Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Digital analyse av Immunostaining av ZW10 samspill protein i Human Lung vev

Published: May 1, 2019 doi: 10.3791/58551
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 4, 4, 5, 6, 4, 4, 4, 1
1Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Department of Thoracic Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, 3Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 4Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, 5Department of Gastroenterology, Central Hospital of Wuhan, 6Department of Transfusion, Zhongnan Hospital of Wuhan University

Summary

ZW10 samspill protein (ZWINT) deltar i mitotisk spindel Checkpoint og patogenesen av kreft. Her introduserer vi en metodikk for immunostaining av ZWINT i menneskelig lungekreft vev, etterfulgt av digital skanning av hele lysbilder og bildeanalyse. Denne metodikken kan gi høy kvalitet digitale bilder og pålitelige resultater.

Abstract

Formålet med denne studien er å innføre en metodikk for immunostaining av menneskelig lunge vev, etterfulgt av hel-Slide Digital skanning og bildeanalyse. Digital skanning er en rask måte å skanne en stabel med lysbilder og produsere digitale bilder med høy kvalitet. Det kan produsere konkordante resultater med konvensjonelle lys mikroskopi (CLM) av patologer. I tillegg gjør tilgjengeligheten av digitale bilder det mulig at det samme lysbildet kan observeres samtidig av flere personer. Videre kan digitale bilder av lysbilder lagres i en database, noe som betyr at den langsiktige forverring av glass lysbilder unngås. Begrensningene i denne teknikken er som følger. Først, det er behov for høy kvalitet forberedt vev og den opprinnelige immunhistokjemi (IHC) lysbilder uten skade eller overflødig tetningsmasse rester. For det andre bør tumor eller nontumor områder spesifiseres av erfarne patologer før analysen ved hjelp av programvare, for å unngå forvirring om svulsten eller nontumor områder underscoring. For det tredje må operatøren kontrollere fargegjengivelsen gjennom hele Digitaliseringsprosessen i hele bilde bildet.

Introduction

ZW10 samspill protein (ZWINT) er en nødvendig del av kinetochore komplekset som er involvert i mitotisk spindel Checkpoint1,2,3. Det har blitt rapportert at nedbryting av ZWINT fører til avvikende prematur kromosom segregering1,2,3. Nyere studier har antydet at ZWINT er involvert i patogenesen av flere svulster ved å fremme spredning av tumorceller4,5. Vi har tidligere rapportert overuttrykte av ZWINT i lungekreft5. Det har blitt allment akseptert at analysen av lysbildene ved patologer bruker CLM er tidkrevende og ikke kvantitativ6,7,8. Videre forringelse av lagrede glass lysbilder kan gjøre det umulig å trekke tilbake tidligere opprettet lysbilder. Den nye metoden for datamaskin-baserte, digitale hel-Slide Imaging (wsi) kan overvinne disse begrensningene6,7,8.

For dette formålet, beskriver vi en metodikk for immunostaining av ZWINT i humant lungekreft vev, kombinert med hel-Slide Digital skanning og programvarebasert bildeanalyse. Den største fordelen med denne metodikken er produksjon av konkordante resultater med CLM. Denne teknologien kan bli mye brukt i de områdene av patologisk scoring av hematoksylin-eosin farging (H & E) og IHC, fluorescens in situ HYBRIDISERING (fisk), vev MICROARRAYS (TMA), og narkotika oppdagelse og utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her har blitt godkjent av etisk komité Zhongnan Hospital of Wuhan University og Renmin Hospital of Wuhan University.

1. utarbeidelse av IHC slides

  1. Fix lunge vevsprøven ved å senke den menneskelige lungevevet fragment (ca 3 x 3 cm) i 4% paraformaldehyde i fosfat-bufret saltvann (PBS) for 24 timer ved romtemperatur (RT).
  2. Tørke vevet i 80%, 95%, og 100% etanol i 15 min, 20 min, og 20 min, henholdsvis ved romtemperatur. Til slutt, dyppe vevet i 100% xylen 3x i 20 min hver ved romtemperatur.
  3. For innebygging, dypp vevet i parafin (63 ° c) i 30 min. endre parafin og dypp vevet igjen for en annen 45 min. Til slutt, endre parafin igjen og dyppe vevet i den for ytterligere 1 t.
  4. Bruk en roterende mikrotomen til å skjære vevet inn i 5 μm-tykke seksjoner og plasser dem på 20 μg/mL Poly-L-lysin-belagte sklier.
  5. For dewaxing, plasser lysbildene i en 65 ° c ovn for 2 h og, deretter, Senk seksjonene i dimethylbenzene i 15 min, etterfulgt av soaking i 100% xylen i 15 min.
  6. Fukt lysbildene med vevs delene 2x i 5 min i 100% etanol, etterfulgt av en behandling med serielt fortynnet etanol på 5 min i 95% etanol, 5 min i 80% etanol, 5 min i 70% etanol, og 5 min i 50% etanol.
  7. Utføre antigen reparasjon.
    1. Fortynne sitronsyre reparere væske (20x) til 1x med dobbel destillert H2o (ddH2o).
    2. Plasser lysbildene med vevet seksjoner og 1x sitronsyre reparere væske (300 mL) i et antigen reparasjon boks og, så, varme dem i mikrobølgeovnen ved høy effekt i 2 min, etterfulgt av oppvarming ved lav effekt å opprettholde kokende i 6 min.
    3. La delene avkjøles naturlig til romtemperatur.
    4. Erstatte sitronsyre reparere væske med 0,01 M PBS, vaske seksjonene 3x, hver gang i 5 min, i roterende shaker ved romtemperatur.
  8. Eliminer den endogene peroksidase.
    1. Fortynne 30% av H2O2 å 3% med ddH2o, sammenlegge den å det lysbilder (sikre den dekker alle vev), og ruge det lysbilder inne en våt bokse med for romtemperatur for 30 min.
      Merk: den våte boksen er en plastboks på 10 x 15 cm og kan inneholde vann.
    2. Vask lysbildene 3x, hver gang i 5 min, med 0,01 M PBS i roterende shaker ved romtemperatur.
  9. Blokker det ikke-spesifikke antigen.
    1. Fortynne konsentrert normal geit serum til 10% geit serum med PBS med 0,1% mellom 20 (PBST).
    2. Tilsett 10% geit serum til lysbildene og ruge dem i den våte boksen ved 37 ° c i 30 min.
      Merk: geite serum skal dekke alle vev i lysbildene.
  10. Stain vevet.
    1. Ruge lysbildene med kanin anti-humant anti-ZWINT antistoff (1:50) ved 4 ° c over natten.
    2. Vask lysbildene 3x, hver gang i 5 minutter, med 0,01 M PBST (1 mL 0,1% mellom 20 i 1 000 mL PBS) i roterende shaker ved romtemperatur.
    3. Ruge lysbildene med sekundært antistoff (anti-kanin deteksjons system, 1:200) i 30 min ved 37 ° c.
    4. Vask lysbildene 3x, hver gang i 5 min, med 0,01 M PBST i roterende shaker.
  11. Hvis du vil visualisere immunostaining, legger du til lysbildene 300 μL av fersk 3, 3-diaminobenzidine og deretter vask lysbildene med vann fra springen ved romtemperatur.
    Merk: graden av farging overvåkes under et mikroskop (forstørrelse 10X-40X).
  12. Counterstain vevet. Flekker på lysbildene med hematoksylin farge løsning i 2 minutter ved romtemperatur, og vask deretter lysbildene med vann fra springen i 15 minutter.
    Merk: kjernen vises blå under mikroskopet (forstørrelse 10X-40X). Hvis graden av blå farging er mer potent, kan saltsyre alkohol differensiering for 3-5 s brukes, etterfulgt av skylling av vevet tilbake til blå med vann fra springen i 15 min for å lette den fremtredende farging av vevet.
  13. Tørke lysbildene i 5 min i 50% etanol, 5 min i 70% etanol, 2x i 80% etanol i 5 min, 5 min i 95% etanol, og til slutt, 2x for 5 min hver i 100% etanol ved romtemperatur.
  14. For åpenhet, dyppe vevet seksjoner i en tank som inneholder 100% xylen i 15 min og overføre delene til en annen tank som inneholder 100% xylen i 15 min ved romtemperatur.
  15. For tetting, ta 50-100 μL av nøytral tannkjøtt og tilsett 5% xylen til blandingen (unngå å blande i bobler). Tilsett 15 μL av den nevnte blandingen til lunge vevs seksjonene. Forsegle filmen med dekkglass og forsiktig trykk bobler ut.

2. automatisk hele lysbilde skanning av IHC slides

  1. La de forseglede lysbildene tørke i 12 timer ved romtemperatur for å desiccate dem.
  2. Velg alternativet Bright-feltet manuelt og angi grensesnittet for manuell skanning.
  3. Endre navnet på lysbildene, og velg en lagringsbane for bildene.
  4. Angi skanneområdet og velg alternativet Skann prøver ved hjelp av brukerdefinerte terskler. Terskelen er omtrent 50 med et skannings område Utvidelses verdi på 200 μm.
  5. Angi skannings fokus verdien, Velg fokuset automatisk – den varierer fra 1050 til 2650 – og til slutt velger du enkelt lags modus.
  6. Last inn IHC slides på arbeidsstasjonen og Start automatisk skanning.
    Merk: Kontroller at lysbildene ikke er skadet. Holde lysbildene rene og gjennomsiktige og unngå støv, konfetti og overflødig tetningsmasse rester på lysbildene. Glasset Slide og dekkglass bør være blottet for merker. Ikke Rengjør lysbildene med xylen. Størrelsen på lysbildene er angitt i tabell 1.
  7. Skann hele vevs delen automatisk på et lysbilde med 20X, 40X eller 100-forstørrelse.
  8. Samle og lagre bildene på slutten av skanningen i hele lysbildet.

3. analyse av slides av Imaging Software

  1. Start histopathological bildeanalyse programvare og velg lokal datamaskin.
  2. Åpne filen som lagrer skannings dataene.
  3. Velg riktig zoom nivå fra rekkevidde 2X til 40X.
  4. Juster fargen for å angi optimal kontrast via Bytt fargejustering.
  5. Manuelt sirkle og navngi deler av interesse på hvert bilde.
    Merk: for eksempel kan du sirkle ett område og navngi det som tumor området.
  6. Velg plugins og QC. På denne tiden, dukker scenario byggmester opp.
  7. Velg tetthets Quant , og Juster deteksjons linjen.
    Merk: denne prosessen bør utføres nøye. Baren med blå toleranse brukes til å justere fargen på den cellulære kjernen. Linjen med brun toleranse brukes til å justere metningen for fyllfargen i bildet. Resultatene av bildene etter justeringer bør være i samsvar med de opprinnelige motstykker.
  8. Juster poeng nivåene for å gjøre farge intensiteten til de sirkel områdene som ligner på de opprinnelige bildene.
    Merk: mørk brun indikerer sterk positiv, brun gul er moderat positiv, lys gul er svakt positiv, og hvit er negativ.
  9. Lagre og navngi modellen som en fil. Bruk modellen på andre lysbilder og velg merket merknad".
  10. La programvaren automatisk beregne H-poengsum for de sirkler rundt områdene i bildet.

4. kvantifisering av resultatene ved hjelp av H-scoring system9,10

  1. Beregn prosentandelen av immunostaining og farge intensiteten (0: negativ, 1 +: svak, 2 +: moderat, 3 +: sterk).
  2. Bruk en scoring system (H-score) for å beregne patologisk scoring av tumor og tilstøtende nontumor områder.
    Merk: H-score = (% av celler med svak intensitet x 1) + (% av celler med moderat intensitet x 2) + (% av celler med sterk intensitet x 3). Derfor er den maksimale H-score 300 hvis 100% av cellene er kvantifisert med sterk intensitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi målte uttrykket nivåer av ZWINT i 28 par av ikke-liten-celle lungekreft (NSCLC) eksemplarer (tumor og tilstøtende nontumor vev), inkludert 14 plateepitel celle kreftsvulster (SCCs) og 14 adenocarcinomas (ADFS), av IHC. Hele lysbilde Digital skanning av lysbildene gitt digitale bilder av høy kvalitet (figur 1a). Resultatene viste at H-resultatet av lungekreft var signifikant høyere enn for tilstøtende noncancer vev (P < 0,0001, tosidig t-test) (figur 1a og 1B). I tillegg fant vi ut at uttrykks nivået for ZWINT i SCCs var signifikant høyere enn i ADFS (figur 1C).

Figure 1
Figur 1 : Immunhistokjemiske farging for lungekreft vev. Dette tallet har blitt modifisert fra Yuan et al. 5 med tillatelse fra Dove press. (A) dette panelet viser representative immunhistokjemiske bilder av lungekreftpasienter (forstørrelser: 10X og 40X). (B) dette panelet viser H-score på lungekreft og tilstøtende noncancer vev. (C) dette panelet viser H-poengsum for ADFS og SCCs. Feilfeltene angir standardavvik. * P < 0,05; P < 0,001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

MIN (mm) MAKS (mm)
Bredde 25 26
Lengde 75 76
Tykkelse 0,9 1,2

Tabell 1: lysbilde størrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hel lysbilde skanning blir et hett tema for sin robuste skanning og produksjon av bilder av høy kvalitet for kliniske og forskningsformål11,12,13. Bilder kan produseres av Slide-Scanning mikroskop innen minutter11,12,13. Ved å anvende denne metodikken oppnådde vi bilder av høy kvalitet for ZWINT IHC slides og sammenlignet H-resultatet mellom tumor og nontumor vev. I protokollen som presenteres her, de mest kritiske trinnene er utarbeidelse av høy kvalitet IHC slides, bildet oppkjøpet, og spesifikasjonen av tumor og nontumor områder før patologisk scoring13,14 , 15 priser og , 16i den.

Den nåværende metoden har noen fordeler sammenlignet med (CLM). Digital skanning er rask nok (~ 20 lysbilder/time) til å skanne en stabel med lysbilder og produsere høykvalitets digitale bilder. Det kan produsere konkordante resultater med CLM men tar relativt kortere tid. Tilgjengeligheten av digitale bilder gjør det mulig at det samme lysbildet kan observeres samtidig av flere personer. Digitale bilder av lysbilder kan lagres i en database, noe som betyr at lang tids forverring av glass lysbilder unngås.

Begrensningene av denne teknikken omfatter behovet for høy kvalitet vev og IHC slides6,8,11 og teknisk ekspertise for å spesifisere tumor eller nontumor vevsprøver før analysen ved hjelp av Imaging programvare , for å unngå forvirring om tumor eller nontumor områder underscoring6,7. Operatøren trenger også å overvåke fargegjengivelsen gjennom digitalisering prosessen i hele lysbildet Imaging17.

Denne metoden kan aktivt anvendes i fisk, TMA, og narkotika oppdagelse og utvikling6,18. Tabata et al. har undersøkt bruken av wsi i primære patologiske diagnoser19. De ettertid analysert 1070 WSI prøver fra ni sykehus i Japan og bekreftet validering av bruk av WSI i primære diagnoser. En av de viktigste fordelene med WSI er at det tillater samtidig visning av lysbildene av flere studenter20. Derfor kan validering av bilder i hele lysbildet bidra til utviklingen av digital diagnostikk for utdannings-og forskningsformål6,18,21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette prosjektet ble støttet av det nasjonale Natural Foundation i Kina (nr. 81500151, 81400121, 81270607, 81541027 og 81501352) og Natural Foundation i Hubei-provinsen (Kina) (nr. 2017CFB631). Forfatterne uttrykker sin takknemlighet til Guo Qin, Chang min, Li Hui, og deres kolleger i Wuhan Google Biological Technology Co, LTD for deres teknisk støtte. Forfatterne takker også Muhammad Jamal for språket redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pannoramic MIDI 3D HISTECH Cat: PMIDI-040709 An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more.
QuantCenter 3D HISTECH Downloaded from the official website of the company The framework for 3DHISTCH's image analysis applications.
LEICA RM2235 Leica Microsystems Cat: 14050038604 The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation.
Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody Abcam Cat: ab197794 Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue.
Anti-rabbit secondary antibody Wuhan Goodbio Technology Cat:GB23303-1 Secondary antibody for IHC staining.
Phosphate-buffered saline Wuhan Goodbio Technology Cat:G0002 A solution containing a phosphate buffer.
OLYMPUS CX23 OLYMPUS Cat:6M87620 Microscope for detection of H&E or IHC slides.
Dimethylbenzene Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Cat:1330-20-7 A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study.
Hematoxylin Staining Solution Wuhan Servicebio technology Cat:G1039 It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue.
Tween 20 Baitg Cat:2005-64-5 It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications.
Citric acid repair liquid Wuhan Servicebio technology Cat:G1202 Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure.
LEICA ASP200s Leica Cat: 14048043626 It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes.
LEICA Arcadia H Leica Cat: 14039354103 It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability.
LEICA Arcadia C Leica Cat: 14039354102 It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C.
CaseViewer Software 3DHISTECH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Endo, H., Ikeda, K., Urano, T., Horie-Inoue, K., Inoue, S. Terf/TRIM17 stimulates degradation of kinetochore protein ZWINT and regulates cell proliferation. The Journal of Biochemistry. 151 (2), 139-144 (2012).
  2. Wang, H., et al. Human Zwint-1 specifies localization of Zeste White 10 to kinetochores and is essential for mitotic checkpoint signaling. Journal of Biological Chemistry. 279 (52), 54590-54598 (2004).
  3. Lin, Y. T., Chen, Y., Wu, G., Lee, W. H. Hec1 sequentially recruits Zwint-1 and ZW10 to kinetochores for faithful chromosome segregation and spindle checkpoint control. Oncogene. 25 (52), 6901-6914 (2006).
  4. Ying, H., et al. Overexpression of Zwint predicts poor prognosis and promotes the proliferation of hepatocellular carcinoma by regulating cell-cycle-related proteins. OncoTargets and Therapy. 11, 689-702 (2018).
  5. Yuan, W., et al. Bioinformatic analysis of prognostic value of ZW10 interacting protein in lung cancer. OncoTargets and Therapy. 11, 1683-1695 (2018).
  6. Higgins, C. Applications and challenges of digital pathology and whole slide imaging. Biotechnic & Histochemistry. 90 (5), 341-347 (2015).
  7. Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
  8. Al-Janabi, S., Huisman, A., van Diest, P. J. Digital pathology: current status and future perspectives. Histopathology. 61 (1), 1-9 (2012).
  9. Bonomi, P. D., et al. Predictive biomarkers for response to EGFR-directed monoclonal antibodies for advanced squamous cell lung cancer. Annals of Oncology. 29 (8), 1701-1709 (2018).
  10. Villalobos, M., et al. ERCC1 assessment in upfront treatment with and without cisplatin-based chemotherapy in stage IIIB/IV non-squamous non-small cell. Medical Oncology. 35 (7), 106 (2018).
  11. Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).
  12. Huisman, A., Looijen, A., van den Brink, S. M., van Diest, P. J. Creation of a fully digital pathology slide archive by high-volume tissue slide scanning. Human Pathology. 41 (5), 751-775 (2010).
  13. Gray, A., Wright, A., Jackson, P., Hale, M., Treanor, D. Quantification of histochemical stains using whole slide imaging: development of a method and demonstration of its usefulness in laboratory quality control. Journal of Clinical Pathology. 68 (3), 192-199 (2015).
  14. Hofman, F. M., Taylor, C. R. Immunohistochemistry. Current Protocols in Immunology. 103, Unit 21.4 (2013).
  15. Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  16. Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D. K., Grizzle, W. E. A standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotechnic & Histochemistry. 91 (5), 309-326 (2016).
  17. Clarke, E. L., Treanor, D. Colour in digital pathology: a review. Histopathology. 70 (2), 153-163 (2017).
  18. Potts, S. J. Digital pathology in drug discovery and development: multisite integration. Drug Discovery Today. 14 (19-20), 935-941 (2009).
  19. Tabata, K., et al. Whole-slide imaging at primary pathological diagnosis: Validation of whole-slide imaging-based primary pathological diagnosis at twelve Japanese academic institutes. Pathology International. 67 (11), 547-554 (2017).
  20. Saco, A., Bombi, J. A., Garcia, A., Ramírez, J., Ordi, J. Current Status of Whole-Slide Imaging in Education. Pathobiology. 83 (2-3), 79-88 (2016).
  21. Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).

Tags

Kreftforskning automatisk Digital teknikk lungekreft ZW10 samspill protein immunostaining digitalisert hel-Slide Imaging H-score
Digital analyse av Immunostaining av ZW10 samspill protein i Human Lung vev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, Y., Song-ping, X., Pan, L.,… More

Wen, Y., Song-ping, X., Pan, L., Xiao-yan, L., Shan, P., Qian, Y., Meng, S., Xiao-xing, H., Rui-jing, X., Jie, X., Qiu-ping, Z., Liang, S. Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues. J. Vis. Exp. (147), e58551, doi:10.3791/58551 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter