحصول عليها بعد sonication. قم بتسمية هذا الأنبوب كما #2.
4-الأسفار مجهرية للبكتيريا انضمت Graft الأنسجة عند نضح
- بعد نضح، تغسل قطعة النسيج مع برنامج تلفزيوني (راجع الخطوة 3، 5) وقص الجزء الداخلي من الابتزاز استخدام لكمه قطر أصغر.
- إعداد لوحة 6-جيدا ووضع قطرات من تصاعد المتوسطة (جدول المواد).
- وضع كل قطعة من النسيج مع سطحه perfused إلى الأسفل على قطره واحدة من تصاعد المتوسطة.
- قراءة لوحة باستخدام ماسح ضوئي فلورية (جدول المواد). تعيين معلمات من موجات الإثارة والانبعاثات وفقا فلوروفوري يستخدم لوسم البكتيرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لفهم أفضل للآليات وراء أي التنمية، هذا النموذج يتيح تقييم البكتيريا والأنسجة المرتبطة العوامل الموجودة في حالة ظهور الإصابة في فيفو .
بالتفصيل، يسمح نهج الرواية في المختبر لقياس التصاق البكتيريا في ظروف التدفق إلى أنسجة مختلفة من الابتزاز من بيرفوسينج البكتيريا المسماة فلوريسسينتلي على الأنسجة ممارسة الضغوط القص في نطاق الفسيولوجية داين 3-10/ سم2 لرفعت. في هذا العمل، قمنا باستخدام معدل تدفق 4 مل/دقيقة يناظر 3 داين/سم2. آخذا في الاعتبار ارتفاع 0.3 مم قناة عبر جميع الأنسجة بقع، والمسافة بين الاختلاس المحملة ومدخل متوسطة حوالي 39 مم، قاعة التروية (كما هو موضح في الشكل 1) يضمن نمواً كاملا الاندفاق الصفحي (إعادة = 3.89 هو أقل بكثير من عام 2000؛ طول المدخل = 0.05 mm أصغر بكثير من المسافة 'مدخل-الابتزاز'، المعلمات الضرورية لفرض نمط تدفق مناسب).
تحت ظروف إجهاد القص، لوحظ على مرفق بكتيرية مماثلة عبر مختلف الأنسجة الابتزاز للعدوى المذهبة س. وس. ابيديرميديس (الشكل 2 و الشكل 3). على الرغم من أن ليس كبيرا، اتجاها نحو التصاق أعلى س المذهبة لمنشورات CH كان ملحوظا.
الدم س. انخفاض كبير في التمسك بالجدار بجف عثر عند مقارنتها بالتصحيح BP (الشكل 4؛ ف < 0.05). عند مقارنة 3 أنواع البكتيريا، والدم س. يعرض أقل بكثير الالتصاق بالجدار بجف فيما يتعلق المذهبة س. و . س. ابيديرميديس (ف < 0.01 وف < 0.05 على التوالي، انظر الفيديو). وبصفة عامة، لاحظنا التصاق بكتيرية مماثلة لجميع الأنسجة التحقيق تحت إجهاد القص.
البيانات المتوفرة لدينا من زيمبابوي العد (الشكل 2، رقم 3، رقم 4) مدعومة بالأسفار مجهرية باستخدام ماسح ضوئي عالية إنتاجية (الشكل 5، 6 الشكل، الشكل 7). يتم عرض الصور البؤر وضوحاً من البكتيريا المسماة التمسك graft الأنسجة. نتيجة لهذا النهج، كنا قادرين على تصور مباشرة الأنسجة عند نضح دون أي وظيفة تجريبية المعالجة لأغراض التوضيح.
وتبين النتائج أن المصدر من أنسجة الاختلاس والاختلافات المورفولوجية السطحية، فضلا عن أدهيسينس البكتيرية ليست المحددات الرئيسية لانضمام البكتيريةلهذه المواد البيولوجية-
رقم 1: صورة لنظام الدائرة تدفق المطورة حديثا (تصميم داخلي بإدارة Biohybrid والأقمشة الطبية، أمي-هلمهولتز معهد الهندسة الطبية، آخن، ألمانيا)- ألف-قاعة تدفق (1) شنت تدفق مجموعة من الأبعاد LxWxH: 125 ملم × 55 مم × 18 ملم (مسامير في تركيبة مع المسمار الجوز عقد الدائرة الأجزاء معا ووضع الضغط عبر الإطار المعدني على أطواق منع التسرب)؛ (2) الجزء العلوي من العمود؛ (3) الورقة طوقا العلوي مع اثنين من الثقوب لإصلاح الروابط الأنابيب، والتي تواصل الدائرة تدفق مع المضخة وخزان السوائل عن طريق نظام الأنابيب؛ (4) المسافة بين مدخل متوسطة والأنسجة (طول المدخل)؛ (5) رقائق رقيقة الشريحة (مع 8 مم انثقاب دائرية للسماح بتعرض الأنسجة لتعليق البكتيرية) (في عطلة من الشريحة هناك مساحة طوقا مطاط، B9شل قطعة النسيج أثناء التروية)؛ (6) ورقة طوقا السفلي مع استراحة مخصصة لوضع الفساد الأنسجة المركبة بين الشريحة المجهر وطوقا المطاط؛ (7) الجزء السفلي من الدائرة تدفق؛ ب إقامة كاملة (8) الشريحة رقائق رقيقة؛ (9) طوقا المطاط؛ (10) ثمانية مسامير مع المقابلة (11) ثمانية المسمار الجوز؛ (12) خزان السائل (400 مل)؛ نظام الأنابيب (13) ؛ وحدة "نضح جيم" (14) مضخة تمعجية؛ (15) مكرسة الأنابيب أن يقاوم قسوة تحوي عمل الضخ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: الالتصاق في المذهبة S. كوان graft الأنسجة تحت ظروف التدفق. البكتيريا المسماة فلوريسسينتلي كانت perfused الفساد ما يزيد على 5 الأنسجة (جدران القناة أو منشورات صمامات القلب) في برنامج تلفزيوني. وكانت البكتيريا بعيدة عن قطع الأنسجة المصابة ب sonication. تقييم المسلسل تخفيف استخدام أسلوب العد زيمبابوي التصاق البكتيريا وأشار إلى زيمبابوي/سم2. يتم التعبير عن جميع النتائج كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n > 3 لمنشورات صمامات القلب بسبب الحد مواد؛ ن > 5 لجدران القناة). زيمبابوي: وحدة تشكيل مستعمرة؛ ص. ب: تامور الأبقار؛ بجف: البقري حبل الوريد؛ CH: cryopreserved homograft. وقد تم تعديل هذا الرقم من فيلوسو et al. (دفتر اليومية لجراحة القلب والأوعية الدموية والصدر 155 (1)، 325-332 (2018)). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: انضمام S. epidermidis graft الأنسجة تحت ظروف التدفق. البكتيريا المسماة فلوريسسينتلي كانت perfused الفساد ما يزيد على 5 الأنسجة (جدران القناة أو منشورات صمامات القلب) في برنامج تلفزيوني. وكانت البكتيريا بعيدة عن قطع الأنسجة المصابة ب sonication. تقييم المسلسل تخفيف استخدام أسلوب العد زيمبابوي التصاق البكتيريا وأشار إلى زيمبابوي/سم2. يتم التعبير عن جميع النتائج كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n > 3 لمنشورات صمامات القلب بسبب الحد مواد؛ ن > 5 لجدران القناة). زيمبابوي: وحدة تشكيل مستعمرة؛ ص. ب: تامور الأبقار؛ بجف: البقري حبل الوريد؛ CH: cryopreserved homograft. وقد تم تعديل هذا الرقم من فيلوسو et al. (دفتر اليومية لجراحة القلب والأوعية الدموية والصدر 155 (1)، 325-332 (2018)). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الالتصاق س. الدم graft الأنسجة تحت ظروف التدفق. البكتيريا المسماة فلوريسسينتلي كانت perfused الفساد ما يزيد على 5 الأنسجة (جدران القناة أو منشورات صمامات القلب) في برنامج تلفزيوني. وكانت البكتيريا بعيدة عن قطع الأنسجة المصابة ب sonication. تقييم المسلسل تخفيف استخدام أسلوب العد زيمبابوي التصاق البكتيريا وأشار إلى زيمبابوي/سم2. يتم التعبير عن جميع النتائج كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 3 لمنشورات صمامات القلب بسبب الحد مواد؛ ن > 5 لجدران القناة). زيمبابوي: وحدة تشكيل مستعمرة؛ ص. ب: تامور الأبقار؛ بجف: البقري حبل الوريد؛ CH: cryopreserved homograft. وقد تم تعديل هذا الرقم من فيلوسو et al. (دفتر اليومية لجراحة القلب والأوعية الدموية والصدر 155 (1)، 325-332 (2018)). * ف < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: التصور في المذهبة S. كوان الالتزام graft الأنسجة عن طريق الفحص المجهري الأسفار. من اليسار إلى اليمين: بجف قناة الجدار وجدار الفصل ونشره بجف CH النشرة. وقد تم تعديل هذا الرقم من فيلوسو et al. (دفتر اليومية لجراحة القلب والأوعية الدموية والصدر 155 (1)، 325-332 (2018)). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: التصور S. epidermidis الانضمام graft الأنسجة باستخدام مجهر الأسفار. من اليسار إلى اليمين: بجف قناة الجدار وجدار الفصل ونشره بجف CH النشرة. وقد تم تعديل هذا الرقم من فيلوسو et al. (دفتر اليومية لجراحة القلب والأوعية الدموية والصدر 155 (1)، 325-332 (2018)). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7: التصور الدم س. الانضمام graft الأنسجة باستخدام مجهر الأسفار. من اليسار إلى اليمين: بجف قناة الجدار وجدار الفصل ونشره بجف CH النشرة. وقد تم تعديل هذا الرقم من فيلوسو et al. (دفتر اليومية لجراحة القلب والأوعية الدموية والصدر 155 (1)، 325-332 (2018)). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إعطاء الملاحظات السريرية الأخيرة التوعية الخاصة لأي كمضاعفات في المرضى بعد أن خضع استبدال صمام6،رفعت13. الخلل الوظيفي للصمام مزروع في IE هو نتيجة تفاعل البكتيريا مع الاختلاس اللمفاوية مما يؤدي إلى واسعة التحريضية وبروكواجولانت ردود فعل1،14. نموذج عرض الرواية في المختبر سمح لنا بالتحقيق إذا كانت الاختلافات في هياكل النسيج وعوامل بكتيرية من المرجح أن تعدل قابلية للإصابة بالعدوى في فيفو استخدام الطعوم15. بجف والأنسجة الاختلاس CH أظهرت الميل مماثلة تجاه تجنيد البكتيرية في ظروف التدفق. ولذلك، تشير البيانات إلى أن عموما مصدرا للأنسجة وفي البنية السطحية، فضلا عن بروتينات لاصقة بكتيرية معينة في حد ذاتها ليست العوامل الرئيسية حاسما في الانضمام البكتيرية الأولية.
مسارات تستحضر التهاب، وبصفة عامة، يتم تنشيط ترسب الأضرار والصفائح الدموية وفيبرينوجين الأنسجة في موقع اللمفاوية المصابة من متعددة اللاعبين1،16. وميزة رئيسية للنموذج المتقدمة في المختبر هو فرصة لتحليل stepwise مساهمة الأطراف المعنية. يمكن أن يحقق عوامل بكتيرية واحدة باستخدام السلالات البكتيرية متحولة أو البكتيريا المحورة وراثيا معربا عن البروتينات وحيدة الالتصاق السطح14. عن طريق اختيار وسائط مختلفة نضح أو بلازما الدم، يمكن تقييم مشاركة بروتينات البلازما وخلايا الدم. سوف تركز المزيد من الدراسات على الأنسجة المتصلة بالعوامل التي الأنسجة سوف يكون المحتضنة مسبقاً مع بروتينات البلازما على سبيل المثال قبل شنت في قاعة تدفق لنضح اللاحقة. منذ اللاعبين تسهم في ظهور الأطراف الاصطناعية صمام أي لا تزال غير واضحة، والدراسات المستقبلية قد كشف العوامل المحتملة ببناء ما يصل إلى إعداد تجريبية أكثر تعقيداً. وعلاوة على ذلك، يرث هذا الإعداد التجريبية إمكانية أن الأنسجة يمكن أن المصنف مع طبقة المفوضية الأوروبية لتحليل التعبير الجيني المفوضية الأوروبية تعتمد على القص. كما يسمح تدفق مواز-لوحة الدائرة التروية عبر شرائح المجهر المغطاة بالمفوضية الأوروبية بسبب ارتفاع داخلية مرنة من قاعة نضح. طلاء مختلفة من كشوف الغطاء باستخدام مختلف المصفوفة خارج الخلية البروتينات أيضا خياراً ممكناً لتقييم التفاعلات الهامة مع مصفوفة سوبيندوثيليال. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يحقق مثبطات دوائية أو الأجسام المضادة الوظيفية لأثرها في حالة كل منهما في دائرة تدفق لدينا. وباختصار، يمكن دراسة مختلف الظروف بالتعقيد المتزايد.
تفعيل الملتهبة في المنطقة المصابة الاختلاس خطوة حاسمة، وتسيطر عليها القص تحابي ترسب الصفائح الدموية المنشط ووحيدات. أثر القص قوات البكتيرية التمسك بنسيج السطوح، مصدر قلق كبير. لمعالجة هذه المسألة، يركز حداثة النظام قدم في المختبر إمكانية تحميل الأنسجة في حجرة تدفق. وهذا يعزز أهمية الأسلوب تتجاوز البدائل الموجودة، التي عادة ما تكون ثابتة التفاعلات بين البكتيريا والأنسجة الكامنة تم التحقيق. على الرغم من أن إجهاد القص مقدم من الهز أو غيرها من القوى الخارجية، فإنه قد لا تم توحيد على نفس المستوى كما أننا يمكن أن تستفيد من نموذجنا تدفق موحد.
يمكن أن نمط تدفق المجراة، غير الفسيولوجية لصالح التصاق البكتيريا كبداية أي على مستوى قنوات مزروع صمام. تم العثور على إجهاد القص لمتابعة تنظيم معلمات التهاب غشائي مثل سيتوكين إفراز وزيادة عامل نسيج بوساطة تخثر17. تفاعل الأنسجة الأساسية المستخدمة للأطراف الاصطناعية صمام مع البكتيريا وتأثيرها على التعبير الجيني المفوضية الأوروبية تحت إجهاد القص مهم لبناء صمام أقل قدرة على الالتصاق البكتيرية والتهاب مزمن.
المسائل التقنية القاعدية الدائرة ملفقة تسمح التحقيقات بموجب شروط موحدة في الاندفاق الصفحي18. لضمان تدفق الصفحي نمواً كاملا في موقع الأنسجة التحقيق هو شيدت قاعة جبل الفساد في مسافة معينة من مدخل متوسطة (إلى حد كبير أطول من طول المدخل محسوب، راجع النتائج و الشكل 1). وسيتيح استخدام مضخات مختلفة في النظام إجراء التجارب تحت ظروف التدفق نابض أو مضطربة في المستقبل.
يمنع الإطار المرن الدائرة الدائرة فعلياً من تسريب والارتفاع الداخلي للإطار يتيح تكييف لسمك الأنسجة. بناء نظام كامل ليتيح تدفق المتداولة، التي لها أهمية لأداء بيرفوسيونس طويلة الأمد مع استخدام كمية كل منها في المتوسط. استناداً إلى الدراسات السابقة لدينا بروتوكول الانضمام يفترض جرعة تلقيح البكتيري من 107 زيمبابوي/مل4،حضانة 1 ح19. باستخدام هذه الإعدادات، وكانت مستويات الالتصاق القابلة للاكتشاف، أن كانت منخفضة بما يكفي لتكون قادرة على مراقبة زيادة كبيرة في الالتزام البكتيرية دون تشبع السطح الاختلاس الأنسجة. وعلاوة على ذلك، في هذه الفترة من الزمن، كان ممكناً تلاحظ الاختلافات المحتملة في الربط عبر سلالات المتخذة في هذه الدراسة. معلمات القص تناولها هنا في نطاق الفسيولوجية والأمثل للأوعية الدموية، التي كانت لدينا المستهدفة فيما يتعلق رفعت.
المزيد من التعديلات للأسلوب سوف تركز على استهلاك أكثر كفاءة من متوسطة أثناء الإجراء فضلا عن تبسيط الإعداد المتزايدة. وبالإضافة إلى ذلك، سوف يخفف تصميم جديد بما في ذلك فتحات متعددة للجمعية الأنسجة تجربة كاملة في جوانب مثل الكفاءة.
في هذه المرحلة لدينا أسلوب يركز على النتائج نقطة النهاية ولا اختبرت لتطبيقات الوقت الحقيقي مثل الدورة الزمنية لدينامية الأحداث التي تحدث على سطح النسيج. وهكذا، يبقى هذا التطبيق الأوسع نطاقا قيد النظر؛ ومع ذلك، مسائل مثل أوتوفلوريسسينسي الأنسجة، والأمثل لوضع بروتوكول مجهر الأسفار المناسبة وكذلك تكييف الدائرة يلزم تناولها. كذلك، قد كيفت الأسلوب في حالته الراهنة للرصد في الوقت الحقيقي البكتيرية ملزمة لطبقات المفوضية الأوروبية على شرائح المجهر مجهر الأسفار تستقيم. حاليا، نحن قادرون على تصور البكتيريا وسائر مكونات/خلايا الدم ملزمة للأنسجة بالفحص المجهري [كنفوكل] دون حاجة إلى تجهيز الأنسجة تجريبي آخر، الذي هو المهيئة للاستعداد للتصور في الوقت الحقيقي ظل تدفق بالمقلوب مجاهر الأسفار.
في هذه الدراسة، قدمت التحديد الكمي لالتصاق البكتيريا عد زيمبابوي بينما كان الفحص المجهري fluorescence أداة داعمة وغير الكمية. بسبب قرار القضايا الناجمة عن عدم وجود عدسة المجهر كافية، تصوير الأسفار تبين أن أقل استنساخه في أيدينا من تخفيف المسلسل. ومع ذلك، من الممكن استخدام fluorescence المسح الضوئي للقياس الكمي عند مناسبة الهدف العدسة يمكن إلقاء الضوء على حجم الاختلاس كامل 8 ملم في القطر للقياس الكمي البؤر موثوق بها. باستخدام برنامج معالجة صور (مثل إيماجيج)، قد كمياً وحدات fluorescence المطلق لعينات الأنسجة التحقيق وقد أعرب عن التصاق البكتيريا على سبيل المثال كإشارة نسبي للرقابة الداخلية (perfused الطعوم مع بكتيريا غير المسمى).
القيد الرئيسي لهذا الإعداد التجريبية هي القضايا المرتبطة بالدراسات في المختبر بشكل عام. يمكن نقل النتائج التي تم التوصل إليها باستخدام هذا في المختبر تدفق الدائرة نموذج إلى نموذج حيوان في فيفو تأكيد.
وفي الختام، يسمح هذا النموذج في المختبر التحقيق واحد البكتيريا والأنسجة والقائم على القص العوامل المساهمة في ظهور التصاق البكتيريا إلى الأنسجة بطريقة تدريجية. المعرفة ممكنة بموجب هذا يمكن أن تسهم في تنمية أكثر فعالية للوقاية والعلاج من IE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا شيء.
Acknowledgments
أشرفت على هذه الدراسة من منحة "وفين كو صندوق البحوث" (OT/14/097) نظراً للصحة الإنجابية. وكان عبرها "زميل ما بعد الدكتوراه" في "مؤسسة أبحاث فو"-فلاندرز (بلجيكا؛ منح رقم-12K0916N) ويدعمها صندوق البحوث السريرية لوفين UZ RH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Bovine Jugular Vein conduits (BJV) | Contegra conduit; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH cryopreserved homograft | European Homograft Bank (EHB) | - | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| human Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgium | BE171464 LOT:16G12C |
|
| Tryptic soy broth (TSB) | Fluka, Steinheim, Germany | 22092-500G | |
| Heart infusion broth (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphate buffered saline (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) | Sigma-Aldrich, Germany | 21878-100MG-F | |
| Peristaltic pump (MODEL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany | 631942-2 | |
| Sonication bath | VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen by ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ | Millipore | 87206462 | |
| Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-well on Lumox detachable | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Stainless Steel - surgical Blades | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperature range: –80 to 200°C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure |
| PharMed BPT Tubing | Saint-Gobain | AY242012 | Autoclavable 30 min at 121°C |
| Tygon LMT-55 Tubing | Saint Gobain Performance Plastics™ | 15312022 | |
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
References
- Que, Y. A., Moreillon, P.
- Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
- Moreillon, P., Que, Y. A.
- Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
- Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
- Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
- Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
- Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
- Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
- Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
- Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
- Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
- Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
- Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
- Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
- Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
- Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
- Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).
