Summary
ZW10相互作用タンパク質(ZWINT)は、人工スピンドルチェックポイントおよび癌の病因に関与する。ここでは、ヒト肺癌組織におけるZWINTの免疫染色の方法論を紹介し、続いてスライド全体のデジタルスキャンと画像解析を行う。この方法論は、高品質のデジタル画像と信頼性の高い結果を提供することができます。
Abstract
本研究の目的は、ヒト肺組織の免疫染色の方法論を導入し、その後にスライド全体のデジタルスキャンと画像解析を行うことを目的とする。デジタルスキャンは、スライドのスタックをスキャンし、高品質でデジタル画像を生成するための迅速な方法です。それは病理学者によって従来の軽い顕微鏡ー(CLM)と一致した結果を作り出すことができる。さらに、デジタル画像の可用性により、同じスライドを複数の人が同時に観察することが可能になります。また、スライドのデジタル画像をデータベースに保存できるため、ガラススライドの長期的な劣化を回避できます。この手法の制限事項は次のとおりです。まず、それは良質の準備されたティッシュおよび元の免疫組織化学(IHC)の損傷または余分なシーラント残渣なしで滑る必要がある。第二に、腫瘍または非腫瘍領域は、スコアリング中に腫瘍または非腫瘍領域に関する混乱を避けるために、ソフトウェアを使用して分析する前に経験豊富な病理学者によって指定されるべきである。第三に、オペレータは、全スライドイメージングにおけるデジタル化プロセス全体の色再現を制御する必要があります。
Introduction
ZW10相互作用タンパク質(ZWINT)は、有糸性スピンドルチェックポイント1、2、3に関与するキネトコレ複合体の必要な成分である。ZWINTの枯渇は異常な早期染色体分離1、2、3につながることが報告されている。最近の研究は、ZWINTが腫瘍細胞4、5の増殖を促進することによって複数の腫瘍の病因に関与していることを示唆している。我々は以前に肺癌5におけるZWINTの過剰発現を報告した。CLMを用いる病理学者によるスライドの分析は時間がかかり、定量的な6、7、8ではないことが広く受け入れられている。また、保存されたガラススライドの劣化は、以前に作成したスライドを撤回することが不可能になる場合があります。コンピュータベースのデジタル全スライドイメージング(WSI)の新しい方法は、これらの制限を克服することができます 6,7,8.
この目的のために、ヒト肺癌組織におけるZWINTの免疫染色の方法論を、スライド全体のデジタルスキャンとソフトウェアベースの画像解析と組み合わせて説明する。この方法論の主な利点は、CLM との一致した結果の生産です。この技術は、ヘマトキシリン-エオシン染色(H&E)およびIHC、その場ハイブリダイゼーションにおける蛍光(FISH)、組織マイクロアレイ(TMA)、および創薬および開発の病理学的スコアリングの分野で広く使用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ここに記載されているすべての方法は、武漢大学の中南病院と武漢大学の人民病院の倫理委員会によって承認されています.
1. IHCスライドの作成
- リン酸緩衝生理食べ物(PBS)に4%のパラホルムアルデヒドにヒト肺組織断片(約3x3cm)を室温(RT)で24時間浸漬して肺組織サンプルを固定する。
- 80%、95%、100%エタノールを室温でそれぞれ15分、20分、20分間脱水します。最後に、室温でそれぞれ20分間、100%キシレン3xで組織を浸します。
- 埋め込みの場合は、30分間パラフィン(63°C)に組織を浸し、パラフィンを変更し、別の45分間組織を再び浸します。最後に、パラフィンをもう一度変更し、さらに1時間その中に組織を浸します。
- ロータリーマイクロトームを使用して、組織を5μmの厚さのセクションに切断し、20 μg/mLポリ-L-リジンコーティングされたスライドに置きます。
- 脱ワックスの場合は、スライドを65°Cのオーブンに2時間置き、その後、ジメチルベンゼンに15分間浸し、続いて100%キシレンに15分間浸します。
- 組織切片2xを100%エタノールで5分間水和し、続いて95%エタノールで5分、エタノールで5分、エタノールで5分、エタノールで5分、エタノールで5分、50%エタノールで5分を処理します。
- 抗原修復を行う。
- 二重蒸留H2O(ddH2 O)で1xに希釈クエン酸修復液(20x)。
- 組織切りと1xクエン酸修復液(300mL)を入れたスライドを抗原修復ボックスに入れ、電子レンジで2分間高温で加熱し、その後6分間沸騰を持続させるために低電力で加熱します。
- セクションを室温まで自然に冷やします。
- クエン酸修復液を0.01M PBSに交換し、セクション3xを洗浄し、5分間、室温でロータリーシェーカーで毎回洗浄する。
- 内因性ペルオキシダーゼを排除します。
- ddH2OでH2 O2~3%を30%希釈し、スライドに追加し(すべての組織を覆っていることを確認)、室温で30分間湿った箱にスライドをインキュベートします。
注:ウェットボックスは10 x 15 cmのプラスチック製の箱で、水を含むことができます。 - スライドを3倍、毎回5分間洗い、ロータリーシェーカーに0.01 M PBSを室温で入れます。
- ddH2OでH2 O2~3%を30%希釈し、スライドに追加し(すべての組織を覆っていることを確認)、室温で30分間湿った箱にスライドをインキュベートします。
- 非特異的抗原をブロックします。
- 濃縮された正常ヤギ血清を0.1%のトゥエン20(PBST)でPBSで10%ヤギ血清に希釈する。
- スライドに10%ヤギの血清を追加し、30分間37°Cの湿式箱にインキュベートします。
注:ヤギの血清はスライド内のすべての組織をカバーする必要があります。
- ティッシュを汚す。
- ウサギの抗ヒト抗ZWINT抗体(1:50)でスライドを一晩4°Cでインキュベートします。
- スライドを3倍、毎回5分間洗い、0.01 M PBST(1mLの1mLは0.1%の1mL PBS)で、室温でロータリーシェーカーで20枚を洗います。
- 2次抗体(抗ウサギ検出システム、1:200)でスライドを37°Cで30分間インキュベートします。
- スライドを3倍、毎回5分間、ロータリーシェーカーで0.01 M PBSTで洗います。
- 免疫染色を視覚化するには、新鮮な3,3-ジアミノベンジジンの300 μLにスライドを追加し、その後、室温で水道水でスライドを洗浄します。
注:染色の程度は顕微鏡(倍率10X-40X)の下で監視される。 - 組織を染色する室温で2分間ヘマトキシリン染色液でスライドを汚し、その後、水道水でスライドを15分間洗浄します。
注:核は顕微鏡下で青色に見えます(倍率10X- 40X)。青色染色の程度がより強力である場合は、3〜5sの塩酸アルコール分化を使用することができ、続いて、組織の顕著な染色を容易にするために15分間水道水で組織を青色にすすいで戻す。 - スライドを50%エタノールで5分間、70%エタノールで5分、80%エタノールで2倍、95%エタノールで5分、最後に室温で100%エタノールでそれぞれ2倍5分間脱水します。
- 透明性を高めるために、100%キシレンを含むタンクに組織切片を15分間浸し、室温で100%キシレンを含む別のタンクに切片を移します。
- シールの場合は、中性ガムの50~100μLを取り、混合物に5%のキシレンを加えます(気泡の混合を避けてください)。肺組織切片に上記混合物の15 μLを添加する。カバーガラスでフィルムを密封し、泡をそっと押し出します。
2. IHCスライドの自動全スライドスキャン
- 密閉されたスライドを室温で12時間乾燥させて乾燥させます。
- [明るい] フィールドを手動で選択し、手動スキャン インターフェイスを入力します。
- スライドの名前を変更し、イメージのストレージ パスを選択します。
- スキャン領域を設定し、ユーザー設定しきい値を使用してサンプルをスキャンするオプションを選択します。しきい値は約 50 で、スキャン領域の拡張値は 200 μm です。
- スキャンフォーカス値を設定し、フォーカスを自動的に選択し、1050から2650の範囲で、最後に単一レイヤーモードを選択します。
- ワークステーションに IHC スライドをロードし、自動スキャンを開始します。
注: スライドが破損していないことを確認します。スライドを清潔で半透明に保ち、スライド上のほこり、紙吹雪、余分なシーラント残渣を避けてください。ガラススライドとカバースリップは、マークを欠いている必要があります。シレンでスライドを掃除しないでください。スライドのサイズは表 1 に示されています。 - 20X、40X、または100X倍の倍率でスライド上の組織セクション全体を自動的にスキャンします。
- スライド全体のスキャンの最後に画像を収集して保存します。
3. イメージングソフトウェアによるスライドの解析
- 病理学的画像解析ソフトウェアを起動し、[ローカルコンピュータ] を選択します。
- スキャン データを格納するファイルを開きます。
- 範囲 2X から 40X までの適切なズーム レベルを選択します。
- 色を調整して、色調整を切り替えて最適なコントラストを設定します。
- 手動で円を描き、各画像の対象部分に名前を付けます。
注: たとえば、1 つの領域を丸で囲み、腫瘍領域として名前を付けることができます。 - プラグインとQCを選択します。この時点で、シナリオ ビルダーがポップアップします。
- [密度のクオント]を選択し、検出バーを調整します。
注: このプロセスは慎重に実行する必要があります。青色許容値のバーは、細胞核の色を調整するために使用されます。ブラウン許容値のバーは、画像内の塗りつぶし色の彩度を調整するために使用されます。調整後の画像の結果は、元の画像と一致している必要があります。 - スコアレベルを調整して、元の画像と同様の円で囲まれた領域の染色強度を作ります。
注:濃い茶色は強い正を示し、茶色がかった黄色は適度に正、薄黄色は弱く正、白は負である。 - モデルを格納し、ファイルとして名前を付けます。モデルを他のスライドに適用し、[選択したアニテーション]を選択します。
- ソフトウェアは、画像内の丸で囲まれた領域の H スコアを自動的に計算します。
4. Hスコアリングシステム9、10を用いたスコアの定量化
- 免疫染色のパーセンテージと染色強度(0:負、1+:弱い、2+:中等度、3+強)を計算します。
- スコアリングシステム(Hスコア)を使用して、腫瘍および隣接する非腫瘍領域の病理学的スコアリングを計算する。
注: H スコア = (強度が弱い細胞の% x 1) + (中程度の強度 x 2) + (強い強度 x 3 の細胞の%)したがって、細胞の100%が強い強度で定量される場合、最大Hスコアは300である。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZWINTの発現レベルは、14の扁平上皮癌(ScC)および14の腺癌(ADC)を含む28組の非小細胞肺癌(NSCLC)検体(腫瘍および隣接する非腫瘍組織)で、IHCによって測定された。スライドの全スライドデジタルスキャンは、高品質のデジタル画像を提供しました(図1A)。その結果、肺癌のHスコアは、隣接する非癌組織(P< 0.0001、両尾t-test)よりも有意に高かった(図1Aおよび1B)。 また、SCCにおけるZWINTの発現レベルは、ADCよりも有意に高いことがわかりました(図1C)。
図 1: 肺癌組織の免疫組織化学染色この数値は元らから変更されています。 5鳩プレスからの許可を受けて。(A) このパネルは、肺癌患者の代表的な免疫組織化学画像(倍率:10Xおよび40X)を示す。(B) このパネルは、肺癌および隣接する非癌組織のHスコアを示す。(C) このパネルには、ADC と SCC の H スコアが表示されます。誤差余数は標準偏差を示します。* P < 0.05;P < 0.001.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ミリメートル(ミリメートル) | 最大値 (mm) | |
| 幅 | 25名 | 26歳 |
| 長さ | 75歳 | 76歳 |
| 厚さ | 0.9年 | 1.2年 |
表 1: スライド サイズ。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
全体スライドスキャンは、臨床および研究目的のためのその堅牢なスキャンと高品質の画像の生産のためのホットな話題になりつつあります11,12,13.画像は分11、12、13の分以内にスライドスキャン顕微鏡によって作り出すことができる。この方法論を応用することで、ZWINT IHCスライド用の高品質な画像を得て、腫瘍組織と非腫瘍組織のHスコアを比較した。ここで提示されるプロトコルでは、最も重要なステップは、高品質のIHCスライドの調製、画像取得、および病理学的スコアリング13、14の前の腫瘍および非腫瘍領域の指定である,15歳,16.
現在の方法には(CLM)と比較していくつかの利点があります。デジタルスキャンは、スライドのスタックをスキャンし、高品質のデジタル画像を生成するのに十分な速さ(〜20スライド/時間)です。CLM と一致した結果を生成できますが、比較的時間がかかります。デジタル画像の可用性により、同じスライドを複数の人が同時に観察することが可能になります。スライドのデジタル画像は、データベースに保存することができ、ガラススライドの長期的な劣化が回避されることを意味します。
この技術の限界は、高品質の組織とIHCスライド6、8、11および画像ソフトウェアを使用して分析する前に腫瘍または非腫瘍組織サンプルを指定するための技術的専門知識の必要性を含む、スコアリング6、7の間に腫瘍または非腫瘍領域に関する混乱を避けるために。オペレータはまた、全スライドイメージング17のデジタル化プロセス全体を通して色再現を監視する必要があります。
この方法は、FISH、TMA、および創薬および創薬開発6、18に積極的に適用することができる。田畑らは、一次病理学的診断におけるWSIの使用を調査した 19. 国内9病院から1070検体を遡及的に分析し、一次診断におけるWSIの使用の検証を確認した。WSI の主な利点の 1 つは、複数の学生によるスライドの同時表示が可能である20.したがって、スライド全体のスキャン画像の検証は、教育研究目的のためのデジタル診断の開発に寄与する可能性があります 6,18,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
このプロジェクトは、中国国家自然財団(No. 81500151、81400121、81270607、81541027、81501352)と湖北省自然財団(2017CFB631号)によって支援されました。著者らは、グオ・チン、チャン・ミン、李ホイ、武漢グーグル・バイオリティ・テクノロジー社の同僚たちに対し、技術サポートに感謝の意を表明した。著者はまた、言語編集のためのムハンマド・ジャマールに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pannoramic MIDI | 3D HISTECH | Cat: PMIDI-040709 | An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more. |
| QuantCenter | 3D HISTECH | Downloaded from the official website of the company | The framework for 3DHISTCH's image analysis applications. |
| LEICA RM2235 | Leica Microsystems | Cat: 14050038604 | The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation. |
| Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody | Abcam | Cat: ab197794 | Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue. |
| Anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Goodbio Technology | Cat:GB23303-1 | Secondary antibody for IHC staining. |
| Phosphate-buffered saline | Wuhan Goodbio Technology | Cat:G0002 | A solution containing a phosphate buffer. |
| OLYMPUS CX23 | OLYMPUS | Cat:6M87620 | Microscope for detection of H&E or IHC slides. |
| Dimethylbenzene | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent | Cat:1330-20-7 | A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study. |
| Hematoxylin Staining Solution | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1039 | It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue. |
| Tween 20 | Baitg | Cat:2005-64-5 | It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications. |
| Citric acid repair liquid | Wuhan Servicebio technology | Cat:G1202 | Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure. |
| LEICA ASP200s | Leica | Cat: 14048043626 | It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes. |
| LEICA Arcadia H | Leica | Cat: 14039354103 | It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability. |
| LEICA Arcadia C | Leica | Cat: 14039354102 | It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C. |
| CaseViewer Software | 3DHISTECH |
References
- Endo, H., Ikeda, K., Urano, T., Horie-Inoue, K., Inoue, S. Terf/TRIM17 stimulates degradation of kinetochore protein ZWINT and regulates cell proliferation. The Journal of Biochemistry. 151 (2), 139-144 (2012).
- Wang, H., et al. Human Zwint-1 specifies localization of Zeste White 10 to kinetochores and is essential for mitotic checkpoint signaling. Journal of Biological Chemistry. 279 (52), 54590-54598 (2004).
- Lin, Y. T., Chen, Y., Wu, G., Lee, W. H. Hec1 sequentially recruits Zwint-1 and ZW10 to kinetochores for faithful chromosome segregation and spindle checkpoint control. Oncogene. 25 (52), 6901-6914 (2006).
- Ying, H., et al. Overexpression of Zwint predicts poor prognosis and promotes the proliferation of hepatocellular carcinoma by regulating cell-cycle-related proteins. OncoTargets and Therapy. 11, 689-702 (2018).
- Yuan, W., et al. Bioinformatic analysis of prognostic value of ZW10 interacting protein in lung cancer. OncoTargets and Therapy. 11, 1683-1695 (2018).
- Higgins, C. Applications and challenges of digital pathology and whole slide imaging. Biotechnic & Histochemistry. 90 (5), 341-347 (2015).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
- Al-Janabi, S., Huisman, A., van Diest, P. J. Digital pathology: current status and future perspectives. Histopathology. 61 (1), 1-9 (2012).
- Bonomi, P. D., et al. Predictive biomarkers for response to EGFR-directed monoclonal antibodies for advanced squamous cell lung cancer. Annals of Oncology. 29 (8), 1701-1709 (2018).
- Villalobos, M., et al. ERCC1 assessment in upfront treatment with and without cisplatin-based chemotherapy in stage IIIB/IV non-squamous non-small cell. Medical Oncology. 35 (7), 106 (2018).
- Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).
- Huisman, A., Looijen, A., van den Brink, S. M., van Diest, P. J. Creation of a fully digital pathology slide archive by high-volume tissue slide scanning. Human Pathology. 41 (5), 751-775 (2010).
- Gray, A., Wright, A., Jackson, P., Hale, M., Treanor, D. Quantification of histochemical stains using whole slide imaging: development of a method and demonstration of its usefulness in laboratory quality control. Journal of Clinical Pathology. 68 (3), 192-199 (2015).
- Hofman, F. M., Taylor, C. R.
- Ramos-Vara, J. A.
- Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D. K., Grizzle, W. E. A standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotechnic & Histochemistry. 91 (5), 309-326 (2016).
- Clarke, E. L., Treanor, D. Colour in digital pathology: a review. Histopathology. 70 (2), 153-163 (2017).
- Potts, S. J. Digital pathology in drug discovery and development: multisite integration. Drug Discovery Today. 14 (19-20), 935-941 (2009).
- Tabata, K., et al. Whole-slide imaging at primary pathological diagnosis: Validation of whole-slide imaging-based primary pathological diagnosis at twelve Japanese academic institutes. Pathology International. 67 (11), 547-554 (2017).
- Saco, A., Bombi, J. A., Garcia, A., Ramírez, J., Ordi, J. Current Status of Whole-Slide Imaging in Education. Pathobiology. 83 (2-3), 79-88 (2016).
- Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).
