Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En In Vitro -modell av en parallell-Plate perfusjon System å studere bakteriell tilslutning å pode vev

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58476
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 3, 3, 4, 1, 5, 2, 1
1Cardiovascular Developmental Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 2Centre for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 3Department of Biohybrid & Medical Textiles, AME - Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, RWTH Aachen University, 4European Homograft Bank, Saint Jean Clinique, 5Division of Clinical Cardiac Surgery, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

Summary

Vi beskriver en internt utviklet i vitro flow chamber modell, som gjør etterforskningen av bakteriell tilslutning til pode vev.

Abstract

Ulike valved rør og stent montert ventiler brukes til høyre ventrikkel utløp skrift (RVOT) ventil erstatning i pasienter med medfødte hjertesykdommer. Når du bruker protese materialer men, er disse grafts mottakelige for bakterieinfeksjoner og ulike vert svar.

Identifikasjon av bakteriell og vert faktorer som spiller en viktig rolle i endovascular tilslutning av mikroorganismer er viktig å forstå i Patofysiologien ved utbruddet av infeksjoner som infeksiøs endokarditt (IE) og å utvikle forebyggende strategier. Derfor er utviklingen av kompetente modeller å undersøke bakteriell vedheft fysiologiske skjær vilkår nødvendig. Her beskriver vi bruk av en nyutviklet i vitro perfusjon kammer basert på parallell plater som lar studiet av bakteriell tilslutning til forskjellige komponenter av pode vev som synlige ekstracellulær matrix og endotelceller inert områder . Denne metoden kombinert med colony-forming unit (CFU) teller er tilstrekkelig til å evalueres tilbøyelighet til pode materiale mot bakteriell vedheft under flyt. Videre kan, flow chamber systemet brukes til å undersøke hvilken rolle blod komponenter i bakteriell vedheft under skjær forhold. Vi viste at kilden til vev, overflate morfologi og bakterie-art spesifisitet ikke er den store avgjørende faktorer i bakteriell tilslutning til pode vev ved å bruke vår interne designet i vitro perfusjonsmåler modell.

Introduction

Gule stafylokokker (S. aureus) benytter en rekke virulens strategier for å omgå immunforsvar forsvar vertssystemet kolonisere biologiske eller ikke-biologiske overflater implantert i menneskelig sirkulasjon, som fører til alvorlige intravascular infeksjoner som sepsis og IE1,2,3,4,5. IE er fortsatt et viktig behandling forbindes komplikasjoner i pasienter etter implantasjon av protese hjertet ventiler mens individuelle faktorer som bidrar til utbruddet av IEare ikke ennå fullt ut forstått6,7. Under strømningsforhold møte bakterier skjær styrker, som de må overvinne for å overholde til fartøyet veggen8. Modeller, som tillater studere samspillet mellom bakterier og protese ventil vev eller endotelet under flyt, er interessante som de reflekterer i vivo situasjonen mer.

Flere spesifikke mekanismene lette bakteriell tilslutning til endotelceller (ECs) og utsatte subendothelial matrix (EFM) fører til vev kolonisering og modning av vegetasjon, som viktige, tidlige trinn i IE9. Ulike stafylokokk overflaten proteiner eller MSCRAMMs (mikrobiell overflaten komponentene gjenkjenne selvklebende matrix molekyler) har blitt beskrevet som meglere på vedheft til verten cellene og ECM proteiner av samspill med molekyler som fibronectin, fibrinogen, kollagen og von Willebrand faktor (VWF)8,10,11. Men i lys av intra molekylær folding av noen virulens faktorer, hovedsakelig studerte i statisk forhold, kan mange av disse interaksjoner ha forskjellige relevans endovascular infeksjoner i sirkulerende blod.

Derfor presenterer vi en internt utviklet i vitro parallell-plate flyt kammer modell, som lar vurdering av bakteriell tilslutning til forskjellige komponenter av ECM og ECs i sammenheng med vev grafts implantert i RVOT posisjon. Formålet med metoden beskrevet i dette arbeidet er å studere mekanismer for samhandling mellom bakterier og underliggende endovascular vev i strømningsforhold, som er nært knyttet til miljøet i vivo blodet patogener som S. aureus. Denne romanen tilnærming fokuserer på mottakelighet av pode vev overflater å bakteriell tilslutning til å identifisere mulige risikofaktorer for utvikling av IE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. klargjør pode vev for In Vitro studier

Merk: Tre typer vev ble brukt: Bovine Pericardium patch (BP), Cryopreserved Homograft (CH) og storfe vena jugularis grafts (BJV). Ved BJV kanal og CH (vev behandlet av europeiske Homograft Bank (EHB) og lagret i flytende nitrogen før å bruke), ble både vegg og Valvulær flygeblader brukt. BP oppdateringen og BJV kanal ble kjøpt fra produsentene. Før bruk må tine CH etter EHB instruksjoner12.

  1. Skyll alle vev med 0,9% NaCl før bruk.
  2. Forberede vev biopsier bruker en engangs huden biopsi slag å kutte sirkulær vev stykker (10 mm i diameter).
  3. Kuttet alle vev oppdateringer til samme høyde bruke engangs sterilt skalpeller.
  4. For vev fast med glutaraldehyde (for eksempel BJV kanal), ruge pode stykker overnatting på 4 ° C med 200 g/L av menneskelig albumin å nøytralisere bindemiddel.
  5. Vask ut rester av glutaraldehyde med 0,9% NaCl i en microtiter plate.  Gjenta 3 ganger i 1 minutt.

2. forbereder bakterier perfusjon eksperimenter

Merk: Tre bakteriell isolerer ble brukt: S. aureus Cowan (ATCC 12598), S. epidermidis ATCC 149900 og S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus og S. epidermidis ble dyrket på 37 ° C i tryptic soya kjøttkraft (TSB) og S. sanguinis ble dyrket på 37 ° C med 5% CO2 i hjernen hjertet infusjon kjøttkraft (BHI).

  1. Forberede natten kultur av bakterier på en solid blod agar plate.
    1. Bruk en steril loop å skrape frosne bakterier fra og vaksinere på en Mueller-Hinton blod agar plate for natten kultur på 37 ° C.
  2. Bruk en steril inokuleringen sløyfe å plukke opp en enkelt koloni fra overnatting blod agar kultur og vaksinere i 10 mL av TSB eller BHI 14 mL tube og kultur overnatting på 37 ° C.
  3. Sentrifuge overnatting kulturer (3000 x g, 4 ° C, 10 min) og resuspend pellets i 10 mL fosfat bufret saltoppløsning (PBS). Plasser 14 mL rør på isen.
  4. Forberede en aliquot 3,7 mg/mL løsning av 5 (6) - carboxy - fluorescein N-hydroxy-succinimidyl ester (CF) i etanol og lagre på 20 ° C. Videre fortynne beholdningen av CF til 150 µg/mL med 'ultrapure' vann.
    Merk: Beskytte rør fra lys med aluminiumsfolie og lagre på 20 ° C.
  5. Sentrifuge bakterier (3000 x g, 4 ° C, 10 min) og resuspend pellets i 800 µL av PBS og Legg 200 µL av 150 µg/mL CF løsningen (siste konsentrasjon av 30 µg/mL brukes for perfusjon eksperimenter). Beskytter rørene fra lys med aluminiumsfolie og ruge i 30 min med en orbital shaker.
  6. Etter merking, blokkere med 2% av bovin serum albumin (BSA) løsning i PBS og spinn (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Følg med en wash trinn bruker 10 mL PBS og pellets med sentrifugering (3000 x g, 4 ° C, 10 min).
  7. Fortynne bakterier med PBS å få 107 colony-forming enheter (CFU) /mL (bekreftet av CFU telling på Mueller-Hinton blod agar plater), som tilsvarer en OD600 (optisk tetthet) av 0,65. Holde rørene i mørket på is før perfusjonsmåling eksperimenter.
    Merk. Husk på at OD600 mål gjenspeiler antall bakterier. Vil telle effektiv vaksinasjon dosen, er seriell fortynning metoden et ekstra nødvendig trinn å kontrollere OD basert tall som beskrevet i delen 3.8.

3. i vitro perfusjon eksperimenter ved hjelp av en parallell-Plate Flow Chamber

  1. Montere vev biopsies av 10 mm i diameter og samme tykkelse (forberedt i trinnene 1.1-1,5) til en flyt kammer system med overflatebehandling opp. kontakt med bakteriell suspensjon.
    Merk: Samme vev tykkelse over ulike grafts sikrer at samme vev høyde er nådd i kanalen gir laminær strømning i alle forhold. Alle elementer av flow chamber blir presentert og beskrevet i figur 1.
    1. For å begynne protokollen, plass rundt vev stykket mellom et mikroskop lysbilde med en 8 mm runde perforering og en Gummipakning.
      Merk: Microscope skyve besitter ultratynne bunnen filmen slik at generasjonen av 8 mm hull. Gummi arket, det løser vev for å aktivere direkte kontakten mellom prøven og flytende medium og hindrer også forvridning av biopsy under eksperimentet. Overflaten av undersøkte vevet, som er utsatt for strømmen (mindre diameter) ikke kan manipuleres av tang.
    2. Holderen med vevet inn pakning arket som er innebygd i bunnen metal rammen av kammeret.
    3. Sy øverste metallramme med tilsvarende pakning arket på den nederste delen av kammeret tidligere innsatt vev holderen. Deretter montere kammeret med åtte skruene og skru nøtter. Kontroller at kammeret høyden er alltid det samme over grafts.
      Merk: Kammer høyden skal bestemmes alltid på å stramme til skruene. Bruk caliper eller hersker.
  2. Koble flyt kammer med en peristaltiske pumpen og flytende reservoaret med rør.
  3. Perfuse vev med suspensjon av 107 CFU/mL (bekreftet av CFU telle og knyttet til OD600 målinger) fluorescently-merket bakterier i PBS med skjær vekt av 3 Dyn/cm2 (Dyn per kvadratcentimeter press enhet) av av peristaltiske pumpen (flow rate 4 mL/min) 1t bruke et 400 mL bakteriell reservoar (interne design, figur 1) betinget på 37 ° C med en plate termostat (Tabell for materiale).
  4. Recirculate kontinuerlig 100 mL bakteriell suspensjon bruker samme samling reservoaret.
  5. Etter perfusjon, demontere kammeret for å frigi graftet og vaske vev stykke to ganger med 4 mL PBS i en 12-vel plate laboratorium orbital shaker i 3 minutter hver. Senere kuttet den indre delen av graften med en hudbiopsi punch med mindre diameter.
  6. Plasser hver vev biopsi i en separat 14 mL tube som inneholder 1 mL steril 0,9% NaCl. Etiketten røret som #1.
  7. Koble bakterier fra vevet sonication bad i 10 min (amplituden = 100% og frekvens = 45 kHz).
    Merk: Full avdeling bakterier fra vevet grafts bør vurderes ved inkubasjon oppdateringer overnatting på 37 ° C i TSB flytende medium etterfulgt av OD600 mål i forhold til kontrollere patcher behandlet med en bakterier gratis løsning.
  8. Bruk en føljetong fortynning metoden på Mueller-Hinton blod agar plater for å telle CFUs.
    1. Forberede en enkelt 14 mL tube med 10 mL steril saltoppløsning gjøre føljetong fortynninger av bakteriell suspensjon innhentet etter sonication. Etiketten dette røret som #2.
      Merk: For hver vev eksperiment en tube med 10 mL 0,9% NaCl er nødvendig.
    2. Forberede tre 14 mL rør med 10 mL steril 0,9% NaCl for seriell fortynninger av første bakteriell suspensjon fra trinn 2.7. Etiketten rør som følger #3, #4, #5.
      Merk: Dette trinnet er nødvendig å vite virkelige CFU nummeret i bakteriell suspensjon brukes for perfusjon eksperimentet.
    3. Vortex bland hver rør for 15 s. Vortex rør med vev biopsi samt første bakteriell suspensjon å gjøre føljetong fortynninger.
    4. Forberede tre agar plater, to for vev eksperimentet (perfusjon av bakterier og kontroll perfusjon av PBS) og den tredje for første bakteriell suspensjon brukes for perfusions.
    5. Merke tre sektorer per plate for vev eksperimentet i den følgende måte 10-1, 10-3 og 10-4. For å telle antall CFUs i bakteriell perfusates, etiketten platen som følger: 10-1, 10-3, 10-5 og 10-7.
      Merk: Alle indikasjoner på agar plater som 10-1, 10-3 og så videre refererer til det endelige antallet CFU/mL beregnet på neste dag. Kontroll plate krever ikke noen sektorer. Før bruk, bør blod agar plater plasseres under laminær panseret og åpnet for å fjerne fuktighet.
    6. For å fortsette forbereder de serielle fortynninger overføre 100 µL av #1 til tube #2 og omgås kraftig vortex.
    7. Spre 100 µL av innholdet i tube #1 og #2 på den tilsvarende sektorer 10-1 og 10-3 av agar plate. Likeledes spre 10 µL av #2 på sektor 10-4, Gjenta dette trinnet 4 ganger få 4 separate vekster fra hvert volum av 10 µL.
      Merk: På grunn av liten volumet brukes for plating på sektor 10-4, er det anbefales å ha flere antall dråper å gjøre en gjennomsnittlig antall voksen CFUs.
    8. For å forberede de serielle fortynninger av første kultur, overføre 100 µL av bakteriell suspensjon fra steg 2,7 til tube #3 og omgås kraftig vortex. Legg 100 µL av #3 til tube #4 og bland godt, Gjenta dette for påfølgende tube #5.
    9. Spredt 100 µL av innholdet i rør #3 #4, #5 og justert bakteriell suspensjon (trinn 2.7), henholdsvis på sektorer 10-3, 10-5, 10-7 og 10-1 av blod agar plate.
    10. La blod agar platene i laminær panseret til luft tørr bakteriell sprer, vanligvis i 10 minutter. Etterpå plass platene på 37 ° C over natten inkubasjon.
    11. Etter natten inkubasjon telle bakteriell koloniene for å få antall CFUs som følge av vedheft til vev biopsier samt CFUs/mL i Start bakteriell suspensjon brukes for perfusjonen. Uttrykke resultater som CFU/cm2.

4. fluorescens mikroskopi overholdt bakterier pode vev på perfusjonsmåler

  1. Perfusjon, vaskes vev stykker med PBS (se trinn 3,5) og kutte den indre delen av en graft med et slag med mindre diameter.
  2. Forberede en 6-vel plate og plasser dråper av montering medium (Tabell for materiale).
  3. Plass hvert stykke vev med perfused overflaten nedover på en eneste dråpe montering medium.
  4. Lese en plate med en fluorescens skanner (Tabell for materiale). Angi parametere for eksitasjon og utslipp bølgelengder etter en fluorophore brukes for bakteriell merking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For bedre å forstå mekanismene bak IE utvikling, denne modellen gjør evalueringen av bakteriell og vev forbundet faktorer stede i situasjon i vivo infeksjon utbruddet.

I detalj, romanen i vitro tilnærming kan kvantifisere bakteriell vedheft i strømningsforhold forskjellige pode vev av perfusing fluorescently merket bakterier over vev øve skjær stress i 3-10 Dyn fysiologiske området / cm2 for RVOT. I dette arbeidet brukte vi en strømningshastighet på 4 mL/min som tilsvarte 3 Dyn/cm2. Tatt i betraktning kanal høyden på 0,3 mm på tvers av alle vev patcher, avstanden mellom montert graftet og middels mengden av ca 39 mm, perfusjon kammeret (vist i figur 1) garanterer fullt utviklet laminær strømning (Re = 3.89 er betydelig lavere enn i 2000. hvor inngangen = 0.05 mm er betydelig mindre enn avstanden 'vik-graftet', parametere nødvendig for forutsatt riktig flow mønster).

Under skjæring stress forhold, ble et lignende bakteriell vedlegg over ulike pode vev observert både S. aureus og S. epidermidis infisert (figur 2 og Figur 3). Selv om ikke signifikant, var en trend i retning høyere vedheft av S. aureus til CH løpesedler merkbar.

S. sanguinis en betydelig reduksjon av overholdelse BJV veggen ble funnet i forhold til BP oppdateringen (Figur 4; P < 0,05). Når sammenligne 3 arter av bakterierS. sanguinis presenterer betydelig lavere vedheft til BJV veggen S. aureus og S. epidermidis (P < 0,01 og P < 0,05, se video). Generelt, observerte vi en lignende bakteriell vedheft til alle vev undersøkt under skjæring stress.

Våre data fra CFU teller (figur 2, Figur 3, Figur 4) støttes av fluorescens mikroskopi bruker en høy gjennomstrømning skanner (figur 5, figur 6, figur 7). Bilder presenterer uttales foci av merket bakterier følge for å pode vev. På grunn av denne tilnærmingen kunne vi direkte visualisere vev på perfusjon uten innlegg eksperimentell behandling illustrasjon.

Resultatene viser at kilden til en pode vev, overflate morfologiske forskjeller samt bakteriell adhesins ikke er store determinanter av overholdelse av bakterielltil disse biologisk materiale.

Figure 1
Figur 1: bildet av en nyutviklet flyt kammer system (internt utforming av avdeling av Biohybrid & medisinsk tekstiler, AME - Helmholtz Institutt for Biomedical Engineering, Aachen, Tyskland). A. flow chamber (1) montert flyt sett med dimensjoner LxBxH: 125 mm x 55 x 18 mm (skruene i kombinasjon med skrue-nøtter holder kammeret deler sammen og sette press via metallramme på pakningene for å forhindre lekkasje); (2) øverst i kolonnen. (3) øvre pakning arket med to hull å fikse rør kontakter, som forbinder flow chamber med pumpen og flytende reservoaret med rørsystem; (4) avstanden mellom den mellomstore inntak og vev (inngang lengden); (5) tynn folie lysbildet (med en 8 mm runde perforering tillate eksponering av vev bakteriell suspensjon) (i en utsparing av lysbildet det er plass til en Gummipakning B9, til nakkens vev stykket under perfusjonen); (6) bunnen pakning arket med en dedikert fordypningen plassere vev graftet montert mellom microscope skyve og gummitetningen; (7) nederst i flow chamber; B. hele oppsettet (8) tynn folie lysbildet. (9) gummitetningen; (10) åtte skruene med tilsvarende (11) åtte skruen-nøtter; (12) væske reservoaret (400 mL); (13) rørsystem; C. perfusjon enhet (14) peristaltiske pumpen; (15) dedikert rør som tåler påkjenningene av peristaltiske pumping action. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Vedheft av S. aureus Cowan pode vev under strømningsforhold. Fluorescently merket bakterier var perfused 5 pode vev (kanal vegger eller Valvulær brosjyrer) i PBS. Bakterier ble løsrevet fra infiserte vev stykker av sonication. Bakteriell vedheft ble evaluert av føljetong fortynninger med metoden CFU telling og som CFU/cm2. Alle resultatene uttrykkes som betyr ± SEM (n > 3 for Valvulær brosjyrer på grunn av begrensning av materiale, n > 5 for kanal vegger). CFU: colony-forming enhet; BP: bovin pericardium; BJV: bovin vena jugularis; CH: cryopreserved homograft. Dette tallet har blitt endret fra Veloso et al. (Journal of thorax og kardiovaskulær kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Vedheft av S. epidermidis pode vev under strømningsforhold. Fluorescently merket bakterier var perfused 5 pode vev (kanal vegger eller Valvulær brosjyrer) i PBS. Bakterier ble løsrevet fra infiserte vev stykker av sonication. Bakteriell vedheft ble evaluert av føljetong fortynninger med metoden CFU telling og som CFU/cm2. Alle resultatene uttrykkes som betyr ± SEM (n > 3 for Valvulær brosjyrer på grunn av begrensning av materiale, n > 5 for kanal vegger). CFU: colony-forming enhet; BP: bovin pericardium; BJV: bovin vena jugularis; CH: cryopreserved homograft. Dette tallet har blitt endret fra Veloso et al. (Journal of thorax og kardiovaskulær kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Vedheft av S. sanguinis pode vev under strømningsforhold. Fluorescently merket bakterier var perfused 5 pode vev (kanal vegger eller Valvulær brosjyrer) i PBS. Bakterier ble løsrevet fra infiserte vev stykker av sonication. Bakteriell vedheft ble evaluert av føljetong fortynninger med metoden CFU telling og som CFU/cm2. Alle resultatene er uttrykt som betyr ± SEM (n = 3 for Valvulær brosjyrer på grunn av begrensning av materiale, n > 5 for kanal vegger). CFU: colony-forming enhet; BP: bovin pericardium; BJV: bovin vena jugularis; CH: cryopreserved homograft. Dette tallet har blitt endret fra Veloso et al. (Journal of thorax og kardiovaskulær kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). * P < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Visualisering av S. aureus Cowan tilslutning pode vev med fluorescens mikroskopi. Fra venstre til høyre: BJV kanal veggen BJV pakningsvedlegget, CH veggen og CH brosjyre. Dette tallet har blitt endret fra Veloso et al. (Journal of thorax og kardiovaskulær kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Visualisering av overholdelse av S. epidermidis pode vev bruker fluorescens mikroskopi. Fra venstre til høyre: BJV kanal veggen BJV pakningsvedlegget, CH veggen og CH brosjyre. Dette tallet har blitt endret fra Veloso et al. (Journal of thorax og kardiovaskulær kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Visualisering av overholdelse av S. sanguinis pode vev bruker fluorescens mikroskopi. Fra venstre til høyre: BJV kanal veggen BJV pakningsvedlegget, CH veggen og CH brosjyre. Dette tallet har blitt endret fra Veloso et al. (Journal of thorax og kardiovaskulær kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Siste kliniske observasjoner gi spesiell oppmerksomhet til IE som en komplikasjon hos pasienter har gjennomgått ventil erstatning RVOT6,13. Dysfunksjon av implantert ventilen i IE er resultatet av bakteriell interaksjon med endovascular graftet fører til omfattende reaksjoner1,14-med inflammatoriske og procoagulant. Presentert romanen i vitro modellen tillot oss å undersøke om forskjeller i vev strukturer og bakteriell faktorer er sannsynlig å modulere mottakelighet for infeksjoner i vivo brukes grafts15. BJV og CH pode vev viste lignende tilbøyelighet mot bakteriell rekruttering i strømningsforhold. Derfor tyder data på at generelt kilden til vev og dens overflatestruktur samt spesifikke bakteriell limet proteiner i seg selv ikke er de viktigste bestemmende faktorene i første bakteriell tilslutning.

Generelt, pathways fremkaller betennelse, vev skade, blodplater og fibrin avsetning på infiserte endovascular området er aktivert ved flere spillere1,16. En stor fordel av modellen utviklet i vitro er muligheten til å analysere trinnvis bidrag av involverte spillere. Enkelt bakteriell faktorer kan undersøkes ved hjelp av bakteriell mutant stammer eller genmodifiserte bakterier uttrykke enkelt vedheft proteiner deres overflate14. Ved å velge forskjellige perfusjon media, plasma eller blod, kan involvering av plasma proteiner og blod celler evalueres. Videre studier vil fokusere på vev relaterte faktorer som vev blir pre inkubert med for eksempel plasma proteiner før montert i flow chamber for påfølgende perfusjon. Siden spillerne bidra til utbruddet av protese ventil dvs fortsatt uklare, fremtidige studier kan løse potensielle faktorene ved å bygge opp en mer kompleks eksperimentelle oppsett. Videre arver eksperimentell installasjonen muligheten at vev kan være plantet med en EC lag å analysere skjær-avhengige EC genuttrykk. Parallell-plate flow chamber kan også perfusjon over EC-dekket objektglass på grunn av en fleksibel indre høyde av perfusjon chamber. Ulike belegg av cover slips med ulike ekstracellulær matrix proteiner er også et mulig alternativ å vurdere viktige interaksjon med subendothelial matrise. I tillegg kan pharmacologic hemmere eller funksjonelle antistoffer undersøkes for deres effekt respektive tilstanden i våre flyt kammer. I sammendraget, kan ulike forhold studeres ved økende kompleksitet.

Inflammatorisk aktivering på infiserte området av graftet er avgjørende, skjær-kontrollerte favoriserer deponering av aktivert blodplater og monocytter. Virkningen av skjær styrker på bakteriell tilslutning til vev er av stor bekymring. For å løse dette problemet, nyheten av presentert i vitro systemet fokuserer på muligheten til å montere vev i en flyt kammer. Dette forsterker betydningen av metoden utover eksisterende alternativer, som vanligvis statisk interaksjoner mellom bakterier og underliggende vev er gransket. Selv om skjæring stress ble presentert av risting eller andre ytre krefter, har det ikke blitt standardisert til samme nivå som vi får fra vår jevn flyt modell.

I vivo, en ikke-fysiologiske strømningsmønsteret kan favorisere bakteriell vedheft som utbruddet av IE valve nivået av implantert rør. Skjæring stress ble funnet å opp-regulere endothelial inflammatorisk parametere som cytokin sekresjon og øke vev faktor mediert koagulering17. Samspillet av underliggende vev brukes til ventilen proteser med bakterier og deres innflytelse på EC genuttrykk under skjæring stress er viktig å konstruere en ventil mindre i stand til bakteriell vedheft og kronisk betennelse.

De basale tekniske problemene av fabrikkerte chamber at undersøkelser under standardiserte forholdene i laminær strømning18. For å sikre det fullt utviklet laminær strømning på stedet av undersøkte vevet kammeret er konstruert for å montere graftet i en viss avstand fra middels inntaket (betydelig lenger enn beregnet inngangen, se resultater og figur 1). Bruke ulike pumper i systemet ville tillate utføre eksperimenter under pulsatile eller turbulente strømningsforhold i fremtiden.

Fleksibel rammen av kammeret hindrer kammeret effektivt lekker den interne høyden av rammen kan tilpasse til vev tykkelse. Byggingen av hele systemet muliggjør en sirkulerende flyt, som er av betydning å utføre langvarig perfusions med med en respektive mengde medium. Basert på tidligere studier våre vedheft protokollen antatt en bakteriell inoculation dose 107 CFU/mL for en 1t inkubasjon4,19. Ved å bruke disse innstillingene, var vedheft nivåene synlig, men lav nok til å kunne observere betydelig forbedring av bakteriell overholdelse uten metning av vev pode overflaten. Videre i denne perioden var det mulig å se potensielle forskjeller i binding over stammer tatt i denne studien. Skjær parametere er adressert her var innenfor fysiologiske og optimalisert for blodårene, som var vårt mål i forhold til RVOT.

Ytterligere modifiseringer av metoden vil fokusere på mer effektiv forbruk av middels under prosedyren og forenkling av montering oppsettet. I tillegg ville en ny design inkludert flere plasser for vev samling lette et hele eksperiment i aspekter som effektivitet.

På dette stadiet vår metode er fokusert på sluttpunktet resultatene og ble ikke testet for sanntid programmer som time course of dynamisk hendelser i vevet overflaten. Dermed bredere programmet fortsatt er under vurdering; men må saker som vev autofluorescence, optimalisering av en passende fluorescens mikroskop protokoll og tilpasninger av kammeret tas. Videre kan, metoden i sin nåværende tilstand tilpasses sanntids overvåking av bakteriell binding til EC lag på objektglass av oppreist fluorescens mikroskop. Foreløpig kan visualisere bakterier og andre komponenter/blodceller bundet til vev av AC confocal mikroskopi uten behov for eksperimentell vev etterbehandling, som er disponerer for sanntids visualisering under flyt av invertert fluorescens mikroskop.

I denne studien ble kvantifisering av bakteriell vedheft levert av CFU telle mens fluorescens mikroskopi var en støttende, ikke-kvantitative verktøy. På grunn av oppløsningsproblemer skyldes mangel på en tilstrekkelig mikroskop linse, viste fluorescens imaging seg for å være mindre reproduserbare i våre hender enn føljetong fortynninger. Likevel er det mulig å bruke fluorescens skanning for kvantifisering når egnet linsen kan belyse hele pode størrelsen på 8 mm i diameter for pålitelig foci kvantifisering. Bruker et bilde behandling (for eksempel ImageJ), absolutt fluorescens enheter kan kvantifiseres for undersøkte vevsprøver og bakteriell vedheft kan for eksempel uttrykkes som en relativ signal til internkontroll (grafts parfyme med ikke-merket bakterier).

Stor begrensning av eksperimentelle innstillingen er problemstillinger knyttet i vitro studier generelt. Resultatene nådd ved hjelp av denne i vitro flow chamber-modellen kan overføres til en dyremodell i vivo bekreftelse.

Avslutningsvis kan denne i vitro modellen enkelt bakteriell, vev og skjær-baserte faktorer som bidrar til utbruddet av bakteriell vedheft vev på en gradvis måte. Herved aktivert kunnskap kan bidra til utvikling av mer effektiv forebygging og behandling av IE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Denne studien ble sponset av en bevilgning Research Fund KU Leuven (OT/14/097) gitt til RH. TRV var postdoktor CVE Research Foundation - Flandern (Belgia; Gi nummer - 12K0916N) og RH støttes av klinisk forskning fondet i UZ Leuven.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium Synovis Surgical Innovations, USA PC-0404SN
Bovine Jugular Vein conduits (BJV) Contegra conduit; Medtronic Inc, USA M333105D001
CH cryopreserved homograft European Homograft Bank (EHB) -
Acu-Punch Acuderm Inc, USA P850 (8 mm); P1050 (10 mm)
human Albumin Flexbumin; Baxter, Belgium BE171464
LOT:16G12C
Tryptic soy broth (TSB) Fluka, Steinheim, Germany 22092-500G
Heart infusion broth (BHI) Fluka 53286-500G
Phosphate buffered saline (PBS). Gibco 14190-094
5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) Sigma-Aldrich, Germany 21878-100MG-F
Peristaltic pump (MODEL ISM444B) Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany 631942-2
Sonication bath VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa 142-6044 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen by ThermoFisher P36930
InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa 29027886
Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ Millipore 87206462
Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) Sarstedt 94.6140.102
1-well on Lumox detachable Sarstedt 94.6150.101
Stainless Steel - surgical Blades Swann-Morton 311
Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD Cole-Parmer EW-95702-06 Temperature range: –80 to 200°C
Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure
PharMed BPT Tubing Saint-Gobain AY242012 Autoclavable 30 min at 121°C
Tygon LMT-55 Tubing Saint Gobain Performance Plastics™ 15312022
Thermostat BMG BIOMEDIZINTECHNIK 300-0042 230V, 90VA, 50Hz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Que, Y. A., Moreillon, P. Infective endocarditis. Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).
  2. Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
  3. Moreillon, P., Que, Y. A. Infective endocarditis. The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).
  4. Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
  5. Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
  6. Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
  7. Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
  8. Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
  9. Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
  10. Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
  11. Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
  12. Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
  13. Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
  14. Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
  15. Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
  16. Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
  17. Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
  18. Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
  19. Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 143 Staphylococcus aureus infeksiøs endokarditt vedheft subendothelial matrise skjæring stress flyt kammer Valvulær pode vev RVOT
En <em>In Vitro</em> -modell av en parallell-Plate perfusjon System å studere bakteriell tilslutning å pode vev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ditkowski, B., Veloso, T. R.,… More

Ditkowski, B., Veloso, T. R., Bezulska-Ditkowska, M., Lubig, A., Jockenhoevel, S., Mela, P., Jashari, R., Gewillig, M., Meyns, B., Hoylaerts, M. F., Heying, R. An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues. J. Vis. Exp. (143), e58476, doi:10.3791/58476 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter