Cancer Research

Digital analys av immunofärgning av ZW10 interagerande protein i mänskliga lung vävnader

Published: May 1, 2019 doi: 10.3791/58551

Yuan Wen¹, Xie Song-ping², Liu Pan³, Liu Xiao-yan¹, Pan Shan⁴, Yin Qian⁴, Sun Meng⁵, Huang Xiao-xing⁶, Xiao Rui-jing⁴, Xiong Jie⁴, Zhang Qiu-ping⁴, Shao Liang¹

¹Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, ²Department of Thoracic Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, ³Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, ⁴Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, ⁵Department of Gastroenterology, Central Hospital of Wuhan, ⁶Department of Transfusion, Zhongnan Hospital of Wuhan University

Summary

ZW10 interagerande protein (ZWINT) deltar i kontrollpunkten för mitotisk spindel och patogenesen för carcinoma. Här introducerar vi en metod för immunofärgning av ZWINT i mänskliga lungcancer vävnader, följt av digital skanning av hela bilder och bildanalys. Denna metodik kan ge högkvalitativa digitala bilder och pålitliga resultat.

Abstract

Syftet med denna studie är att införa en metod för immunofärgning av mänskliga lung vävnader, följt av hel-Slide Digital skanning och bildanalys. Digital skanning är ett snabbt sätt att skanna en bunt med bilder och skapa digitala bilder med hög kvalitet. Det kan producera samstämmiga resultat med konventionell ljusmikroskopi (CLM) av patologer. Dessutom gör tillgängligheten av digitala bilder det möjligt att samma bild kan observeras samtidigt av flera personer. Dessutom kan digitala bilder av diabilder lagras i en databas, vilket innebär att den långsiktiga försämringen av glas rutschbanor undviks. Begränsningarna i denna teknik är följande. Först behöver den högkvalitativ beredd vävnad och den ursprungliga immunohistokemi (IHC) diabilder utan någon skada eller överskott tätningsmedel rester. Andra, tumör eller nontumor områden bör specificeras av erfarna patologer innan analysen med hjälp av programvara, för att undvika förvirring om tumören eller nontumor områden under scoring. För det tredje måste operatören kontrollera färgåtergivningen under hela Digitaliseringsprocessen i hel bilds avbildning.

Introduction

ZW10 interagerande protein (Zwint) är en nödvändig komponent i Kinetochor-komplexet som är involverat i den mitotiska spindelns Checkpoint¹^,²^,³. Det har rapporterats att utarmningen av Zwint leder till avvikande för tidig kromosom segregering¹^,²^,³. Nyligen genomförda studier har föreslagit att Zwint är involverad i patogenesen av flera tumörer genom att främja spridningen av tumörceller^4,5. Vi rapporterade tidigare överuttryck av ZWINT i lungcancer⁵. Det har varit allmänt accepterat att analysen av bilder av patologer med hjälp av CLM är tidskrävande och inte kvantitativa⁶^,⁷^,⁸_. Dessutom kan försämringen av lagrade glas bilder göra det omöjligt att dra tillbaka tidigare skapade diabilder. Den framväxande metoden för datorbaserad, digital hel bilds avbildning (WSI) kan övervinna dessa begränsningar⁶^,⁷^,⁸.

För detta ändamål beskriver vi en metod för immunofärgning av ZWINT i mänskliga lungcancer vävnader, tillsammans med hel-Slide Digital skanning och mjukvarubaserad bildanalys. Den största fördelen med denna metod är produktionen av samstämmiga resultat med CLM. Denna teknik kan användas i stor utsträckning inom områdena patologisk scoring av hematoxylin-eosin färgning (H & E) och IHC, fluorescens i situ hybridisering (fisk), vävnad Microarrays (TMA), och Drug discovery och utveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av etikkommittén för Zhongnan Hospital of Wuhan University och Renmin Hospital of Wuhan University.

1. beredning av IHC diabilder

Fixera lungvävnad provet genom att doppa den mänskliga lungvävnad fragment (ca 3 x 3 cm) i 4% PARAFORMALDEHYD i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för 24 h vid rumstemperatur (RT).
Torka av vävnaden i 80%, 95% och 100% etanol i 15 min, 20 min och 20 min, respektive, vid rumstemperatur. Slutligen, sänk vävnaden i 100% xylen 3x för 20 min vardera vid rumstemperatur.
För inbäddning, sänk vävnaden i paraffin (63 ° c) i 30 min. Byt paraffin och sänk ned vävnaden igen i ytterligare 45 min. Slutligen, ändra paraffin igen och sänk vävnaden i den för ytterligare 1 h.
Använd en roterande mikrotom för att skära vävnaden i 5 μm tjocka sektioner och placera dem på 20 μg/mL Poly-L-lysinbelagda diabilder.
För avvaxning, placera bilderna i en 65 ° c ugn för 2 h och sedan doppa sektionerna i dimetylbensen i 15 min, följt av blötläggning i 100% xylen i 15 min.
Återfukta bilderna med vävnad avsnitten 2x för 5 min i 100% etanol, följt av en behandling med seriellt utspädd etanol av 5 min i 95% etanol, 5 min i 80% etanol, 5 min i 70% etanol, och 5 min i 50% etanol.
Utför antigen reparation.
1. Späd citronsyra reparations vätska (20x) till 1x med dubbeldestillerat H₂o (DDH₂o).
2. Placera bilderna med vävnaden sektioner och 1x citronsyra reparation vätska (300 mL) i en antigen reparations låda och sedan värma dem i mikrovågsugnen med hög effekt för 2 min, följt av uppvärmning vid låg effekt för att upprätthålla kokande för 6 min.
3. Låt sektionerna svalna naturligt till rumstemperatur.
4. Byt ut citronsyra reparations vätskan med 0,01 M PBS, tvätta avsnitten 3x, varje gång i 5 min, i roterande skakapparat i rumstemperatur.
Eliminera endogena peroxidashämmare.
1. Späd 30% av H₂o₂ till 3% med DDH₂o, tillsätt det till diabilderna (se till att det täcker alla vävnader), och inkubera bilderna i en våt låda i rumstemperatur i 30 min.
  Obs: Wet Box är en plastburk med 10 x 15 cm och kan innehålla vatten.
2. Tvätta bilderna 3x, varje gång i 5 min, med 0,01 M PBS i den roterande skakapparaten i rumstemperatur.
Blockera icke-specifika antigen.
1. Späd det koncentrerade normala get serum till 10% get serum med PBS med 0,1% Tween 20 (PBST).
2. Tillsätt 10% get serum till glidbanorna och inkubera dem i våt boxen vid 37 ° c i 30 min.
  Anmärkning: getserum bör täcka alla vävnader i diabilderna.
Färga vävnaderna.
1. Inkubera bilderna med kanin anti-human anti-ZWINT antikropp (1:50) vid 4 ° c över natten.
2. Tvätta bilderna 3x, varje gång i 5 minuter, med 0,01 M PBST (1 mL 0,1% Tween 20 i 1 000 mL PBS) i den roterande skakapparaten i rumstemperatur.
3. Inkubera diabilderna med sekundär antikropp (anti-kanindetekterings system, 1:200) i 30 min vid 37 ° c.
4. Tvätta bilderna 3x, varje gång i 5 min, med 0,01 M PBST i den roterande skakapparaten.
För att visualisera immunofärgning, tillsätt bilderna till 300 μL av färsk 3, 3-Diaminobenzidin och tvätta sedan glasen med kranvatten i rumstemperatur.
Anmärkning: graden av färgning övervakas i Mikroskop (förstoring 10X-40X).
Motfärga vävnaden. Färga diabilderna med hematoxylin färgning lösning för 2 min vid rumstemperatur och sedan tvätta bilderna med kranvatten i 15 min.
Obs: kärnan visas blått under mikroskopet (förstoring 10X-40X). Om graden av Blåfärgning är mer potent, kan saltsyra alkohol differentiering för 3-5 s användas, följt av sköljning vävnaden tillbaka till blått med kranvatten i 15 min för att underlätta den framträdande färgning av vävnaden.
Torka av bilderna i 5 min i 50% etanol, 5 min i 70% etanol, 2x i 80% etanol i 5 min, 5 min i 95% etanol, och slutligen, 2x för 5 min vardera i 100% etanol vid rumstemperatur.
För transparens, sänk vävnads sektionerna i en tank som innehåller 100% xylen i 15 min och överför sektionerna till en annan behållare som innehåller 100% xylen i 15 minuter vid rumstemperatur.
För tätning, ta 50-100 μL av neutralt tuggummi och tillsätt 5% xylen till blandningen (Undvik att blanda i bubblor). Tillsätt 15 μL av den ovan nämnda blandningen till lungvävnad sektionerna. Försegla filmen med täckglas och tryck försiktigt ut bubblorna.

2. automatisk hel-Slide skanning av IHC diabilder

Låt de förseglade glasen torka i 12 h vid rumstemperatur för att torkmedlet.
Välj alternativet ljust fält manuellt och ange det manuella skannings gränssnittet.
Ändra namnet på bilderna och välj en lagringssökväg för bilderna.
Ange skanningsområdet och välj alternativet Skanna exempel med hjälp av tröskelvärden för användar uppsättning. Tröskeln är ca 50 med en skanning område expansion värde av 200 μm.
Ange värdet för skannings fokus, Välj fokus automatiskt – det varierar från 1050 till 2650 – och välj slutligen enlagers läge.
Ladda IHC-bilderna på arbetsstationen och starta den automatiska skanningen.
Observera: se till att bilderna inte är skadade. Hålla bilderna rena och genomskinliga och undvika damm, konfetti och överskott tätningsmedel rester på bilderna. Glas rutschbana och täckslip bör sakna märken. Rengör inte glasen med xylen. Storleken på bilderna anges i tabell 1.
Automatiskt skanna hela vävnaden avsnitt på en bild med 20X, 40X, eller 100X förstoring.
Samla in och lagra bilderna i slutet av hela bilden skanning.

3. analys av bilder med bildprogram

Starta histopatologisk bildanalysprogram vara och välj lokal dator.
Öppna filen som lagrar skannings data.
Välj lämplig zoomnivå från intervallet 2X till 40X.
Justera färgen för att ställa in optimal kontrast via Växla färgjustering.
Manuellt cirkel och namnge de delar av intresse på varje bild.
Anmärkningar: till exempel kan du ringa ett område och namnge det som tumörområde.
Välj plugins och QC. Vid denna tid, scenario Builder dyker upp.
Välj densitet Quant och justera detekterings fältet.
Obs: denna process bör utföras noggrant. Den blå tolerans listen används för att justera cellkärnans färg. Stapeln med brun tolerans används för att justera mättnaden för fyllningsfärgen i bilden. Resultaten av bilderna efter justeringar bör överensstämma med de ursprungliga motsvarigheter.
Justera Poäng nivåerna för att göra färgintensiteten för de inringade områdena som liknar original avbildningarna.
Obs: mörkbrun indikerar stark positiv, brunaktig gul är måttligt positiv, ljusgul är svagt positiv, och vit är negativ.
Lagra och namnge modellen som en fil. Tillämpa modellen på andra bilder och välj markerad anteckning".
Låt programvaran automatiskt beräkna H-poängen för de inringade områdena i bilden.

4. kvantifiering av poängen med hjälp av H-poängsättnings systemet⁹^,¹⁰

Beräkna andelen immunofärgning och färgintensiteten (0: negativ, 1 +: svag, 2 +: måttlig, 3 +: stark).
Använd ett poängsystem (H-score) för att beräkna den patologiska scoring av tumören och angränsande nontumor områden.
Anmärkning: H-score = (% av celler med svag intensitet x 1) + (% av celler med måttlig intensitet x 2) + (% av celler med stark intensitet x 3). Därför är den maximala H-poängen 300 om 100% av cellerna kvantifieras med stark intensitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi mätte uttrycks nivåer av ZWINT i 28 par icke-småcellig lungcancer (NSCLC) prover (tumör och angränsande nontumörvävnader), inklusive 14 skivepitelcancer (SCCs) och 14 adenocarcinom (ADCs), av IHC. Hela bilden Digital skanning av bilderna som digitala bilder av hög kvalitet (figur 1a). Resultaten visade att H-poängen för lungcancern var signifikant högre än för angränsande icke-cancervävnader (P < 0,0001, tvåsidiga t-test) (figur 1a och 1b). Dessutom fann vi att uttrycksnivån för ZWINT i SCCs var signifikant högre än i ADCs (figur 1c).

Figur 1 : Immunohistokemisk färgning för lungcancer vävnader. Denna siffra har modifierats från Yuan et al. ⁵ med tillstånd från Dove press. (A) denna panel visar representativa immunohistokemiska bilder av lungcancerpatienter (förstoringar: 10X och 40x). (B) denna panel visar H-poängen för lungcancer och angränsande vävnader från icke-cancer. (C) denna panel visar H-poängen för ADCS och SCCS. Felstaplar indikerar standardavvikelse. * P < 0,05; P < 0,001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

	MIN (mm)	MAX (mm)
Bredd	25	26
Längd	75	76
Tjocklek	0,9	1,2

Tabell 1: bildstorlekar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hel bilds skanning blir ett hett ämne för sin robusta skanning och produktion av högkvalitativa bilder för kliniska och forskningsändamål¹¹^,¹²^,¹³. Bilder kan framställas med bild skanning Mikroskop inom minuter¹¹^,¹²^,¹³. Genom att tillämpa denna metod, fick vi högkvalitativa bilder för ZWINT IHC diabilder och jämförde H-Poäng mellan tumör och nontumörvävnader. I det protokoll som presenteras här, de mest kritiska stegen är utarbetandet av högkvalitativa IHC diabilder, bilden förvärvet, och specifikationen av tumören och nontumor områden innan den patologiska scoring¹³^,¹⁴ ^, ¹⁵ ^, ¹⁶.

Den nuvarande metoden har vissa fördelar jämfört med (CLM). Digital skanning är tillräckligt snabb (~ 20 bilder/timme) för att skanna en bunt med bilder och producera högkvalitativa digitala bilder. Det kan producera samstämmiga resultat med CLM men tar relativt mindre tid. Tillgängligheten av digitala bilder gör det möjligt att samma bild kan observeras samtidigt av flera personer. Digitala bilder av diabilder kan lagras i en databas, vilket innebär att den långsiktiga försämringen av glas rutschbanor undviks.

Begränsningarna av denna teknik inkluderar behovet av högkvalitativ vävnad och IHC diabilder⁶^,⁸^,¹¹ och teknisk expertis för att specificera tumören eller nontumörvävnadsprover innan analysen med hjälp av bildprogram , för att undvika förvirring om tumören eller nontumor områden under scoring⁶^,⁷. Operatören måste också övervaka färgåtergivningen under hela Digitaliseringsprocessen i hel bilds avbildning¹⁷.

Denna metod kan tillämpas aktivt i fisk, TMA, och Drug discovery och utveckling⁶^,¹⁸. Tabata et al. har undersökt användningen av WSI i primära patologiska diagnoser¹⁹. De analyserade retrospektivt 1070 WSI prover från nio sjukhus i Japan och bekräftade validering av användningen av WSI i primära diagnoser. En av de största fördelarna med WSI är att det tillåter samtidig visning av bilderna av flera studenter²⁰. Därför kan validering av hel bilds skanning bilder bidra till utvecklingen av digital diagnostik för utbildnings-och forskningsändamål⁶^,¹⁸^,²¹.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta projekt stöddes av Kinas National Natural Foundation (nr 81500151, 81400121, 81270607, 81541027 och 81501352) och den naturliga grunden för Hubei-provinsen (Kina) (nr 2017CFB631). Författarna uttrycker sin uppskattning till Guo Qin, Chang min, Li Hui, och deras kollegor på Wuhan Google Biological Technology Co, LTD för deras tekniska support. Författarna tackar också Muhammad Jamal för språk redigering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pannoramic MIDI	3D HISTECH	Cat: PMIDI-040709	An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more.
QuantCenter	3D HISTECH	Downloaded from the official website of the company	The framework for 3DHISTCH's image analysis applications.
LEICA RM2235	Leica Microsystems	Cat: 14050038604	The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation.
Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody	Abcam	Cat: ab197794	Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue.
Anti-rabbit secondary antibody	Wuhan Goodbio Technology	Cat:GB23303-1	Secondary antibody for IHC staining.
Phosphate-buffered saline	Wuhan Goodbio Technology	Cat:G0002	A solution containing a phosphate buffer.
OLYMPUS CX23	OLYMPUS	Cat:6M87620	Microscope for detection of H&E or IHC slides.
Dimethylbenzene	Shanghai Lingfeng Chemical Reagent	Cat:1330-20-7	A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study.
Hematoxylin Staining Solution	Wuhan Servicebio technology	Cat:G1039	It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue.
Tween 20	Baitg	Cat:2005-64-5	It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications.
Citric acid repair liquid	Wuhan Servicebio technology	Cat:G1202	Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure.
LEICA ASP200s	Leica	Cat: 14048043626	It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes.
LEICA Arcadia H	Leica	Cat: 14039354103	It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability.
LEICA Arcadia C	Leica	Cat: 14039354102	It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C.
CaseViewer Software	3DHISTECH