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Developmental Biology

Un modelo In Vitro de un sistema de placas paralelas de la perfusión para el estudio de adherencia bacteriana a los tejidos de injerto

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58476
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 3, 3, 4, 1, 5, 2, 1
1Cardiovascular Developmental Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 2Centre for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 3Department of Biohybrid & Medical Textiles, AME - Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, RWTH Aachen University, 4European Homograft Bank, Saint Jean Clinique, 5Division of Clinical Cardiac Surgery, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

Summary

Describimos un interno diseñado en vitro cámara modelo de flujo, que permite la investigación de la adherencia bacteriana a los tejidos de injerto.

Abstract

Varios conductos de válvulas y válvulas montada en stent se utilizan para reemplazo de la válvula de salida de ventrículo derecho (TSVD) de la zona en pacientes con enfermedad cardíaca congénita. Al utilizar materiales protésicos sin embargo, estos injertos son susceptibles a infecciones bacterianas y varias respuestas de host.

Es la identificación de factores bacterianos y host que juegan un papel vital en endovascular adherencia de microorganismos de importancia para comprender mejor la fisiopatología de la aparición de infecciones como la endocarditis infecciosa (EI) y desarrollar la prevención estrategias. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de modelos competentes para investigar adherencia bacteriana bajo condiciones fisiológicas del esquileo. Aquí, describimos el uso de un nuevo diseño en vitro perfusión cámara basado en placas paralelas que permite que el estudio de la adherencia bacteriana a diferentes componentes de los tejidos del injerto expuso como matriz extracelular, las células endoteliales y áreas inertes . Este método combinado con la formación de Colonia unidad (UFC) de conteo es adecuada para evaluar la propensión de los materiales de injerto hacia adherencia bacteriana bajo flujo. Además, podría utilizarse el sistema de cámara de flujo para investigar el papel de los componentes de la sangre en la adhesión bacteriana bajo condiciones de corte. Hemos demostrado que el origen del tejido, su morfología superficial y la especificidad de especies bacterianas no son los principales factores determinantes en la adhesión bacteriana a tejidos de injerto utilizando nuestro modelo interno diseñado en vitro de la perfusión.

Introduction

Staphylococcus aureus (S. aureus) emplea una variedad de estrategias de virulencia para eludir el sistema de defensa inmune huésped colonizar superficies biológicas o no biológicas implantadas en la circulación humana, que conduce a infecciones intravasculares graves como sepsis y IE1,2,3,4,5. Restos de IE un importante tratamiento asociado de complicación en los pacientes después de la implantación de válvulas cardíacas protésicas y factores individuales que contribuyen a la aparición de IEare no todavía completamente entendido6,7. Bajo condiciones de flujo, las bacterias encuentran fuerzas de esquileo, que necesitan vencer para adherirse a la pared de vaso8. Modelos, que permiten estudiar la interacción entre bacterias y tejido de válvula protésica o endotelio bajo flujo, son de interés ya que reflejan la situación en vivo más.

Varios mecanismos específicos facilitan la adherencia bacteriana a las células endoteliales (ECs) y la matriz subendothelial expuestas (ECM) hacia la colonización de tejidos y la maduración de la vegetación, siendo los primeros pasos esenciales en IE9. Diversas proteínas superficiales Estafilocócicas o MSCRAMMs (componentes superficiales microbianos reconociendo las moléculas adhesivas de la matriz) han sido descritos como mediadores de adherencia a las células del huésped y las proteínas de la ECM interactuando con moléculas como la fibronectina, fibrinógeno, colágeno y von Willebrand factor (FvW)8,10,11. Sin embargo, en vista de plegamiento intra moleculares de algunos factores de virulencia, sobre todo estudiados en condiciones estáticas, muchas de estas interacciones pueden tener diferente importancia en infecciones endovasculares en la sangre circulante.

Por lo tanto, presentamos un casa diseñada en vitro placas paralelas cámara modelo de flujo, que permite la evaluación de la adherencia bacteriana a diferentes componentes de la ECM y ECs en el contexto de los injertos de tejido implantado en la posición del TSVD. El propósito general del método descrito en este trabajo es estudiar los mecanismos de interacción entre las bacterias y los tejidos subyacentes de endovascular en condiciones de flujo, que están estrechamente relacionadas con el medio ambiente en vivo de los agentes patógenos de la sangre tales como S. aureus. Este nuevo enfoque se centra en la susceptibilidad de las superficies de tejido de injerto a la adherencia bacteriana para identificar posibles factores de riesgo para el desarrollo de la IE.

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Protocol

1. preparación de tejidos de injerto In Vitro estudios

Nota: Se utilizaron tres tipos de tejidos: parche de pericardio bovino (BP), injertos de homoinjerto criopreservado (CH) y la vena yugular bovina (BJV). En caso de conducto BJV y CH (tejido por el Banco Europeo de homoinjerto (EHB) y almacenado en nitrógeno líquido antes de usar), la pared y valvas valvulares fueron utilizados. Parche de BP y conducto BJV fueron comprados a los fabricantes. Antes de utilizar, descongele CH siguiendo las instrucciones de EHB12.

  1. Lavar todos los tejidos con 0.9% NaCl antes del uso.
  2. Preparar las biopsias de tejido mediante una biopsia de piel desechable punzón para cortar piezas de tejido circular (diámetro 10 mm).
  3. Corte todos los parches de tejido a la misma altura utilizando bisturís estériles desechables.
  4. Para los tejidos fijados con glutaraldehído (por ejemplo conducto BJV), incubar pedazos del injerto durante la noche a 4 ° C con 200 g/L de albúmina humana para neutralizar el fijador.
  5. Lave a residuos de glutaraldehído con 0.9% NaCl en una placa de microtitulación.  Repita 3 veces en 1 minuto.

2. preparación de las bacterias para los experimentos de perfusión

Nota: Se utilizaron tres cepas bacterianas: Cowan (ATCC 12598) de S. aureus , S. epidermidis ATCC 149900 y S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus y S. epidermidis fueron cultivadas a 37 º C en caldo de soja tríptica (TSB) y S. sanguinis fue aumentado a 37 ° C con 5% CO2 en caldo de infusión cerebro corazón (BHI).

  1. Preparar una noche cultura de bacterias en una placa de agar sangre sólida.
    1. Utilizar un bucle estéril raspe las bacterias congeladas y sembrar sobre una placa de Mueller-Hinton agar sangre para el cultivo durante la noche a 37 ° C.
  2. Utilizar un asa de inoculación estéril para recoger una sola Colonia de la cultura de agar sangre durante la noche e inocular en 10 mL de TSB o BHI en un tubo de 14 mL y cultura durante la noche a 37 ° C.
  3. Culturas durante la noche (3000 x g, 4 ° C, 10 min) de centrifugar y resuspender el pellet en 10 mL de tampón fosfato salino (PBS). Colocar tubos de 14 mL en hielo.
  4. Preparar una alícuota de la solución de 3,7 mg/mL de 5 (6) - carboxi - fluoresceína N-hidroxi-succinimidyl-éster (CF) en etanol y almacenar a-20 ° C. Diluir más el stock de la FQ a 150 μg/mL utilizando agua "ultrapura".
    Nota: Proteger los tubos de la luz con papel aluminio y almacenar a-20 ° C.
  5. Centrifugue las bacterias (3000 x g, 4 ° C, 10 min) y resuspender el pellet en 800 μl de PBS y añadir 200 μL de la solución de CF de 150 μg/mL (concentración final de 30 μg/mL utilizados para experimentos de perfusión). Proteger los tubos de la luz con papel de aluminio e incubar durante 30 min utilizando un agitador orbital.
  6. Después de etiquetar, bloque con el 2% de solución de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS y spin (3000 x g, 4 ° C, 10 minutos). Seguir con un paso de lavado con 10 mL de PBS y pellet de bacterias por centrifugación (3000 x g, 4 ° C, 10 minutos).
  7. Diluir las bacterias con PBS para obtener 107 las unidades formadoras de colonias (UFC) /mL (verificado por UFC recuento en placas de Mueller-Hinton agar sangre), que corresponde a un OD600 (densidad óptica) de 0.65. Mantener los tubos en la oscuridad en el hielo antes de experimentos de perfusión.
    Tenga en cuenta. Tenga en cuenta que las mediciones de600 OD reflejan el número aproximado de bacterias. Para contar la dosis de inoculación efectiva, el método de dilución seriada es un paso adicional es necesario para verificar la do números tal como se describe en la sección 3.8.

3. in vitro experimentos de perfusión usando una cámara de flujo de placas paralelas

  1. Biopsias de 10 mm de diámetro y del mismo grosor (preparada en los pasos 1.1-1.5) el montaje en un sistema de cámaras de flujo con la superficie interna hacia arriba para ponerse en contacto con la suspensión bacteriana.
    Nota: El mismo grosor de tejido a través de varios injertos garantiza que se alcanza la misma altura de tejido en el canal que permite el flujo laminar en todas las condiciones. Todos los elementos de la cámara de flujo se presentan y describen en la figura 1.
    1. Para comenzar el protocolo, coloque la pieza de tejido redondo entre un portaobjetos con una perforación circular de 8 mm y una Junta de goma.
      Nota: La diapositiva del microscopio posee la película ultra delgada inferior para permitir la generación del agujero de 8 mm. Junto con la hoja de goma, fija el tejido para permitir el contacto directo entre la muestra y el medio que fluye y también previene la dislocación de la biopsia durante el experimento. La superficie de los tejidos investigados, que se exposición al flujo (menor diámetro) no puede ser manipulada por el fórceps.
    2. Inserte el soporte con el tejido en la hoja de la Junta que está incrustada en la estructura metálica de la parte inferior de la cámara.
    3. Coloque el marco superior del metal con la correspondiente hoja de la Junta en la parte inferior de la cámara con el soporte de tejido previamente insertado. Posteriormente montar toda la cámara con ocho tornillos y tuercas de tornillo. Asegúrese de que la altura de la cámara es siempre la misma a través de injertos.
      Nota: La altura de la cámara debe determinarse siempre con los tornillos. Utilice un calibrador o la regla.
  2. Conecte la cámara de flujo con una bomba peristáltica y el depósito del líquido de los tubos.
  3. Perfusión de los tejidos con suspensiones de 107 CFU/mL (verificado por UFC cuenta y relacionados con la medición de OD600 ) marcada con fluorescencia bacterias en PBS con una tensión de cizalla de 3 Dina/cm2 (Dina por centímetro cuadrado la unidad de presión) por medio de la bomba peristáltica (flujo 4 mL/min) durante 1 h con un reservorio bacteriano 400 mL (diseño, figura 1) condicionado a 37 ° C con un termostato de la placa (Tabla de materiales).
  4. Recirculan continuamente la suspensión bacteriana de 100 mL con el mismo depósito de recolección.
  5. Después de la perfusión, desmontar la cámara para liberar el injerto y lavar la pieza de tejido dos veces con 4 mL de PBS en una placa de 12 pozos usando el agitador orbital de laboratorio por 3 minutos. Posteriormente cortar la parte interna de la prótesis mediante una biopsia de piel punch de un diámetro más pequeño.
  6. Coloque cada biopsia de tejido en un tubo separado 14 mL que contiene 1 mL de estéril 0,9% NaCl. Etiquetar el tubo # 1.
  7. Separar las bacterias de los tejidos mediante un baño de sonicación durante 10 min (amplitud = 100% y la frecuencia = 45 kHz).
    Nota: En comparación con desprendimiento completo de la bacteria de los tejidos los injertos deben ser evaluados sobre la incubación de los parches durante la noche a 37 ° C en medio líquido TSB seguido por medidas de OD600 para controlar manchas tratadas con una solución libre de bacterias.
  8. Use un método de dilución seriada en placas de Mueller-Hinton agar sangre para contar unidades formadoras de colonias.
    1. Preparar un tubo de solo 14 mL con 10 mL de solución salina estéril para hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana obtenida después de la sonicación. Etiquetar este tubo como #2.
      Nota: Para cada uno un tubo de tejido experimento con 10 mL de 0.9% NaCl es necesario.
    2. Preparar tres tubos de 14 mL con 10 mL de estéril 0,9% NaCl para diluciones seriadas de la suspensión bacteriana inicial del paso 2.7. Etiquetar los tubos de la siguiente manera #3, #4, #5.
      Nota: Este paso es necesario conocer el real número de UFC en la suspensión bacteriana utilizado para el experimento de la perfusión.
    3. Vórtice mezcle cada tubo de vórtice s. 15 los tubos con la biopsia de tejido, así como la suspensión bacteriana inicial para hacer diluciones seriadas.
    4. Preparar tres placas de agar, dos para el experimento de tejido (perfusión de bacterias y control de la perfusión de PBS) y el tercero de la suspensión bacteriana inicial utilizada para perfusiones.
    5. Etiqueta de tres sectores por placa para el experimento de tejido de la siguiente manera 10-1, 10-3 y 10-4. Para contar el número de unidades formadoras de colonias en la perfusates bacteriana, etiqueta de la placa como sigue: 10-1, 10-3, 10-5 y 10-7.
      Nota: Todas las indicaciones en el agar de las placas tales como 10-1, 10-3 consulte el número final de UFC/mL calculado en el día siguiente. Placa de control no requiere de cualquier sector. Antes del uso, placas de agar sangre deben ser colocadas debajo de la campana laminar y abiertas para eliminar el exceso de humedad.
    6. Para continuar la preparación de las diluciones seriadas, transfiera 100 μl del tubo #1 al tubo #2 y mezcla vigorosamente con vortex.
    7. Extensión 100 μl de los contenidos del tubo #1 y #2 en los correspondientes sectores 10-1 y 10-3 de la placa de agar. Asimismo, difundir 10 μl del tubo #2 en el sector 10-4, repetir este paso 4 veces para obtener 4 masas separadas de cada volumen de 10 μl.
      Nota: Debido al pequeño volumen utilizado para la galjanoplastia en el sector 10-4, se aconseja tener múltiples número de gotitas para hacer un número medio de UFC cultivadas.
    8. Para preparar las diluciones seriadas de la cultura inicial, transferir 100 μl de suspensión bacteriana de paso 2.7 al tubo #3 y mezcla vigorosamente con vortex. Añada 100 μl del tubo #3 al tubo #4 y mezclar bien, repita el procedimiento para el posterior tubo #5.
    9. Extensión 100 μl de los contenidos de los tubos #3, #4, #5 y la suspensión bacteriana ajustada (paso 2.7), respectivamente, en sectores 10-3, 10-5, 10-7 y 10-1 de la placa de agar sangre.
    10. Dejar las placas de agar sangre en la campana laminar de aire seco las extensiones bacterianas, normalmente durante 10 minutos. Luego, coloque las placas a 37 ° C para la incubación de noche.
    11. Después de la incubación durante la noche, contar las colonias de bacterias para obtener el número de unidades formadoras de colonias resultantes de la adhesión a las biopsias de tejido así como UFC/mL en la suspensión bacteriana inicial utilizada para la perfusión. Expresar resultados en ufc/cm2.

4. fluorescencia microscopía de bacterias adheridas a los tejidos con perfusión de injerto

  1. Después de la perfusión, lavar piezas de tejido con PBS (ver paso 3.5) y corte la parte interior de un injerto con un punzón de un diámetro más pequeño.
  2. Preparar una placa de 6 pozos y ponga gotas de medio de montaje (Tabla de materiales).
  3. Coloque cada pieza de tejido con su superficie inundada hacia abajo en una sola gota de medio de montaje.
  4. Leer un plato utilizando un escáner de fluorescencia (Tabla de materiales). Establecer los parámetros de excitación y emisión de longitudes de onda según un fluoróforo que se utiliza para el etiquetado bacteriana.

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Representative Results

Para comprender mejor los mecanismos detrás de IE desarrollo, este modelo permite la evaluación de bacterias y factores asociado del tejido presentan en la situación en vivo del inicio de la infección.

En detalle, el enfoque novedoso en vitro permite para cuantificar la adherencia bacteriana en condiciones de flujo a los tejidos de injerto diferentes por perfundiendo fluorescencia etiquetada bacteria sobre los tejidos ejerciendo las tensiones de corte en el rango fisiológico de Dina 3-10 / cm2 para el TSVD. En este trabajo, hemos utilizado una velocidad de flujo de 4 mL/min que corresponde a 3 Dina/cm2. Teniendo en cuenta la altura de canal de 0,3 mm a través de todos los parches de tejido, la distancia entre el injerto montado y la entrada del medio de 39 mm, la cámara de perfusión (se muestra en la figura 1) garantiza flujo laminar completamente desarrollado (Re = 3,89 es significativamente menor que 2000; la longitud de entrada = 0.05 m es significativamente menor que la distancia de entrada de ' injerto', parámetros necesarios para asumir el patrón de flujo apropiado).

Bajo condiciones de tensión de esquileo, una fijación bacteriana similar a través de los diferentes tejidos de injerto se observó para la infección de S. aureus y S. epidermidis (figura 2 y figura 3). Aunque no significativa, una tendencia hacia la mayor adherencia de S. aureus a las valvas de la CH era sensible.

De S. sanguinis una reducción significativa de la adherencia a la pared BJV fue encontrado en comparación con el parche de BP (figura 4; P < 0.05). Cuando comparando las 3 especies de bacteriasS. sanguinis presenta menor adherencia a la pared BJV en relación a S. aureus y S. epidermidis (P < 0,01 y P < 0.05 respectivamente, ver el video). En general, observamos una adherencia bacteriana similar a todos los tejidos investigados bajo tensión de esquileo.

Nuestros datos de cuenta (figura 2, figura 3, figura 4) UFC son apoyados por microscopia de fluorescencia utilizando un escáner de alto rendimiento (figura 5, figura 6, figura 7). Imágenes presentan pronunciados focos de etiquetado bacterias adheridas a los tejidos de injerto. Debido a este enfoque, hemos sido capaces de visualizar directamente los tejidos con perfusión sin ningún post procesamiento para fines de ilustración experimental.

Los resultados demuestran que la fuente de un tejido de injerto, las diferencias morfológicas superficiales así como adhesinas bacterianas no son importantes determinantes de la adherencia bacterianaa estos materiales biológicos.

Figure 1
Figura 1: imagen de un sistema de cámaras de flujo desarrollado recientemente (diseño interno por el Departamento de Biohybrid & Textiles médicos, AME - Instituto Helmholtz de ingeniería biomédica, Aachen, Alemania). A. la cámara de flujo (1) montado sistema de flujo de Dimensiones LxAxA: 125 x 55 x 18 mm (tornillos en combinación con tuercas de sostienen piezas juntos y poner presión a través de la cámara la estructura metálica en las juntas para evitar fugas); (2) la parte superior de la columna; (3) la hoja de la junta superior con dos agujeros para fijar conectores de tubos, que conectan la cámara de flujo con la bomba y el depósito de fluido mediante el sistema de tubería; (4) distancia entre la entrada del medio y el tejido (la longitud de la entrada); (5) diapositivas de hoja fina (con una perforación circular de 8 mm para permitir la exposición del tejido a la suspensión bacteriana) (en una hendidura de la diapositiva hay espacio para una Junta de goma B9, para inmovilizar la pieza de tejido durante la perfusión); (6) montaje de la hoja de la Junta de fondo con un hueco dedicado a colocar el injerto de tejido entre el portaobjetos y la Junta de goma; (7) la parte inferior de la cámara de flujo; B. el montaje completo (8) la corredera de hoja fina; (9) la Junta de goma; (10) ocho tornillos con tuercas tornillo correspondiente (11) ocho; (12) el depósito de fluido (400 mL); sistema de tubería (13) ; Unidad de C. perfusión (14) la bomba peristáltica; (15) dedicado de la tubería soporta los rigores de la acción de bombeo peristáltico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Adherencia de S. aureus Cowan injertar los tejidos bajo condiciones de flujo. Fluorescencia etiquetadas bacterias fueron perfundidos tejidos de injerto más de 5 (paredes de conducto o folletos valvulares) en PBS. Las bacterias fueron separadas de los pedazos de tejido infectado por sonicación. Adherencia bacteriana se evaluó por diluciones seriadas, usando el método conteo de UFC y se indica como ufc/cm2. Todos los resultados se expresan como media ± SEM (n > 3 por folletos valvulares debido a la limitación de material; n > 5 para las paredes del conducto). UFC: unidad formadora de colonias; BP: pericardio bovino; BJV: la vena yugular bovina; CH: homoinjerto criopreservado. Esta figura ha sido modificada desde Veloso et al. (Diario de cirugía torácica y Cardiovascular 155 (1), 325-332 (2018)). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Adherencia de S. epidermidis injertar los tejidos bajo condiciones de flujo. Fluorescencia etiquetadas bacterias fueron perfundidos tejidos de injerto más de 5 (paredes de conducto o folletos valvulares) en PBS. Las bacterias fueron separadas de los pedazos de tejido infectado por sonicación. Adherencia bacteriana se evaluó por diluciones seriadas, usando el método conteo de UFC y se indica como ufc/cm2. Todos los resultados se expresan como media ± SEM (n > 3 por folletos valvulares debido a la limitación de material; n > 5 para las paredes del conducto). UFC: unidad formadora de colonias; BP: pericardio bovino; BJV: la vena yugular bovina; CH: homoinjerto criopreservado. Esta figura ha sido modificada desde Veloso et al. (Diario de cirugía torácica y Cardiovascular 155 (1), 325-332 (2018)). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Adherencia de S. sanguinis injertar los tejidos bajo condiciones de flujo. Fluorescencia etiquetadas bacterias fueron perfundidos tejidos de injerto más de 5 (paredes de conducto o folletos valvulares) en PBS. Las bacterias fueron separadas de los pedazos de tejido infectado por sonicación. Adherencia bacteriana se evaluó por diluciones seriadas, usando el método conteo de UFC y se indica como ufc/cm2. Todos los resultados se expresan como media ± SEM (n = 3 para folletos valvulares debido a la limitación de material; n > 5 para las paredes del conducto). UFC: unidad formadora de colonias; BP: pericardio bovino; BJV: la vena yugular bovina; CH: homoinjerto criopreservado. Esta figura ha sido modificada desde Veloso et al. (Diario de cirugía torácica y Cardiovascular 155 (1), 325-332 (2018)). * P < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Visualización de la adherencia de S. aureus Cowan injertar los tejidos por medio de microscopía de fluorescencia. De izquierda a derecha: folleto BJV conduit pared, folleto BJV, pared CH y CH. Esta figura ha sido modificada desde Veloso et al. (Diario de cirugía torácica y Cardiovascular 155 (1), 325-332 (2018)). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Visualización de S. epidermidis adherencia injertar tejidos usando microscopía de fluorescencia. De izquierda a derecha: folleto BJV conduit pared, folleto BJV, pared CH y CH. Esta figura ha sido modificada desde Veloso et al. (Diario de cirugía torácica y Cardiovascular 155 (1), 325-332 (2018)). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Visualización de la adherencia de S. sanguinis injertar tejidos usando microscopía de fluorescencia. De izquierda a derecha: folleto BJV conduit pared, folleto BJV, pared CH y CH. Esta figura ha sido modificada desde Veloso et al. (Diario de cirugía torácica y Cardiovascular 155 (1), 325-332 (2018)). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Observaciones clínicas recientes dan especial sensibilización a IE como complicación en pacientes sometido a reemplazo de la válvula del TSVD6,13. Disfunción de la válvula implantada en IE es el resultado de la interacción bacteriana con el injerto endovascular conduce a extenso inflamatorios y procoagulantes reacciones1,14. El modelo presenta novela en vitro nos permitió investigar si las diferencias en las estructuras de tejido y factores bacterianos son capaces de modular la susceptibilidad a las infecciones en vivo utilizada injertos15. BJV y CH injerto tejido mostraron propensión similar hacia la captación bacteriana en condiciones de flujo. Por lo tanto, los datos sugieren que en general la fuente de los tejidos y su estructura superficial así como proteínas adhesivas bacteriana específica por sí no son los principales factores determinantes en la adhesión bacteriana inicial.

En general, vías evocando inflamación, deposición de tejido del daño, plaquetas y fibrina en el sitio de infección endovascular son activadas por varios jugadores de1,16. Una ventaja importante del modelo desarrollado en vitro es la oportunidad de analizar paso a paso la contribución de los jugadores involucrados. Factores bacterianos solo pueden ser investigados utilizando cepas mutantes bacterianas o bacterias genéticamente modificadas expresando proteínas de adhesión individuales en su superficie14. Al elegir los medios de comunicación diferentes de la perfusión, plasma o sangre, puede evaluarse la participación de las proteínas del plasma y células sanguíneas. Otros estudios se centrarán en tejido relacionadas con factores que tejidos será previamente incubados con por ejemplo las proteínas del plasma antes de montar en la cámara de flujo de perfusión posterior. Desde jugadores que contribuyen a la aparición de válvula protésica es decir no quedan claros, futuros estudios podrían desentrañar los factores potenciales por edificio hasta una configuración experimental más compleja. Además, este montaje experimental hereda la posibilidad de que los tejidos pueden ser sembrados con una capa de CE para analizar la expresión de genes dependientes de la corte CE. La cámara de flujo paralelo de la placa también permite perfusión sobre portaobjetos cubiertas CE debido a una flexible altura interior de la cámara de perfusión. Diversas capas de cubreobjetos utilizando diversas proteínas de matriz extracelular también son una opción posible para evaluar interacciones importantes con la matriz subendotelial. Además, se pueden investigar farmacológicos inhibidores o anticuerpos funcionales por su efecto en la condición respectiva en la cámara de flujo. En Resumen, se pueden estudiar varias condiciones de complejidad creciente.

Activación inflamatoria en la zona infectada del injerto es un paso crucial, controlado por el esquileo favoreciendo la deposición de plaquetas activadas y monocitos. El impacto de esquileo las fuerzas sobre la adherencia bacteriana al tejido de las superficies son de gran preocupación. Para tratar este tema, la novedad del sistema presentado en vitro se centra en la posibilidad de montar los tejidos en una cámara de flujo. Esto refuerza la importancia del método más allá de las alternativas existentes, en el que generalmente estática interacciones entre bacterias y tejidos subyacentes han sido investigadas. A pesar de que la tensión de esquileo se presentó por agitación o por otras fuerzas externas, se ha no ha estandarizado al mismo nivel que podemos obtener de nuestro modelo de flujo uniforme.

Patrón de flujo en vivo, un no-fisiológica puede favorecer la adherencia bacteriana como la aparición de IE del nivel de la válvula de conductos implantados. Tensión de esquileo se encontró para arriba-regular parámetros inflamatorios endoteliales como la secreción de citoquinas y aumentar el factor tisular mediada por coagulación17. La interacción del tejido subyacente utilizado para prótesis de la válvula con las bacterias y su influencia sobre la expresión génica de CE bajo tensión de esquileo es importante construir una válvula menos capaz de adherencia bacteriana y la inflamación crónica.

Las cuestiones técnicas básicas de la cámara fabricada permiten investigaciones en condiciones estandarizadas en el flujo laminar18. Para asegurar el flujo laminar completamente desarrollado en el sitio del tejido investigado la cámara se construye para el injerto en una cierta distancia de la entrada del medio de montaje (significativamente más larga que la longitud de entrada computada, ver resultados y figura 1). Utilización de bombas diferentes en el sistema permitiría realizar experimentos bajo condiciones de flujo pulsátil o turbulento en el futuro.

El marco flexible de la cámara impide que la cámara con eficacia escaparse y la altura interna de la estructura permite adaptar para el grueso del tejido. La construcción de todo el sistema permite un flujo de circulación, que es de importancia realizar perfusiones de larga duración con el uso de una cantidad correspondiente de medio. Estudios previos basados en nuestro protocolo de adhesión supone una dosis de inoculación bacteriana de 107 UFC/mL para una incubación de 1 h4,19. Mediante el uso de estos valores, niveles de adherencia eran perceptibles, aunque lo suficientemente baja como para poder observar la significativa mejora de la adherencia bacteriana sin saturación de la superficie del injerto de tejido. Por otra parte, en este periodo de tiempo, era posible notar diferencias de potencial en la Unión a través de las cepas en estudio. Parámetros de corte dirigidos aquí estaban en la gama fisiológica y optimización para los vasos sanguíneos, que fueron nuestro objetivo con respecto al TSVD.

Otras modificaciones del método se centrarán en el consumo más eficiente del medio durante el procedimiento, así como sobre la simplificación de la configuración de montaje. Además, un nuevo diseño incluyendo múltiples ranuras para montaje higiénico facilitaría un experimento todo en aspectos como la eficiencia.

En esta etapa nuestro método se enfoca en los resultados de punto final y no fue probado para aplicaciones de tiempo real como el curso del tiempo de eventos dinámicos que ocurren en la superficie del tejido. Así, esta aplicación más amplia sigue siendo bajo consideración; sin embargo, cuestiones como la autofluorescencia de los tejidos, optimización de un protocolo de microscopio de fluorescencia apropiado, así como adaptaciones de la cámara deban realizar. Además, el método en su estado actual puede adaptado a monitoreo en tiempo real de Unión bacteriana a capas CE en portaobjetos de microscopio, microscopio de epifluorescencia vertical. Actualmente, somos capaces de visualizar las bacterias y otros componentes/glóbulos vinculados a los tejidos por microscopía confocal sin necesidad de procesamiento de tejido experimental posterior, que es predisponente para la visualización en tiempo real bajo flujo por invertida Microscopios de fluorescencia.

En este estudio, la cuantificación de la adherencia bacteriana fue proporcionada por el conteo de UFC mientras que la microscopía de fluorescencia es una herramienta de apoyo, no cuantitativa. Debido a problemas de resolución derivados de la falta de un lente de microscopio adecuado, proyección de imagen de fluorescencia resultó para ser menos reproducible en nuestras manos de diluciones seriadas. Sin embargo, es posible utilizar el análisis para la cuantificación al objetivo adecuado podría iluminar el tamaño entero del injerto de 8 mm de diámetro para la cuantificación confiable de los focos de la fluorescencia. Utilizando un programa de procesamiento de imagen (como el ImageJ), unidades de fluorescencia absoluta pueden cuantificarse para muestras de tejido investigado y la adherencia bacteriana podría ser expresada, por ejemplo, como señal relativa al control interno (injertos de perfusión con bacterias no etiquetados).

La limitación mayor de este valor experimental son las cuestiones relacionadas con los estudios en vitro en general. Resultados alcanzados mediante este modelo de cámara en vitro flujo podrían ser transferidas a un modelo animal para la confirmación en vivo .

En conclusión, este modelo en vitro permite investigación de bacteriano único, tejido y base de corte factores que contribuyen a la aparición de la adherencia bacteriana a los tejidos de manera gradual. Los conocimientos quedan habilitados podrían contribuir al desarrollo de más eficaces de prevención y tratamiento de la endocarditis infecciosa.

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Disclosures

Ninguno.

Acknowledgments

Este estudio fue patrocinado por una beca de la investigación fondo KU Leuven (OT/14/097) a RH. TRV fue Becario Postdoctoral de la Fundación de investigación FWO - Flandes (Bélgica; Concesión número - 12K0916N) y RH es apoyado por el fondo de investigación clínica de UZ Lovaina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium Synovis Surgical Innovations, USA PC-0404SN
Bovine Jugular Vein conduits (BJV) Contegra conduit; Medtronic Inc, USA M333105D001
CH cryopreserved homograft European Homograft Bank (EHB) -
Acu-Punch Acuderm Inc, USA P850 (8 mm); P1050 (10 mm)
human Albumin Flexbumin; Baxter, Belgium BE171464
LOT:16G12C
Tryptic soy broth (TSB) Fluka, Steinheim, Germany 22092-500G
Heart infusion broth (BHI) Fluka 53286-500G
Phosphate buffered saline (PBS). Gibco 14190-094
5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) Sigma-Aldrich, Germany 21878-100MG-F
Peristaltic pump (MODEL ISM444B) Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany 631942-2
Sonication bath VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa 142-6044 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen by ThermoFisher P36930
InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa 29027886
Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ Millipore 87206462
Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) Sarstedt 94.6140.102
1-well on Lumox detachable Sarstedt 94.6150.101
Stainless Steel - surgical Blades Swann-Morton 311
Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD Cole-Parmer EW-95702-06 Temperature range: –80 to 200°C
Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure
PharMed BPT Tubing Saint-Gobain AY242012 Autoclavable 30 min at 121°C
Tygon LMT-55 Tubing Saint Gobain Performance Plastics™ 15312022
Thermostat BMG BIOMEDIZINTECHNIK 300-0042 230V, 90VA, 50Hz

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References

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Biología del desarrollo número 143 Staphylococcus aureus endocarditis infecciosa adherencia matriz subendotelial tensión de esquileo cámara de flujo los tejidos del injerto valvular RVOT
Un modelo <em>In Vitro</em> de un sistema de placas paralelas de la perfusión para el estudio de adherencia bacteriana a los tejidos de injerto
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Ditkowski, B., Veloso, T. R.,… More

Ditkowski, B., Veloso, T. R., Bezulska-Ditkowska, M., Lubig, A., Jockenhoevel, S., Mela, P., Jashari, R., Gewillig, M., Meyns, B., Hoylaerts, M. F., Heying, R. An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues. J. Vis. Exp. (143), e58476, doi:10.3791/58476 (2019).

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