Summary
我们描述了一个内部设计的体外流室模型, 它允许研究细菌对移植组织的粘附。
Abstract
各种瓣膜导管和支架安装的瓣膜用于先天性心脏病患者的右心室流出道 (rvot) 瓣膜置换术。然而, 当使用假肢材料时, 这些移植物容易受到细菌感染和各种宿主反应。
识别在微生物血管内粘连中发挥重要作用的细菌和宿主因素对于更好地了解感染性心内膜炎 (ie) 等感染的病理生理学和开展预防工作具有重要意义策略。因此, 有必要建立有效的模型来研究细菌在生理剪切条件下的粘附情况。在这里, 我们描述了一个新设计的基于平行板的体外灌注室的使用情况, 该室允许研究细菌对不同器官移植组织的粘附性, 如暴露的细胞外基质、内皮细胞和惰性区域.该方法结合成菌区量值, 可用于评价移植物材料在流动条件下对细菌粘附的倾向。此外, 流室系统还可用于研究血液成分在剪切条件下细菌粘附中的作用。我们证明, 组织的来源, 其表面形态和细菌物种特异性不是主要的决定细菌坚持到移植组织的因素, 使用我们的内部设计的体外灌注模型。
Introduction
金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌) 采用了各种毒力策略来规避宿主免疫防御系统, 使植入人体循环的生物或非生物表面殖民, 从而导致严重的血管内感染, 如败血症和ie1,2,3,4,5。ie 仍然是一个重要的治疗相关并发症的患者植入假体心脏瓣膜后, 而个别因素的原因, 导致 ie7 的发病还没有完全了解 6,7。在流动条件下, 细菌会遇到剪切力, 为了粘附在容器壁8 上, 它们需要克服剪切力。模型可以研究细菌和假体瓣膜组织或内皮在流动中的相互作用, 因为它们更多地反映了体内的情况。
几种特殊的机制促进细菌粘附到内皮细胞 (ecs) 和暴露的内皮细胞下基质 (ecm), 导致组织定植和植物成熟, 是 ie9中必不可少的早期步骤。各种葡萄球菌表面蛋白或 mscram (识别粘附基质分子的微生物表面成分) 被描述为通过与纤维连接蛋白等分子相互作用而与宿主细胞和 ecm 蛋白粘附的介质,纤维蛋白原、胶原蛋白和冯·威利布兰德因子 (vwf)8、10、11。然而, 鉴于分子内折叠的一些毒力因素, 大多在静态条件下研究, 其中许多相互作用可能有不同的相关性, 在循环血液的血管内感染。
因此, 我们提出了一个内部设计的体外平行板流动室模型, 允许评估细菌在组织移植中植入 rvot 位置时对 ecm 和 ecs 不同成分的粘附情况。本研究中描述的方法的总体目的是研究细菌与潜在血管内组织在流动条件下的相互作用机制, 这些机制与血液病原体的体内环境密切相关, 如s. 金牛座.这种新的方法侧重于移植组织表面对细菌粘附的敏感性, 以确定影响 ie 发展的潜在危险因素。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 为体外研究准备移植组织
注: 使用了三种类型的组织: 牛心包贴片 (bp)、冷冻保留同种异体移植 (ch) 和牛颈静脉移植 (bjv)。在 bjv 导管和 ch (由欧洲同种异体移植银行 (ehb) 处理并在使用前储存在液氮中的组织) 的情况下, 使用壁面和瓣膜小叶。从制造商处购买了 bp 贴片和 bjv 管道。使用前, 按照 ehb 指令12 解冻 ch。
- 使用前使用0.9% 的氯化钠冲洗所有组织。
- 准备组织活检使用一次性皮肤活检冲床, 以削减圆形组织块 (直径10毫米)。
- 使用一次性无菌手术刀将所有组织贴片切割到相同的高度。
- 对于用戊二醛固定的组织 (例如bjv 导管), 用 200 gl 的人白蛋白在4°c 孵育移植件过夜, 以中和固定剂。
- 用0.9% 的氯化钠在微滴板中清洗戊二醛残留物。 重复 3次, 1分钟。
2. 为灌注实验准备细菌
注: 使用了三种细菌分离物:金黄色葡萄球菌科文 (atcc 12598)、 s. 表皮虫atcc 149900 和s. sanguinis nctc 7864。在37°c 的色氨化豆汤 (tsb) 中生长, 在37°c 时生长的金银花和表皮葡萄球菌, 在脑心输液液 (bhi) 中生长5% 的 co2.
- 在固体血琼脂板上准备一夜培养细菌。
- 使用无菌循环刮掉冷冻细菌, 并接种到 mueller-hinton 血琼脂板上, 以便在37°c 条件下进行夜间培养。
- 使用无菌接种回路从隔夜血琼脂培养中提取单个菌落, 并在14毫升管中接种 tsb 或 bhi 10 毫升, 在37°c 下隔夜培养。
- 离心隔夜培养物 (3000 x 克, 4°c, 10分钟), 并在10毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中重新悬浮颗粒。将14毫升管放在冰上。
- 在乙醇中制备 5 (6)-羧基-荧光素 n-羟基琥珀酰亚胺酯 (cf) 3.7 mg/ml 溶液, 并在-20°c 下贮存。进一步稀释 cf 的库存到150μgml 使用 "超纯水"。
注意: 使用铝箔保护管材不受光线照射, 并在-20°c 下存放。 - 将细菌 (3000 x 克, 4°c, 10分钟) 离心, 并在800μl 的 pbs 中重新悬浮颗粒, 并添加 150μgml cf 溶液中的 200μl (用于灌注实验的最终浓度为 30μg/ml)。使用铝箔保护管材不受光线的影响, 并使用轨道振动台孵育30分钟。
- 标记后, 用2% 的牛血清白蛋白 (bsa) 溶液阻断 pbs 和自旋 (3000 x g, 4°c, 10分钟)。通过离心 (3000 x 克, 4°c, 10分钟), 使用10毫升的 pbs 和颗粒细菌进行清洗。
- 用 pbs 稀释细菌, 以获得 10个 7个菌落形成单位 (cfu)/ml (经 mueller-hinton 血琼脂板上的 cfu 验证), 相当于0.65 的 od600 (光学密度)。在灌注实验之前, 把管子放在冰上的黑暗中。
小说请记住, od600测量反映了细菌的大致数量。为了计算有效接种剂量, 串行稀释法是验证第3.8 节所述 od 数字的另一个必要步骤。
3. 利用平行板流动室进行体外灌注实验
- 将直径为10毫米、厚度相同 (在步骤 1.1-1.5 中制备) 的组织活检安装到流室系统中, 内表面朝上, 与细菌悬浮液接触。
注意: 在不同的移植物中, 相同的组织厚度可确保在通道中达到相同的组织高度, 从而在所有条件下都能获得层流。流室的所有元素都在图 1中给出并描述了。- 要开始该协议, 请将圆形纸巾放在带有8毫米圆形穿孔和橡胶垫片的显微镜下的幻灯片之间。
注: 显微镜滑块具有超薄的底膜, 可产生8毫米孔。它与橡胶片一起固定组织, 使标本与流动介质之间能够直接接触, 并防止实验期间活检的脱位。被调查的组织的表面, 是暴露在流动 (较小的直径) 不能操纵的钳子。 - 将带纸巾的支架插入嵌入腔底金属框架中的垫片板。
- 将上部金属框架与相应的垫片片连接到腔的底部, 并带有先前插入的组织支架。随后用八个螺丝和螺母安装整个腔室。确保在移植物之间的腔高始终相同。
注意: 房间高度应始终在拧紧螺丝时确定。使用卡钳或尺子。
- 要开始该协议, 请将圆形纸巾放在带有8毫米圆形穿孔和橡胶垫片的显微镜下的幻灯片之间。
- 用蠕动泵连接流动室, 用管道连接流体储液罐。
- 在剪切应力为 3dyne/cm 2 (每平方厘米压力单位) 的 pbs 中, 使用悬浮剂为 10 7 cpuml 的组织 (经 cfu 计数验证, 并与 od 600 测量相关)荧光标记的细菌.蠕动泵 (流量 4 mL/min) 的装置, 使用在37°c 条件下使用板式恒温器 (材料表) 的400毫升细菌库 (内部设计,图 1), 为期 1小时.
- 使用相同的收集水库连续循环100毫升细菌悬浮液。
- 灌注后, 用实验室轨道振动台, 用4毫升 pbs 在12孔板中两次将组织块洗干净, 每次3分钟。随后使用直径较小的皮肤活检冲床切割移植物的内侧。
- 将每个组织活检放入一个单独的14毫升管, 其中含有1毫升的不育 0.9% ncl。将管子标记为 #1。
- 使用超声浴从组织中分离细菌 10分钟 (振幅 = 100%, 频率 = 45 khz)。
注: 在 tsb 液体培养基中, 应在37°c 隔夜孵育斑块时评估细菌从组织移植中完全分离, 然后进行 od600测量, 而不是使用无细菌溶液处理的对照补丁。 - 使用连续稀释方法在 mueller-hinton 血琼脂板上计数 cfu。
- 制备一个带有10毫升无菌盐水的14毫升管, 使超声术后获得的细菌悬浮液连续稀释。将这根管子标记为 #2。
注: 对于每个组织实验, 需要一根具有0.9% 氯化钠的10毫升的管。 - 从步骤2.7 开始, 准备三个带有10毫升不育0.9% 氯化钠的14毫升管, 用于初始细菌悬浮液的连续稀释。将管贴上标签, 如 #3、#4、#5。
注意: 此步骤是必要的, 以了解真正的 cfu 数字在细菌悬浮液用于灌注实验。 - 涡流混合每个管15s 涡旋管与组织活检以及最初的细菌悬浮液, 使连续稀释。
- 准备三个琼脂板, 两个用于组织实验 (细菌灌注和控制灌注 pbs), 第三个用于用于灌注的初始细菌悬浮液。
- 为组织实验标记每个板的三个扇区, 方法如下: 10-1、10-3 和 10-4. 要计算细菌中 cfu 的数量, 请将其标记如下:10-1、10-3、 10-5 和 10-7.
注: 琼脂板上的所有指示, 如10-1、10-3等, 均指第二天计算的 cmuml 的最终编号。控制板不需要任何扇区。使用前, 应将血琼脂板放置在层流罩下, 并打开以去除多余的水分。 - 为了继续准备系列稀释剂, 将100μl 的管 #1 转移到管 #2, 并与涡流大力混合。
- 将管 #1 和 #2 的内容物的100μl 传播到琼脂板的 10 至1和10-3 个扇区。同样, 在 10-4 扇区上传播 10μl的管 #2, 重复这一步 4次, 从每个10μl 的体积中获得4个单独的生长。
注: 由于用于电镀到 10-4扇区的体积较小, 建议有多个液滴, 以制造平均数量的生长 cfu。 - 为准备初始培养物的连续稀释, 将100μl 的细菌悬浮液从2.7 步转移到管 #3, 并与涡旋大力混合。在管中加入100μl 的管 #3 #4 搅拌均匀, 并对随后的管 #5 重复操作。
- 将 #3、#4、#5 和调整后的细菌悬浮液 (步骤 2.7) 的管含量分别涂在血琼脂板的 10-3、10-5、10-7和10-1 区,、、和调整后的细菌悬浮液 (步骤 2.7)。
- 将血琼脂板留在层流罩中, 使细菌扩散干燥, 通常为10分钟。之后, 将板材放置在 37°c, 进行隔夜孵育。
- 经过一夜孵育后, 对细菌菌落进行计数, 以获得因粘附于组织活检而产生的 cfu 数量, 以及用于灌注的起始细菌悬浮液中的 cfus/ml。快递结果为 cfucms2。
- 制备一个带有10毫升无菌盐水的14毫升管, 使超声术后获得的细菌悬浮液连续稀释。将这根管子标记为 #2。
4. 灌注时附合细菌移植组织的荧光显微镜
- 灌注后, 用 pbs 清洗纸巾片 (见3.5 步), 用直径较小的冲床切割移植物的内部部分。
- 准备6孔板, 放置安装介质的液滴 (材料表)。
- 将每一块带有完美表面的组织向下放置在一滴水的安装介质上。
- 使用荧光扫描仪读取板 (材料表)。根据用于细菌标记的荧光体设置激发和发射波长的参数。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
为了更好地了解 ie 发育背后的机制, 该模型能够评估感染发病体内存在的细菌和组织相关因素。
在详细的, 新的体外方法允许量化细菌在流动条件下对不同的移植组织的粘附, 在施加剪切应力的组织上灌注荧光标记的细菌, 在3-10 的生理范围内施加剪切应力/cm2为 rvot。在这项工作中, 我们使用了 4 mL/min 的流速, 对应于 3 dyne/cm 2.考虑到所有组织补丁的通道高度为 0.3 mm、安装的移植物与介质入口之间的距离约为 39 mm, 灌注室 (如图 1所示) 保证了完全发育的层流 (re = 3.89 是明显低于 2000年;入口长度 = 0.05 mm 明显小于距离 "内移接", 这些参数是假设适当的流动模式所必需的)。
在剪切应力条件下, 在不同的移植组织中观察到类似的细菌附着, 用于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染 (图 2和图 3)。虽然不显著,但一种明显的趋势是, 金黄色葡萄球菌与 ch 传单的粘附率较高。
与 bp贴片相比, 对 bjv 壁的粘附率显著降低 (图 4;p < 0.05)。在比较3种细菌时, 与金黄色葡萄球菌和表皮肌相比, 对 bjv 壁的粘附程度明显较低 (p < 0.01 和 p 分别为 0.01 < 0.05, 请参见视频)。一般情况下, 我们观察到类似的细菌粘附到所有组织在剪切应力下被调查。
我们来自 cfu 计数的数据 (图 2,图 3, 图 4) 由使用高吞吐量扫描仪的荧光显微镜支持 (图 5,图 6,图 7). 图像呈现明显的焦点标记细菌粘附到移植组织。由于这种方法, 我们能够直接可视化组织在灌注时, 没有任何实验后处理的目的, 为说明的目的。
结果表明, 移植组织的来源、表面形态差异以及细菌粘附剂并不是细菌粘附这些生物材料的主要决定因素。
图 1: 德国亚琛生物混合 & 医疗纺织品部----赫尔姆霍兹生物医学工程研究所的内部设计) 新开发的流室系统的图像.a. 安装尺寸lxwxh:125 mm x55 mm x18 毫米的流动装置(螺丝与螺丝螺母组合将箱体部件固定在一起, 并通过金属框架在垫圈上施加压力, 以防止泄漏);(2)列的上半部分;(3)带有两个孔的上垫片板固定油管连接器, 通过油管系统将流动室与泵和流体储罐连接;(4)介质入口与组织之间的距离 (入口长度);(5)薄箔滑块 (带8毫米圆形穿孔, 允许组织暴露在细菌悬浮液中) (在滑块的凹处有橡胶垫片b9 的空间, 以便在灌注过程中固定组织件);(6)底部垫片片, 带有专用凹槽, 将组织移植安装在显微镜滑块和橡胶垫片之间;(7)流动室的底部;b. 全设置 (8)薄箔滑块;(9)橡胶垫片;(10) 8个螺丝, 对应的 ( 11) 8个螺丝螺母;(12)流体储集层 (400 毫升);(13)管路系统;c. 灌注装置(14)蠕动泵;(15)可承受蠕动动作严峻考验的专用油管。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:金黄色葡萄球菌在流动条件下对移植组织的粘附。在 pbs 中, 荧光标记的细菌在5个移植组织 (导管壁或瓣膜小叶) 上灌注。细菌通过超声分离出受感染的组织碎片。采用 cfu 计数法, 采用连续稀释法对细菌粘附进行评价, 并以 cfu/cm2 为指示。由于材料的限制, 所有结果均表示为平均±sem (n > 3, 但对于材料的限制, 结果为 5 > 5。cfu:成菌性单位;bp:牛心包;bovine:牛颈静脉;冷冻保存的同种移植。这一数字已从 veloso等人处修改。(胸外科和心血管外科杂志 155 (1), 325-332 (2018))。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:表皮葡萄球菌在流动条件下与移植组织的粘附。在 pbs 中, 荧光标记的细菌在5个移植组织 (导管壁或瓣膜小叶) 上灌注。细菌通过超声分离出受感染的组织碎片。采用 cfu 计数法, 采用连续稀释法对细菌粘附进行评价, 并以 cfu/cm2 为指示。由于材料的限制, 所有结果均表示为平均±sem (n > 3, 但对于材料的限制, 结果为 5 > 5。cfu:成菌性单位;bp:牛心包;bovine:牛颈静脉;冷冻保存的同种移植。这一数字已从 veloso等人处修改。(胸外科和心血管外科杂志 155 (1), 325-332 (2018))。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 在流动条件下, 刺五加对移植组织的粘附。在 pbs 中, 荧光标记的细菌在5个移植组织 (导管壁或瓣膜小叶) 上灌注。细菌通过超声分离出受感染的组织碎片。采用 cfu 计数法, 采用连续稀释法对细菌粘附进行评价, 并以 cfu/cm2 为指示。由于材料的限制, 所有结果均表示为平均±sem (n = 3), 因为材料有限; n > 5 表示为导管壁)。cfu:成菌性单位;bp:牛心包;bovine:牛颈静脉;冷冻保存的同种移植。这一数字已从 veloso等人处修改。(胸外科和心血管外科杂志 155 (1), 325-332 (2018))。* p < 0.05。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 用荧光显微镜显示金黄色葡萄球菌对移植组织的粘附。从左到右: bjv 管道墙、bjv 传单、ch 壁和 ch 传单。这一数字已从 veloso等人处修改。(胸外科和心血管外科杂志 155 (1), 325-332 (2018))。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 用荧光显微镜显示表皮葡萄球菌与移植组织的粘附。从左到右: bjv 管道墙、bjv 传单、ch 壁和 ch 传单。这一数字已从 veloso等人处修改。(胸外科和心血管外科杂志 155 (1), 325-332 (2018))。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 荧光显微镜显示了刺五加与移植组织的粘附。从左到右: bjv 管道墙、bjv 传单、ch 壁和 ch 传单。这一数字已从 veloso等人处修改。(胸外科和心血管外科杂志 155 (1), 325-332 (2018))。请点击这里查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
最近的临床观察使 ie 作为一种并发症的患者接受瓣膜置换术 rvot6,13。ie 中植入瓣膜功能障碍是细菌与血管内移植物相互作用的结果, 导致广泛的炎症和凝血反应1,14。提出的新的体外模型使我们能够研究组织结构和细菌因素的差异是否可能调节体内使用的移植物15对感染的易感性.bjv 和 ch 移植组织在流动条件下对细菌招募表现出相似的倾向。因此, 数据表明, 一般来说, 组织的来源及其表面结构以及特定的细菌粘合剂蛋白质本身并不是最初细菌粘附的主要决定因素。
一般来说, 在受感染的血管内部位引起炎症、组织损伤、血小板和纤维蛋白沉积的途径是由多个参与者1,16激活的。开发的体外模型的一个主要优点是有机会逐步分析参与者的贡献。单细菌因素可以通过使用细菌突变菌株或转基因细菌在其表面表达单一粘附蛋白14来研究。通过选择不同的灌注介质、血浆或血液, 可以评估血浆蛋白和血细胞的参与情况。进一步的研究将集中在组织相关的因素, 组织将与血浆蛋白预先孵育,例如, 安装在流室随后的灌注。由于促成假体瓣膜 ie 发生的玩家仍然不清楚, 未来的研究可能会通过建立一个更复杂的实验设置来解开潜在的因素。此外, 该实验装置还继承了用 ec 层播种组织来分析剪切依赖性 ec 基因表达的可能性。平行板流动室还允许在 ec 覆盖的显微镜滑块上灌注, 因为灌注室的内部高度灵活。使用不同的细胞外基质蛋白的盖板滑移的不同涂层也是评估与内皮下基质的重要相互作用的一个可能的选择。此外, 可以研究药理抑制剂或功能抗体在我们的流室各自的条件下的作用。总之, 各种条件可以通过增加复杂性来研究。
在移植物的受感染区域的炎症激活是一个关键的, 剪切控制的步骤, 有利于激活血小板和单核细胞的沉积。剪切力对细菌粘附于组织表面的影响是一个主要问题。为了解决这个问题, 所提出的体外系统的新颖性集中在在流动室中安装组织的可能性上。这加强了该方法的重要性, 超越了现有的替代品, 在这种方法中, 通常已经调查了细菌和潜在组织之间的静态相互作用。尽管剪切应力是由晃动或其他外力提出的, 但并没有像我们从均匀流动模型中获得的那样标准化到相同的水平。
在体内,非生理流动模式可以有利于细菌粘附作为 ie 的开始在阀门水平的植入导管。剪切应激被发现提高内皮炎症参数, 如细胞因子分泌和增加组织因子介导的凝血 17.在剪切应力作用下, 用于瓣膜假体与细菌的基础组织的相互作用及其对 ec 基因表达的影响对于构建一个不太能够引起细菌粘附和慢性炎症的瓣膜具有重要意义。
制造的房间的基本技术问题允许调查在标准化的情况下在层流18。为了确保在被调查组织的部位完全发育的层流, 建造了腔体, 使其与介质入口有一定的距离 (明显长于计算出的入口长度, 见结果和图 1)。在系统中使用不同的泵可以在未来的脉动或湍流条件下进行实验。
箱体的柔性框架有效地防止了箱体的泄漏, 框架的内部高度允许适应组织厚度。整个系统的结构使循环流成为重要的执行长期持久的灌注与使用相应的数量的介质。在以前研究的基础上, 我们的粘附协议假定细菌接种剂量为 10 7 chu/ml, 用于1小时孵育4,19。通过使用这些设置, 粘附水平是可检测的, 尽管低到能够观察到细菌粘附的显著增强, 而不会饱和的组织移植表面。此外, 在这段时间内, 注意到本研究中对菌株之间的结合存在潜在差异也是可行的。这里讨论的剪切参数在生理范围内, 并针对血管进行了优化, 这也是我们 rvot 的目标。
该方法的进一步修改将侧重于在过程中更有效地消耗介质, 以及简化安装设置。此外, 包括组织组装的多个插槽的新设计将在效率等方面简化整个实验。
在这一阶段, 我们的方法侧重于终点结果, 没有对实时应用进行测试, 例如组织表面发生动态事件的时间过程。因此, 这一更广泛的适用仍在审议之中;然而, 组织自体荧光、优化适当的荧光显微镜协议以及调整腔室等问题需要解决。此外, 该方法在目前的状态下, 可适用于用直立荧光显微镜实时监测显微镜幻灯片上的细菌结合与 ec 层的结合。目前, 我们能够通过共聚焦显微镜将细菌和其他血液成分细胞结合在组织中, 而无需进行实验后组织处理, 这就很容易通过倒置在流动下进行实时可视化。荧光显微镜。
在本研究中, 通过 cfu 计数提供细菌粘附的定量, 而荧光显微镜是一种支持性的、非定量的工具。由于缺乏足够的显微镜透镜所产生的分辨率问题, 荧光成像结果在我们手中的重现性不如系列稀释。然而, 当合适的物镜可以照亮直径为8毫米的整个接枝尺寸时, 可以使用荧光扫描进行定量, 从而获得可靠的病灶定量。使用图像处理程序 (如 imagej), 被调查的组织标本的绝对荧光单位可以量化, 细菌粘附可能被表示为相对信号, 例如内部控制 (与无标记的细菌)。
这种实验设置的主要局限性是与一般体外研究有关的问题。利用这种体外流动室模型获得的结果可以转移到动物模型中进行体内确认。
总之, 这种体外模型允许研究单个细菌, 组织和基于剪切的因素, 导致细菌粘附到组织的逐步方式。在此启用的知识可有助于发展更有效的 ie 预防和治疗。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有。
Acknowledgments
这项研究是由向生殖健康提供的研究基金 ku leuven (ot/14/197) 的赠款赞助的。trv 是佛兰德研究基金会的博士后研究员 (比利时;grant 编号-12k0916n) 和 rh 由 uz leuven 的临床研究基金提供支助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Bovine Jugular Vein conduits (BJV) | Contegra conduit; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH cryopreserved homograft | European Homograft Bank (EHB) | - | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| human Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgium | BE171464 LOT:16G12C |
|
| Tryptic soy broth (TSB) | Fluka, Steinheim, Germany | 22092-500G | |
| Heart infusion broth (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphate buffered saline (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) | Sigma-Aldrich, Germany | 21878-100MG-F | |
| Peristaltic pump (MODEL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany | 631942-2 | |
| Sonication bath | VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen by ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ | Millipore | 87206462 | |
| Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-well on Lumox detachable | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Stainless Steel - surgical Blades | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperature range: –80 to 200°C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure |
| PharMed BPT Tubing | Saint-Gobain | AY242012 | Autoclavable 30 min at 121°C |
| Tygon LMT-55 Tubing | Saint Gobain Performance Plastics™ | 15312022 | |
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
References
- Que, Y. A., Moreillon, P.
- Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
- Moreillon, P., Que, Y. A.
- Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
- Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
- Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
- Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
- Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
- Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
- Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
- Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
- Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
- Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
- Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
- Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
- Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
- Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
- Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).
