Summary
La proteina interagenti della W10 partecipa al checkpoint del mandrino mitotico e alla patogenesi del carcinoma. Qui, introduciamo una metodologia dell'immunostaining della WINT nei tessuti del cancro del polmone umano, seguita dalla scansione digitale di interi diapositive e analisi delle immagini. Questa metodologia può fornire immagini digitali di alta qualità e risultati affidabili.
Abstract
Lo scopo di questo studio è quello di introdurre una metodologia di immunostaining dei tessuti polmonari umani, seguita da scansione digitale e analisi delle immagini di inter-slide. La scansione digitale è un modo veloce per eseguire la scansione di una pila di diapositive e produrre immagini digitali di alta qualità. Può produrre risultati concordanti con microscopia leggera convenzionale (CLM) dai patologi. Inoltre, la disponibilità di immagini digitali rende possibile che la stessa diapositiva possa essere osservata contemporaneamente da più persone. Inoltre, le immagini digitali delle diapositive possono essere memorizzate in un database, il che significa che si evita il deterioramento a lungo termine dei vetrini di vetro. Le limitazioni di questa tecnica sono le seguenti. In primo luogo, ha bisogno di tessuto preparato di alta qualità e dei vetrini originali dell'immunosofia (IHC) senza danni o residui di sigillanti in eccesso. In secondo luogo, le aree tumorali o non tumorali devono essere specificate da patologi esperti prima dell'analisi utilizzando un software, al fine di evitare qualsiasi confusione sulle aree tumorali o non tumorali durante il punteggio. In terzo luogo, l'operatore deve controllare la riproduzione del colore durante tutto il processo di digitalizzazione nell'imaging a tutta la diapositiva.
Introduction
La proteina interagenti w10 è una componente necessaria del complesso cinetochore che è coinvolto nel checkpoint del mandrino mitotico1,2,3. È stato riferito che l'esaurimento della WINT porta ad una segregazione aberrante del cromosoma precoce1,2,3. Recenti studi hanno suggerito che la WINT è coinvolta nella patogenesi di tumori multipli promuovendo la proliferazione delle cellule tumorali4,5. In precedenza abbiamo riportato la sovraespressione della WINT nel cancro ai polmoni5. È stato ampiamente accettato che l'analisi dei vetrini da parte dei patologi che utilizzano CLM richiede molto tempo e non quantitativa6,7,8. Inoltre, il deterioramento dei vetrini di vetro conservati potrebbe rendere impossibile ritrarre i vetrini creati in precedenza. Il metodo emergente di imaging digitale a diapositiva (WSI) basato su computer può superare queste limitazioni6,7,8.
A tal fine, descriviamo una metodologia dell'immunostaining della WINT nei tessuti del cancro del polmone umano, accoppiata con la scansione digitale a tutta diapositiva e l'analisi delle immagini basate su software. Il vantaggio principale di questa metodologia è la produzione di risultati concordanti con CLM. Questa tecnologia può essere ampiamente utilizzata nelle aree di punteggio patologico della colorazione ematossina-eosina (H&E) e IHC, della fluorescenza nell'ibridazione in situ (FISH), dei microarray tissutali (TMA) e della scoperta e sviluppo di farmaci.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Ospedale di Hongnan dell'Università di Wuhan e dall'Ospedale Renmin dell'Università di Wuhan.
1. Preparazione dei vetrini IHC
- Fissare il campione di tessuto polmonare immergendo il frammento di tessuto polmonare umano (circa 3 x 3 cm) nel 4% di paraformaldeide nella salina con buffer fosfato (PBS) per 24 h a temperatura ambiente (RT).
- Disidratare il tessuto in 80%, 95%, e 100% etanolo per 15 min, 20 min, e 20 min, rispettivamente, a temperatura ambiente. Infine, immergere il tessuto in 100% xilene 3x per 20 min ciascuno a temperatura ambiente.
- Per l'incorporamento, immergere il tessuto in paraffina (63 gradi centigradi) per 30 min. Infine, cambiare di nuovo la paraffina e immergere il tessuto in esso per altri 1 h.
- Utilizzare un microtoma rotativo per tagliare il tessuto in sezioni spesse 5 m e posizionarli su vetrini rivestiti in poli-lisina di 20 g/mL.
- Per il dewaxing, mettete i vetrini in un forno a 65 gradi per 2 h e poi immergete le sezioni in dimethylbenzene per 15 min, seguite da ammollo in 100% xilene per 15 min.
- Idratare i vetrini con le sezioni tissutali 2x per 5 min in 100% etanolo, seguito da un trattamento con etanolo diluito in serie di 5 min nel 95% di etanolo, 5 min nell'80% di etanolo, 5 min in 70% etanolo e 5 min in 50% etanolo.
- Eseguire la riparazione dell'antigene.
- Diluire il liquido di riparazione dell'acido citrico (20x) a 1x con H2O a doppia distillazione (ddH2O).
- Mettere i vetrini con le sezioni di tessuto e il liquido di riparazione dell'acido citrico 1x (300 mL) in una scatola di riparazione dell'antigene e, quindi, riscaldarli nel forno a microonde ad alta potenza per 2 minuti, seguito dal riscaldamento a bassa potenza per sostenere l'ebollizione per 6 min.
- Lasciare raffreddare le sezioni naturalmente a temperatura ambiente.
- Sostituire il liquido di riparazione dell'acido citrico con 0,01 M PBS, lavare le sezioni 3x, ogni volta per 5 min, nello shaker rotativo a temperatura ambiente.
- Eliminare la perossidasi endogena.
- Diluire il 30% di H2O 2-3% con ddH2O, aggiungerlo ai vetrini (assicurarsi che copra tutti i tessuti), e incubare i vetrini in una scatola umida a temperatura ambiente per 30 min.
Nota: La scatola bagnata è una scatola di plastica di 10 x 15 cm e può contenere acqua. - Lavare i vetrini 3x, ogni volta per 5 min, con 0,01 M PBS nello shaker rotante a temperatura ambiente.
- Diluire il 30% di H2O 2-3% con ddH2O, aggiungerlo ai vetrini (assicurarsi che copra tutti i tessuti), e incubare i vetrini in una scatola umida a temperatura ambiente per 30 min.
- Bloccare l'antigene non specifico.
- Diluire il siero di capra normale concentrato al 10% di siero di capra con PBS con 0.1% Tween 20 (PBST).
- Aggiungere il 10% del siero di capra agli scivoli e incubarli nella scatola bagnata a 37 gradi centigradi per 30 min.
Nota: Il siero di capra dovrebbe coprire tutti i tessuti nelle diapositive.
- Macchiare i tessuti.
- Incubare gli scivoli con anticorpo anti-uomo anti-zWINT (1:50) a 4 gradi centigradi durante la notte.
- Lavare i vetrini 3x, ogni volta per 5 min, con 0,01 M PBST (1 mL dello 0,1% Tween 20 in 1.000 mL PBS) nello shaker rotativo a temperatura ambiente.
- Incubare i vetrini con anticorpo secondario (sistema di rilevamento anti-coniglio, 1:200) per 30 min a 37 gradi centigradi.
- Lavare i vetrini 3x, ogni volta per 5 min, con 0,01 M PBST nello shaker rotante.
- Per visualizzare l'immunostaining, aggiungere i vetrini a 300 litri di 3,3 diaminobenzide freschi e, quindi, lavare i vetrini con acqua del rubinetto a temperatura ambiente.
Nota: Il grado di tintura viene monitorato al microscopio (ingrandimento 10X - 40X). - Contromacchiare il tessuto. Macchiare i vetrini con soluzione di colorazione ematossitale per 2 min a temperatura ambiente e, quindi, lavare i vetrini con acqua del rubinetto per 15 min.
Nota: Il nucleo appare blu al microscopio (ingrandimento 10X - 40X). Se il grado di colorazione blu è più potente, la differenziazione dell'alcool cloridrico per 3 - 5 s può essere utilizzata, seguita dal risciacquo del tessuto in blu con acqua del rubinetto per 15 min per facilitare la colorazione prominente del tessuto. - Disidratare i vetrini per 5 min nel 50% di etanolo, 5 min nel 70% di etanolo, 2x nell'80% di etanolo per 5 min, 5 min in 95% etanolo e infine 2x per 5 min ciascuno in 100% etanolo a temperatura ambiente.
- Per trasparenza, immergere le sezioni di tessuto in un serbatoio contenente 100% xilene per 15 min e trasferire le sezioni a un altro serbatoio contenente 100% xilene per 15 min a temperatura ambiente.
- Per la guarnizione, prendere 50 - 100 l di gomma neutra e aggiungere 5% xilene alla miscela (evitare di mescolare in bolle). Aggiungere 15 l della miscela di cui sopra alle sezioni del tessuto polmonare. Sigillare la pellicola con il vetro di copertura e premere delicatamente le bolle.
2. Scansione automatica delle diapositive IHC
- Lasciare asciugare i vetrini sigillati per 12 ore a temperatura ambiente per desicarli.
- Selezionare manualmente l'opzione Campo luminoso e immettere l'interfaccia di scansione manuale.
- Rivedere il nome delle diapositive e selezionare un percorso di archiviazione per le immagini.
- Impostare l'area di scansione e scegliere l'opzione Analizza campioni utilizzando soglie impostate dall'utente. La soglia è di circa 50 con un valore di espansione dell'area di scansione di 200 m.
- Impostare il valore dello stato attivo per la scansione, selezionare automaticamente lo stato attivo (compreso tra 1050 e 2650) e infine selezionare Modalità a livello singolo.
- Caricare le diapositive IHC sulla workstation e avviare la scansione automatica.
Nota: Assicurarsi che le diapositive non siano danneggiate. Mantenere i vetrini puliti e traslucidi ed evitare polvere, coriandoli e residui di sigillante in eccesso sui vetrini. Lo scivolo di vetro e la coverslip devono essere privi di segni. Non pulire i vetrini con lo xilene. La dimensione delle diapositive è indicata nella tabella 1. - Scansiona automaticamente l'intera sezione del tessuto su una diapositiva con un ingrandimento 20X, 40X o 100X.
- Raccogliere e memorizzare le immagini alla fine della scansione di diapositive intero.
3. Analisi delle diapositive mediante il software di imaging
- Avviare il software di analisi delle immagini istopatologiche e selezionare Computer locale.
- Aprire il file in cui sono memorizzati i dati di scansione.
- Selezionare il livello di zoom appropriato dall'intervallo 2X a 40X.
- Regolare il colore per impostare il contrasto ottimale tramite Attiva/disattiva regolazione colore.
- Cerchiare e assegnare un nome manuale alle parti di interesse su ogni immagine.
Nota: Ad esempio, è possibile cerchiare un'area e denominarla Area tumore. - Selezionare Plugin e QC. In questo momento, Scenario Builder si apre.
- Selezionare Densità quant e regolare la barra di rilevamento.
Nota: Questo processo deve essere eseguito con attenzione. La barra della tolleranza blu viene utilizzata per regolare il colore del nucleo cellulare. La barra della tolleranza Marrone viene utilizzata per regolare la saturazione del colore di riempimento nell'immagine. I risultati delle immagini dopo le regolazioni devono essere coerenti con le controparti originali. - Regolare i livelli di punteggio per rendere l'intensità di colorazione delle aree cerchiate simile a quella delle immagini originali.
Nota: il marrone scuro indica un forte positivo, il giallo brunastro è moderatamente positivo, il giallo chiaro è debolmente positivo e il bianco è negativo. - Archiviare e denominare il modello come file. Applicare il modello ad altre diapositive e selezionare Annotazioneselezionata".
- Lascia che il software calcoli automaticamente il punteggio H per le aree cerchiate nell'immagine.
4. Quantificazione dei punteggi utilizzando il sistema di punteggio H9,10
- Calcolare la percentuale di immunostaining e l'intensità di colorazione (0: negativo, 1: debole, 2: moderato, 3: forte).
- Utilizzare un sistema di punteggio (H-score) per calcolare il punteggio patologico del tumore e aree non tumorali adiacenti.
Nota: punteggio H (% di cellule con intensità debole x 1) - (% di cellule con intensità moderata x 2) - (% di cellule con intensità forte x 3). Pertanto, il punteggio H massimo è 300 se il 100% delle cellule viene quantificato con forte intensità.
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Representative Results
Abbiamo misurato i livelli di espressione di .WINT in 28 coppie di campioni di cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) (tessuti tumorali e non tumorali adiacenti), tra cui 14 carcinomi a cellule squamose (SCC) e 14 adenocarcinomi (ADC), di IHC. La scansione digitale delle diapositive ha fornito immagini digitali di alta qualità (Figura 1A). I risultati hanno mostrato che il punteggio H del cancro del polmone era significativamente superiore a quello dei tessuti non canceri adiacenti (P < 0.0001, t-test a due code) (Figura 1A e 1B). Inoltre, è stato rilevato che il livello di espressione di ,WINT negli SCC era significativamente superiore a quello degli ADC (Figura 1C).
Figura 1 : colorazione immunoistochimica per i tessuti del cancro del polmone. Questa cifra è stata modificata da Yuan et al. 5 con il permesso di Dove Press. (A) Questo pannello mostra immagini immunoistochimiche rappresentative di pazienti affetti da cancro del polmone (ingrandimenti: 10X e 40X). (B) Questo pannello mostra il punteggio H del cancro del polmone e dei tessuti non canceradiacenti. (C) Questo pannello mostra il punteggio H di ADC e SCC. Le barre di errore indicano la deviazione standard. P < 0,05; P < 0.001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| MIN (mm) | MAX (mm) | |
| Larghezza | 25 mi lato | 26 del sistema di |
| lunghezza | 75 Del 13o | 76 Del sistema |
| Spessore | 0,9 0,5 | 1.2 (in questo modo) |
Tabella 1: Dimensioni diapositiva.
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Discussion
La scansione a scorrimento intero sta diventando un argomento caldo per la sua robusta scansione e produzione di immagini di alta qualità per scopi clinici e di ricerca11,12,13. Le immagini possono essere prodotte da microscopi a scansione a scorrimento in pochi minuti11,12,13. Applicando questa metodologia, abbiamo ottenuto immagini di alta qualità per i vetrini iHC di .WINT e confrontato il punteggio H tra tessuti tumorali e non tumorali. Nel protocollo qui presentato, i passaggi più critici sono la preparazione delle diapositive IHC di alta qualità, l'acquisizione dell'immagine e la specifica delle aree tumorali e non tumorali prima del punteggio patologico13,14 , 15 Mi lasa del sistema , 16.
Il metodo attuale presenta alcuni vantaggi rispetto a (CLM). La scansione digitale è abbastanza veloce (20 diapositive all'ora) per eseguire la scansione di una pila di diapositive e produrre immagini digitali di alta qualità. Può produrre risultati concordanti con CLM, ma richiede relativamente meno tempo. La disponibilità di immagini digitali rende possibile che la stessa diapositiva possa essere osservata contemporaneamente da più persone. Le immagini digitali delle diapositive possono essere memorizzate in un database, il che significa che si evita il deterioramento a lungo termine dei vetrini di vetro.
I limiti di questa tecnica includono la necessità di tessuti di alta qualità e diapositive IHC6,8,11 e competenze tecniche per specificare i campioni di tessuto tumorale o non tumorale prima dell'analisi utilizzando il software di imaging , al fine di evitare confusione sul tumore o aree non tumorali durante il punteggio6,7. L'operatore deve anche monitorare la riproduzione del colore durante tutto il processo di digitalizzazione nell'imaging a tutta la diapositiva17.
Questo metodo può essere applicato attivamente in FISH, TMA, e la scoperta di farmaci e lo sviluppo6,18. Tabata e altri hanno studiato l'uso di WSI nelle diagnosi patologiche primarie19. Hanno analizzato retrospettivamente 1070 campioni di WSI provenienti da nove ospedali in Giappone e hanno confermato la convalida dell'uso di WSI nelle diagnosi primarie. Uno dei principali vantaggi di WSI è che permette la visualizzazione simultanea delle diapositive da parte di più studenti20. Pertanto, la convalida di immagini di scansione di diapositive intere potrebbe contribuire allo sviluppo della diagnostica digitale per scopi educativi e di ricerca6,18,21.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato sostenuto dalla National Natural Foundation of China (n. 81500151, 81400121, 81270607, 81541027 e 81501352) e dalla Natural Foundation of Hubei Province (Cina) (N. 2017CFB631). Gli autori esprimono il loro apprezzamento a Guo Qin, Chang Min, Li Hui e ai loro colleghi di Wuhan Google Biological Technology Co., LTD per il loro supporto tecnico. Gli autori ringraziano anche Muhammad Jamal per il montaggio del linguaggio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pannoramic MIDI | 3D HISTECH | Cat: PMIDI-040709 | An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more. |
| QuantCenter | 3D HISTECH | Downloaded from the official website of the company | The framework for 3DHISTCH's image analysis applications. |
| LEICA RM2235 | Leica Microsystems | Cat: 14050038604 | The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation. |
| Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody | Abcam | Cat: ab197794 | Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue. |
| Anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Goodbio Technology | Cat:GB23303-1 | Secondary antibody for IHC staining. |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan Goodbio Technology | Cat:G0002 | A solution containing a phosphate buffer. |
| OLYMPUS CX23 | OLYMPUS | Cat:6M87620 | Microscope for detection of H&E or IHC slides. |
| Dimethylbenzene | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent | Cat:1330-20-7 | A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study. |
| Hematoxylin Staining Solution | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1039 | It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue. |
| Tween 20 | Baitg | Cat:2005-64-5 | It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications. |
| Citric acid repair liquid | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1202 | Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure. |
| LEICA ASP200s | Leica | Cat: 14048043626 | It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes. |
| LEICA Arcadia H | Leica | Cat: 14039354103 | It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability. |
| LEICA Arcadia C | Leica | Cat: 14039354102 | It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C. |
| CaseViewer Software | 3DHISTECH |
References
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