Summary
Aquí proporcionamos un protocolo que incluye instrucciones completa para el establecimiento económico de murino objeto ubicación y objeto novedoso reconocimiento pruebas de comportamiento, incluyendo el diseño, costo y construcción de equipo necesario así como ejecución de pruebas de comportamiento, recolección de datos y análisis.
Abstract
Pruebas de comportamiento etológico relevante son un componente crítico de cualquier estudio que utiliza modelos de ratón para el estudio de los efectos cognitivos de diversos cambios fisiológicos o patológicos. La tarea de ubicación de objeto (OLT) y la tarea de reconocimiento de objeto nuevo (norte) son dos tareas conductuales eficaces utilizadas para revelar la función y la salud relativa de regiones específicas del cerebro implicadas en la memoria. Mientras que ambas de estas pruebas explotan la preferencia inherente de ratones por la novedad revelar previamente memoria para encontraron objetos, el OLT principalmente evalúa aprendizaje espacial, que depende en gran medida actividad hipocampal. El norte, en cambio, evalúa aprendizaje no espacial de identidad de objeto, que se basa en múltiples regiones del cerebro. Ambas tareas requieren de un escenario de pruebas de campo abierto, objetos de valor intrínseco equivalente a ratones, señales ambientales adecuados y equipos de grabación de vídeo y el software. Sistemas disponibles comercialmente, aunque conveniente, pueden ser costoso. Este manuscrito detalla un método simple y rentable para la creación de las arenas y configurar el equipo necesario para realizar la OLT y NORT. Además, el manuscrito describe un protocolo de pruebas eficiente que incorpora OLT y NORT y proporciona métodos típicos para adquisición de datos y análisis, así como resultados representativos. Superación de estas pruebas puede proporcionar información valiosa sobre la función de memoria de varios sistemas del modelo de ratón y valora las regiones neuronales subyacentes que apoyan estas funciones.
Introduction
Las pruebas cognitivas eficaces aislar y evaluación la función neuronal de las regiones específicas del cerebro mediante el examen de comportamiento en un ambiente controlado1. En los seres humanos, tareas específicas han sido diseñadas para evaluar el rendimiento de regiones específicas del cerebro, como la tarjeta Wisconsin que clasifica tarea para la función prefrontal o los pares asociados aprendizaje prueba de la Cambridge Test automatizado batería neuropsicológica ( CANTAB) para función hippocampal2,3. Estas pruebas están diseñadas para el estudio de las funciones de las regiones específicas del cerebro en los seres humanos mediante la evaluación de conductas que resultan de la actividad neuronal de las regiones. El objetivo final de la investigación biomédica más es la mejora de la salud humana; sin embargo, muchos estudios de la función cerebral en salud o enfermedad no pueden realizarse éticamente con participantes humanos. Para estudios que no pueden utilizar a los participantes humanos, pequeños roedores como ratones son a menudo el modelo de elección. Usando modelos de ratón permite el control directo sobre las manipulaciones experimentales incluyendo alteración de la expresión génica, inducción de lesiones o incluso modulación de la actividad del circuito a través de técnicas de optogenetic. Pruebas de comportamiento de los ratones, similares a pruebas humanas, tiene como objetivo evaluar el efecto de variables experimentales sobre la función cerebral mediante la medición de comportamientos que dependen de regiones específicas.
El hipocampo es una estructura esencial para la formación de la memoria en humanos y roedores4. Más específicamente, el hipocampo desempeña un papel crítico en la memoria declarativa, que implica las representaciones relacionales, pero memoria no procedimental, que se basa en los centros motores del cerebro4. Función de memoria hipocampal ha sido un foco de estudio a través de muchos campos de la neurociencia porque es exquisitamente sensible a la perturbación. Perturbaciones negativas que van desde el estrés prolongado y el envejecimiento a las convulsiones y los accidentes cerebrovasculares se asocian con daño hippocampal5. En cambio, intervenciones positivas, tales como interacción social, enriquecimiento ambiental física o ejercicio, mejoran la función hippocampal6,7,8. Estudios de roedores con la prueba de la memoria de hippocampal pueden revelar la visión de los mediadores celulares y moleculares de la memoria, así como los efectos de diferentes intervenciones ambientales en la función hippocampal.
En roedores, se han desarrollado varias pruebas para estudiar el aprendizaje dependiente del hipocampo y la memoria9,10,11. Puede ser ampliamente subdivididas en tareas que requieren un estímulo con Valencia emocional para provocar un cambio en el comportamiento y las tareas que se basan en la preferencia de roedor para investigar nuevos estímulos11. Condicionamiento de miedo contextual, por ejemplo, pares de un estímulo desagradable (choque de pie) con un contexto ambiental y, más tarde pruebas de memoria para el contexto mediante la medición de miedo inducido congelación comportamiento9,11. El laberinto acuático de Morris y su contraparte seco, el laberinto de Barnes, utilizan Refuerzos externos negativos para promover aprendizaje espacial4,11. En cada caso, roedores buscan escapar de una situación aversiva, se sumerge en agua fría o expuestos sobre una plataforma luminosa, respectivamente. El laberinto radial del brazo, en cambio, se basa en refuerzo positivo como animales utilizan el comportamiento natural de alimentación juntado con la memoria espacial para recuperar pequeñas recompensas4,11. Estas tareas son ampliamente utilizadas y han aportado conocimientos fundamentales acerca de la memoria de hippocampal. Sin embargo, negativos y positivos de refuerzos externos o estímulos inductores de miedo como descarga añadir un componente emocional a estos comportamiento prueba que en algunos casos pueden ser indeseables. Por ejemplo, el hipocampo dorsal y ventral está asociado con distintas funciones, memoria espacial y regulación emocional, respectivamente12. Pruebas que dependen de una respuesta emocional a los estímulos no pueden reflejar exactamente deteriorada memoria espacial si las funciones de regulación emocional hipocampo ventral también se ven afectadas.
La OLT es un examen simple y eficaz que proporciona una medida de memoria espacial dependiente del hipocampo13. La tarea se basa en preferencia intrínseca de un animal por la novedad sin refuerzo externo adicional y por lo tanto, normalmente puede evitar las complicaciones asociadas con respuestas emocionales diferencial13. El presente Protocolo para OLT se presenta para los ratones, pero también es eficaz en las ratas si las dimensiones del equipo son escaladas apropiadamente. El protocolo consiste en aclimate un ratón a un escenario de pruebas de campo abierto y luego lo que le permite investigar 2 objetos en lo referente a señales ambientales espaciales. El ratón se retira luego de la arena, y durante un retraso (intervalo entre ensayo o ITI), uno de los objetos se mueve. Después del ITI, el ratón es había reintroducido a la arena y permitió explorar libremente. En general, ratones prefieren la novedad, y si recuerda la ubicación de los objetos de su exposición inicial, van a pasar más tiempo investigando el objeto movido. Animales con lesiones hipocampales han deteriorado aprendizaje contextual espacial y por lo tanto no demuestran ninguna preferencia por objetos en la nueva ubicación14,15.
El OLT puede utilizarse independientemente o en combinación con una prueba adicional de la memoria que se basa en la actividad de los nervios de varias regiones del cerebro, la tarea de reconocimiento de objeto nuevo (norte). El norte es idéntica a la OLT hasta la fase de prueba, cuando uno de los objetos es reemplazado por un objeto novedoso en lugar de moverlo a una nueva ubicación. Como es el caso de la OLT, ratones con buena memoria de los objetos espontáneamente prefieren investigar el objeto nuevo. En contraste con memoria de ubicación de objeto, que depende en gran medida sustratos hipocampales, memoria de reconocimiento de objetos parece depender de una variedad de regiones del cerebro y la implicación del hipocampo es sin resolver. Muchos estudios reportan que las lesiones hipocampales o inactivación no afecta novela objeto preferencia10,13,16,17, mientras que otros encuentran el opuesto de18,19. Sin embargo, sigue siendo una tarea comúnmente utilizada para evaluar la función de memoria general en roedores.
El protocolo presentado aquí delinea los pasos necesarios para iniciar y ejecutar la OLT y NORT, que utilizan un escenario de pruebas de campo abierto. Equipo de prueba de comportamiento disponible comercialmente puede ser prohibitiva, especialmente para los laboratorios más pequeños. Este protocolo incluye el diseño y pasos sencillos para construir arenas internos con un costo mínimo y sin necesidad de herramientas especializadas. Además, este protocolo detalla el área de pruebas de comportamiento ideal, incluyendo colocación de arenas, claves contextuales y grabación de vídeo que fija la etapa para la implementación de los protocolos OLT y NORT. Se presentan resultados representativos para estudios acertados como erróneos, haciendo hincapié en la importancia de la optimización de todos los materiales y procedimientos de cada estudio.
| Descripción | Opción | Cantidad |
| Parte A: la hoja de acrílico - blanco opaco (0,635 cm x 40 cm x 40.64 cm) | Bordes de enrutado | 2 |
| Parte B: hoja de acrílico - blanco opaco (0,635 cm x 40 cm x 41.91 cm) | Bordes de enrutado | 2 |
| Parte C: hoja de acrílico - blanco opaco (0,635 x 41,91 cm x 41.91 cm) | Bordes de enrutado | 1 |
| Cemento acrílico (1 pt.) | NA | 1 |
| Aplicador de Hypo calibre 16 | NA | 1 |
| Escuadra de combinación | NA | 1 |
| Webcam HD | NA | 1 |
| Software de captura de vídeo | NA | 1 |
| USB 2.0 Cable de extensión | NA | 1 |
| Conducto del cable | NA | 1 |
Tabla 1: Lista detallada de materiales y equipos necesarios para las pruebas de comportamiento.
Protocol
El siguiente protocolo ha sido aprobado por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en la Universidad Estatal de Ohio (OSU).
1. edificio las Arenas
- Los materiales descritos en la tabla 1de la orden: cinco hojas de acrílico, cemento acrílico y 16 G hypo del aplicador.
- Use equipo de seguridad apropiado según las instrucciones del fabricante, que pueden incluir ojos, piel y otros tipos de protección.
- Retire el recubrimiento del papel protector de las hojas de acrílico.
- Dry fit todos los materiales para confirmar que los tamaños son correctos (figura 1A).
- Montar y cargar la jeringa con cemento acrílico.
- Alinee el borde largo de una pared exterior (parte B) con un borde superior de la base (parte C) y asegurarse de que son perpendiculares entre sí utilizando un cuadrado de combinación o maquinista.
- Usando la jeringa, aplique una gota pequeña y constante de cemento directamente a la esquina de las dos piezas se.
- Mantener las dos piezas (partes B y C) en lugar hasta que se fijaron inicialmente (aproximadamente 5 min).
Nota: Por lo general, serán 80% templado en 24 h, pero Asamblea puede continuar después de 5 minutos. - Repita los pasos 1.5 – 1.7 con la otra pared exterior (parte B) en la misma base.
- Coloque las dos paredes internas (parte A), uno a la vez, en la base de pasos 1.5 – 1.7.
- Además, utilice la jeringa para aplicar un pequeño y constante grano de cemento directamente a la esquina ahora está formada por la pared exterior (parte B) y el interior de la pared (parte A).
- Mantener estas piezas en su lugar por 5 minutos.
- Después de 24 – 48 horas, proceda a configurar el entorno de análisis conductual.
2. configurar el entorno de pruebas de comportamiento y equipo
- Coloque señales ambientales (como se describe en la sección discusión) frente a la unos a otros y frente a las arenas en el área de pruebas (figura 1B).
- Organizar las cuatro arenas prueba en forma de 2 por 2 en el piso o mesa resistente a distancias adecuadas de las señales y la cámara para maximizar la entrada visual a los ratones (figura 1B).
- Verifique la línea de visión con un palito de metro apoyado de cada piso de la arena sobre la pared hacia las señales para confirmar que estas distancias entre las arenas y las señales son adecuadas.
- Determinar la longitud del camino óptico óptimo que permite la documentación de todos cuatro arenas ajustando la altura de la cámara o la altura de la mesa. (Figura 1B).
- Conecte la cámara a un Cable de extensión USB.
- Con canales de cable, pase el cable en el techo y hacia abajo de una pared a un equipo que ejecuta video software de captura.
- Ocultar el ordenador detrás de una cortina que se separa los ratones en el área de pruebas del investigador (figura 1).
- Montar 4 de al menos 3 objetos diferentes que son aproximadamente de 2 a 5 cm en longitud y anchura y de hasta 10 cm de altura a utilizar para la prueba (figura 1).
Figura 1: comportamiento preparación prueba. (A) abrir-campo-pruebas de montaje de arena con la parte A correspondiente a la pared interna, B como la pared exterior y C como la base. El acabado arena tendrá dos paredes exteriores (piezas B) que se ejecutan todo el filo de la base y dos muros interiores (partes A) que entre las paredes exteriores en los bordes adyacentes de la base (parte C). Todas las paredes descansará sobre la base. (B) arreglo representante de arenas en una mesa alta de 0,62 m, señales ambientales 60 x 90 cm, luces y una cámara para un área de pruebas que permite la captura de los cuatro arenas simultáneamente. (C) A la cortina oculta del experimentador y del sistema de los ratones durante los ensayos. Las luces de arriba están en los fines de tomar esta fotografía, pero durante la prueba, solamente las lámparas de pie son en. Además, una de las señales ambientales se ha eliminado esta fotografía de la zona de pruebas, pero durante la prueba, hay una pista cuarto delante de las arenas, frente a la señal todos negra detrás de la mesa. Objeto representante (D) A (y la regla de escala) es apropiado para OLT o NORT pruebas con ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Validar estos objetos.
- Obtener un mínimo de 8 ratones de tipo salvaje en el sexo, cepa y edad Grupo representante de los ratones experimentales que se utilizarán (e.g., 6 a 9 semanas de edad hembra y macho C57Bl/6 ratones).
- Manejar todos los ratones diariamente durante 1 min en el transcurso de 3 – 5 días antes de la prueba.
- Ratones se dividen en grupos de 4 y, si no están ya solos alojados, muévalos a persona limpia con jaulas.
- Poner en el cuarto de prueba y que puedan aclimatarse al menos 30 minutos.
Nota: Presencia del experimentador en la sala durante estos 30 minutos reduce el estrés sobre los ratones durante la tarea, particularmente si el experimentador es hombre20. - Después se realiza la aclimatación y el experimentador está listo para comenzar, comenzar a grabar el video.
- Coloque cada ratón frente a las paredes de una esquina de la arena (llamada la esquina del lanzamiento) (figura 2A).
- Permitir que los ratones explorar las arenas libremente durante 10 minutos.
- Detener la grabación del video.
- Volver ratones a sus jaulas de tenencia limpio para una duración de 20 minutos.
- Limpia todas las arenas con Animalario de limpieza recomiendan métodos, tales como limpiar con etanol al 70% para reducir señales olfativas antes del próximo uso.
- Usando cinta de doble cara, Coloque 2 objetos diferentes cerca de 2 esquinas de no liberación tal que los objetos se contrabalancean en la arena y 6 x 6 cm2 de cada pared de la esquina (figura 2B).
- Empezar a grabar el video.
- Coloque cada ratón frente a los muros en el ángulo de lanzamiento.
- Permiten ratones investigar la arena y objetos libremente durante 10 minutos.
- Detener la grabación del video.
- Ratones del lugar de nuevo en sus jaulas de tenencia limpio para una duración de 20 minutos.
- Limpia todas las arenas y objetos con Animalario de limpieza recomiendan métodos tales como limpiar con etanol al 70% para reducir señales olfativas.
- Repetir los ensayos de entrenamiento con 2 nuevos objetos fijados en los mismos lugares hasta que todos los objetos (al menos tres objetos diferentes si realización de OLT y norte) han sido probados con cada ratón.
- Excluir los objetos que permiten ratones a sentarse en la parte superior del objeto.
- Analizar el tiempo de investigación de cada ratón con cada objeto según el paso 4.
- Excluir los objetos que tienen un valor intrínseco negativo o positivo.
3. realización de la prueba de comportamiento
- Una semana antes de la prueba: familiarización a personas que realizan las pruebas de comportamiento
- Manejar adultos 6 a 9 semanas de edad hembras y machos C57Bl/6 ratones diariamente durante 1 min en el transcurso de 3 – 5 días antes de la prueba.
- Día 1: sesiones de habituación
- Ratones se dividen en grupos de 4 y, si no están ya solos alojados, muévalos a persona limpia con jaulas.
- Traerlos a la sala de pruebas y que puedan aclimatarse a la sala de pruebas durante al menos 30 minutos.
Nota: presencia del experimentador en la sala durante estos 30 minutos reduce el estrés sobre los ratones durante la tarea, particularmente si el experimentador es hombre20.
- Después se realiza la aclimatación y el experimentador está listo para comenzar, comenzar a grabar el video.
- Coloque cada ratón en la arena (un ratón por arena) frente a las paredes de la esquina de la liberación (figura 2A).
- Permitir que los ratones explorar las arenas libremente durante 6 minutos.
- Detener la grabación del video.
- Volver ratones a sus jaulas limpias de explotación durante el intervalo entre ensayo (ITI).
- Limpia todas las arenas con Animalario de limpieza recomiendan métodos tales como limpiar con etanol al 70% para reducir señales olfativas.
- Repita los pasos 3.3-3.9 dos veces más para un total de 3 sesiones de habituación para cada ratón.
- Devolver todos los ratones a sus jaulas hogar.
- Limpia todas las arenas con Animalario de limpieza recomiendan métodos tales como limpiar con etanol al 70% para reducir señales olfativas antes de usarlo al día siguiente.
- : 2 entrenamiento dias, OLT, NORT
Nota: El norte es una prueba opcional.- Después de 24 h, hacer el mismo grupo de ratones en el cuarto de prueba y que puedan aclimatarse a la sala de pruebas durante al menos 30 minutos como hizo antes de las sesiones de habituación el día anterior.
- Realizar un ensayo de formación de 2 objetos colocados en la arena (figura 2B).
- Usando cinta de doble cara, fijar objetos 6 x 6 cm2 de 2 esquinas de no liberación tal que se contrabalancean en la arena.
- Empezar a grabar el video.
- Coloque cada ratón frente a las paredes de la esquina de liberación como hecho durante las sesiones de habituación.
- Permiten ratones investigar la arena y objetos libremente durante 10 minutos.
- Detener la grabación del video.
- Ratones de lugar volver en sus jaulas de tenencia limpio un ITI de 20 minutos.
- Limpia todas las arenas y objetos con Animalario de limpieza recomiendan métodos tales como limpiar con etanol al 70% para reducir señales olfativas.
- Realizar la OLT.
- Mueve uno de los objetos utilizados en la formación de la prueba a un nuevo rincón de no liberación y fije el objeto de 6 cm de cada pared de la esquina con cinta de doble cara (figura 2).
Nota: El objeto debe permanecer donde estaba durante el entrenamiento de la prueba. - Empezar a grabar el video.
- Coloque cada ratón frente a los muros en el ángulo de lanzamiento.
- Permiten ratones investigar los objetos durante 10 minutos.
- Detener la grabación del video.
- Ratones de lugar volver en sus jaulas de tenencia limpio un ITI de 20 minutos.
- Limpia todas las arenas y objetos con Animalario de limpieza recomiendan métodos tales como limpiar con etanol al 70% para reducir señales olfativas.
- Mueve uno de los objetos utilizados en la formación de la prueba a un nuevo rincón de no liberación y fije el objeto de 6 cm de cada pared de la esquina con cinta de doble cara (figura 2).
- Realizar el NORT.
- Vuelva a colocar el objeto que no se ha movido durante la OLT con un objeto novedoso y fijar el nuevo objeto 6 cm de las dos paredes de la esquina con cinta de doble cara (Figura 2D).
- Empezar a grabar el video.
- Coloque cada ratón frente a los muros en el ángulo de lanzamiento.
- Permiten ratones investigar los objetos durante 10 minutos.
- Detener la grabación del video.
- Volver a colocar ratones en sus jaulas hogar.
- Limpia todas las arenas y objetos con Animalario de limpieza recomiendan métodos tales como limpiar con etanol al 70% para reducir señales olfativas antes de usarlo.
Figura 2: configuración de Arena ensayos. Campo abierto (A) pruebas de arena sin objetos para sesiones de habituación. La flecha negra indica un lanzamiento de esquina. Este rincón debe ser la misma posición relativa en cada arena y ser constante para cada ratón sometido a prueba y para cada prueba. (B) para el ensayo de formación, dos objetos distintos están asegurados a campo abierto en 6 x 6 cm de los muros respectivos. (C) de la OLT, un objeto se mueve a una nueva ubicación, también de 6 x 6 cm de las paredes y no la liberación. (D) para el norte, el objeto que se fija en la OLT se sustituye por un objeto nuevo, mientras el objeto movido desde la OLT es ahora el objeto familiar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Análisis de los datos de prueba de comportamiento
Nota: Análisis de vídeo idealmente deben ser completada por al menos dos experimentadores independientes.
- Abra el archivo de vídeo.
- Aplique un círculo transparente que proporciona un borde de 2 cm alrededor de cada objeto sobre la pantalla para ayudar a determinar la investigación activa. Utilizar una imagen de archivo de vídeo con una regla colocada en una arena para calibrar esta rejilla.
- Observar comportamiento del ratón y registrar los tiempos en que el ratón está investigando activamente el objeto, que consiste en su nariz apuntada hacia el objeto a una distancia máxima de 2 cm de ese objeto.
- Registro de la marca de tiempo del ratón comienza a investigar un objeto y la marca de tiempo cuando deje de investigar ese objeto.
- Repetir este proceso para ambos objetos en la arena para la duración de la prueba.
- Calcular el tiempo acumulado que el ratón investiga cada objeto restando la hora de salida desde el tiempo de parada para cada instancia de investigación del objeto, y añadiendo todos esos valores.
- Calcular el por ciento del tiempo total de la investigación o el índice de discriminación con las siguientes fórmulas:
- Calcular el por ciento del tiempo total de la investigación =
Nota: Un valor superior al 50% indica una mayor investigación de la nueva ubicación u objeto. - Calcular el índice de discriminación =
Nota: Un valor positivo indica más tiempo investigando el nuevo objeto. Un índice de discriminación de cero indica el tiempo igual con ambos objetos.
- Calcular el por ciento del tiempo total de la investigación =
- Representar gráficamente los resultados y análisis estadísticos completos utilizando una prueba t o ANOVA como apropiado para el número de grupos que se comparan.
Representative Results
La figura 3 muestra ejemplos de resultados positivos y negativos típicos obtenidos con machos y hembras adultos ratones C57Bl/6 usando este protocolo6. Interpretación de datos OLT y NORT siempre se aplica a los datos agregados de un grupo (ver discusión más abajo). Tiempo de investigación para un ratón no puede interpretarse como la memoria o falta de memoria. Sin embargo, el rendimiento de un grupo de ratones (i.e., las muestras múltiples) puede ser comparado a otros grupos o a los niveles de oportunidad fija mediante pruebas estadísticas. Durante un ensayo de entrenamiento típico, grupos de ratones no muestran una preferencia significativa en promedio para cualquiera de los objetos ya que son ambos igualmente novedosos y no tienen ningún valor intrínsecamente positiva o negativa a los ratones (Figura 3A y 3B). Si los datos agregados de un grupo de ratones muestran gran preferencia por un objeto sobre otro durante el entrenamiento, estos objetos no puede usarse porque esa preferencia/aversión inherente a confundir resultados en los ensayos posteriores. Además, el tiempo total de la investigación de todos los ratones debe cumplir con un estándar mínimo (tradicionalmente establecido en 20 segundos21) y deben ser comparados para asegurar que no hay diferencias de base en investigación que puede afectar a posteriores pruebas de memoria.
Durante la OLT, memoria para la ubicación del objeto se refleja en ratones gastando en promedio significativamente más del 50% del tiempo total de la investigación con el objeto movido (Figura 3A). Si los tiempos de investigación total de los ratones individuales varían mucho, los resultados son mejor representados como un índice de discriminación de los objetos (figura 3B). El aumento significativo en el índice de discriminación promedio en la figura 3B indica que los ratones pasaron más tiempo con el objeto después de que se había movido. Tanto si se mide por el aumento en el tiempo porcentaje o índice de discriminación, el aumento en la investigación del objeto después de se sugiere que los ratones recuerdan donde estaba situado el objeto durante el entrenamiento.
El último juicio de este protocolo evalúa memoria de reconocimiento de objeto. Un ejemplo representativo con un grupo de ratones muestra un mayor porcentaje promedio de tiempo de investigación (figura 3) así como el índice de discriminación positiva (figura 3D) en comparación con los valores de control fijo de 50% y 0, respectivamente. Como con los datos de la OLT, si existe importante variabilidad en el tiempo de investigación total entre ratones individuales, el índice de discriminación es probablemente el mejor método para visualizar estos datos. Figura 3E muestra un ejemplo de una comparación de 2 grupos en el norte y algunas de las estadísticas complicaciones que pueden surgir en estas pruebas (ver discusión). Mientras que un one-sample t-test para el grupo B muestra investigación significativamente por encima del 50%, la misma prueba para el grupo A no. Este hallazgo no significa que A y B son diferentes unos de otros. Para determinar las diferencias de grupo, debe realizarse una separado dos muestras prueba no paramétrica Mann-Whitney comparar grupos B a la A. Una prueba no paramétrica de Mann-Whitney de dos muestras de datos de este grupo representativo no muestra ninguna diferencia significativa (p = 0,66) entre los dos grupos en porcentaje de tiempo de investigación del nuevo objeto.
Tanto el OLT y el norte son muy sensibles al valor intrínseco de los objetos y realizar pruebas minuciosas de la equivalencia del objeto son necesario para asegurar que no hay ningún sesgo intrínseco que puede confundir los resultados. Figura 3F y 3 G muestran un ejemplo de selección de objeto inadecuado. En una prueba piloto con una muestra de tamaño de 4, los ratones mostraron una tendencia a gastar menos del 50% del tiempo de investigación con objeto de A cuando emparejado contra el objeto B (figura 3F). Cuando estos objetos fueron utilizados luego en NORT con objeto A como el objeto novedoso y un tamaño de muestra más grande de 16, ratones pasaron significativamente menos del 50% del tiempo de investigación con el objeto A (figura 3). Esta aversión hacia el objeto nuevo es fácilmente reconocible como un defecto técnico en el experimento y ejemplifica por qué pruebas piloto de los objetos de preferencia/aversión inherente son esencial.
Figura 3: comportamiento datos de prueba con ratones C57Bl/6 adultos de tipo salvaje. (A) comparación de tiempo de investigación total porcentaje del objeto movido durante el entrenamiento de prueba versus el OLT demuestra aumento significativo de investigación, después de que el objeto se movió. p < 0.0001, prueba de t pareada. (B) resultados representativos para la investigación del objeto movido durante el entrenamiento y ensayos de OLT aparece como un índice de discriminación del mismo modo muestran un aumento significativo en la investigación del objeto después de que se mueva. p < 0.0001, prueba de t pareada. (C) tiempo de investigación total porcentaje del nuevo objeto en el norte muestra preferencia significativa para investigar el objeto nuevo. ** p = 0.0024, one-sample t-test vs. el 50%. (D) resultados representativos para la investigación de objeto nuevo en el norte aparece como un índice de discriminación del mismo modo muestran preferencia por investigar el objeto novedoso. ** p = 0.0024, one-sample t-test vs 0. (E) resultados representativos de un análisis de norte con dos grupos diferentes de ratones. Grupo B difiere significativamente del 50% por one-sample t-test (** p = 0.0024), pero no grupo A (p = 0.5837). En un análisis separado, para comparar grupos, se utiliza un test de dos muestras de Mann-Whitney debido a los tamaños de grupo irregular y no encontraron diferencias significativas en investigación es (p = 0,66, ns). (F) porcentaje tiempo con un objeto durante los ensayos de validación en una muestra de tamaño pequeño muestra una tendencia a la aversión hacia el objeto. p = 0.2159, one-sample t-test. (G) con un tamaño de muestra más grande y el objeto de (F) usado como un objeto nuevo en un norte, se encuentra una importante aversión al objeto, a pesar de que es el objeto de la novela. * p = 0.0270, one-sample t-test. Este es un ejemplo de un fallo técnico en la selección de objetos. Los datos se presentan como promedio ± SEM. datos de paneles C E se adaptan de una anterior publicación6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este protocolo proporciona un método rentable para llevar a cabo la ubicación de objetos y reconocimiento de objeto novedoso comportamiento pruebas en ratones. Estas pruebas permiten la evaluación de la función hippocampal, así como función de otras regiones corticales, como la corteza prefrontal, implicada en el objeto reconocimiento10. OLT y norte tienen la ventaja de evitar estímulos con Valencia emocional fuerte que se requieren para el laberinto acuático de Morris, acondicionado de miedo contextual, laberinto de Barnes o laberinto de brazos radiales. También evitan la necesidad de privación de alimentos como para el laberinto de brazos radiales. Además, este protocolo describe un sencillo procedimiento de prueba de dos días que no requiere equipo extenso o complicado para ejecución o análisis. Una desventaja de estas tareas es que no permiten medidas de aprendizaje o adquisición. Una diferencia en la investigación de la novedad podría ser debido a la pobre aprendizaje acerca de los objetos durante el entrenamiento, pobre memoria de lo aprendido o ambos. Total tiempo investigando objetos es una medida importante para descartar diferencias inherentes en la unidad de exploración pero no es una medida del aprendizaje. Si las medidas del aprendizaje son importantes para una cuestión experimental, un laberinto de agua, el laberinto de Barnes, o laberinto de brazos radiales probablemente sería preferible.
Edificio aduana de comportamiento arenas tiene el potencial de ahorrar cientos de dólares y el objeto dentro del alcance de una gran variedad de laboratorios de prueba. Este protocolo elimina muchos obstáculos y optimiza el proceso de fabricación para hacer construcción de arena interno más accesible a los científicos sin formación especializada en acrílicos. Es importante tener en cuenta que comprar hojas de acrílico color que contrastan con los ratones, como el acrílico blanco para ratones negros y acrílico negro para ratones blancos, facilitará la adquisición de datos y análisis, especialmente cuando se utilizan comercialmente disponibles software de análisis. Ordenar hojas de corte a la medida con "enrutado bordes" elimina la necesidad de una mesa vio (cuadro 1), y el uso del cemento de acrílico elimina la necesidad de taladrar y avellanar los orificios piloto. Atornillar los sujetadores, perforación y acrílico de corte a menudo hace que se rompe, chip y crack debido a su naturaleza frágil. Porque el cemento es un solvente, fluirá en el área de la unió, disolver y ablandar cualquier acrílico que encuentra. Por lo tanto, no debería aplicarse a cada pieza por separado como si fuera un pegamento tradicional. A diferencia de la cola, el cemento no llenar espacios negativos o se adhieren a las superficies. Esta es la razón principal para "enrutados bordes" como esto asegurará un borde liso y plano, creando un enlace mucho mejor. Cuando el cemento se seca, habrán fusionado las dos hojas de acrílico en una sola pieza en un proceso denominado "soldadura solvente". Como metal de soldadura, el producto final es una sola pieza, pero la zona soldada siempre seguirá siendo el lugar más débil. Como tal, una vez que las arenas están en uso, debe tener cuidado para evitar el impacto directo o una tensión extrema en esos momentos.
Este protocolo también muestra cómo configurar 4 arenas de prueba simultánea de hasta 4 ratones (figura 1 y figura 2). Las paredes opacas de las arenas impiden que los ratones ver uno con el otro durante las pruebas, pero todavía hay una posibilidad de que otros ratones en la habitación provoca olor o distracciones de ruido que pueden afectar la prueba. Ensayos de habituación como detallada aquí pueden ayudar a mitigar este problema, como ratones están expuestos a las condiciones de la sala varios animales antes de la prueba de comportamiento. Sin embargo, si las distracciones de otros ratones o experimentador ruido asociado con el manejo de otros ratones es una gran preocupación, una arena con un ratón puede ser utilizado, así, aunque aumentará el tiempo necesario para completar la OLT y la norte con varios ratones. Más de 4 arenas teóricamente podrían ser utilizados también, pero mayoría de las cámaras no tienen un ancho suficiente campo de visión para mostrar que muchas arenas con buena resolución.
Las dimensiones y distancias proporcionan aquí son pautas generales para las pruebas de comportamiento de ratón en un típico cuarto de prueba que es de 16 x 16 x 16 m3 en dimensiones (figura 1B y 1C). Puesta en marcha de señales ambientales apropiados, arenas y el equipo de grabación de vídeo deben ser optimizado para cada ambiente. Señales pueden consistir en grandes formas o patrones (normalmente en blanco y negro) que permiten a ratones para orientarse espacialmente en la OLT. En vez de poner señales en distintos lugares frente a la unos a otros, señales también puede montarse a la pared de la zona de pruebas. Este protocolo recomienda dividir el cuarto de prueba con una cortina para esconder el investigador y el equipo durante la prueba de comportamiento. Durante toda habituación, intervalos entre ensayos y ensayos activos investigadores deben cerrar la cortina para separarse del área de pruebas. Si esto no es práctico, el equipo puede permanecer a la vista de los ratones, pero el investigador debe moverse fuera de la vista durante la tarea. Si el investigador está presente, los ratones pueden intentar confiar en él o ella como una referencia espacial.
Todas las pruebas conductuales deben completarse en un ambiente controlado de temperatura y humedad con iluminación tenue, pero incluso en unos 310 lux y señales extrañas mínimo sonido o fuerte olor ambiental, tales como perfumes en experimentadores. Entre cada día de ensayo y pruebas, todas las arenas y los objetos deben limpiarse con Animalario recomendada métodos de esterilización tales como limpiar con etanol al 70% o blanqueador toallitas para reducir señales olfativas. Si se utilizan desinfectantes químicos, se recomienda un enjuague final con etanol al 70% porque muchos desinfectantes químicos pueden ser irritantes a los pies de los animales. Como con cualquier tarea conductual, manejo de ratones durante varios días antes de la prueba es necesaria familiarizarse con las personas que estarán realizando la OLT y NORT y reducir el estrés durante la prueba de20,22. Como ratones pueden experimentar estrés agudo por individuos desconocidos en las inmediaciones el área de pruebas, se recomienda también que toda la prueba conductual debe ser completada por el mismo individuo. Los parámetros de prueba y condiciones detalladas en el presente Protocolo se han optimizado para 6 a ratones C57Bl/6 adultos de 9 semanas de edad y serían más útiles en revelar debilitaciones de la memoria debido a una lesión en este grupo de edad o debilitaciones de la memoria por la edad sí mismo en los ratones más viejos. Si el objetivo es poner a prueba para mejorar la memoria en ratones jóvenes, sería más apropiado evitar efectos de techo sobre el rendimiento en la versión más fácil de ITI de 20 min un ITI ya que van desde 1 hora hasta 1 día. De hecho, es pueden ir desde 5 min (memoria inmediata) hasta varias horas o días (memoria remota), dependiendo de las necesidades específicas de la experiencia y las cepas y las edades de los ratones. Lo importante, independientemente de la longitud, es de todos deben ser coherentes entre sesiones en un experimento. Como variedades y edad de los ratones exhibe diferencias en el comportamiento y aprendizaje, el tiempo para cada ensayo y cada intervalo, arreglo de la zona, de prueba y objetos utilizados pueden ser modificados según la cepa de ratones, su edad y de la lesión específica particular / enfermedad e intervención modelo sometido a prueba9,21,23,25.
Mientras que el hipocampo dependencia de las funciones de memoria espacial probada en la OLT están bien establecidos, el norte puede o no puede confiar en el hipocampo. Interpretación de los datos desde el norte debe tomar esta advertencia cuenta. Las variables determinantes, para si el hipocampo está implicado, en la memoria de reconocimiento de objeto no están de acuerdo en todo, pero podrían incluir longitud ITI o prominencia espacial señales18. En particular, el protocolo presentado utiliza OLT espacial antes de NORT, que puede sesgar los ratones hacia el uso de procesos de hippocampal en el norte. Por lo tanto, es importante tener en cuenta que el orden puede invertirse, o cada tarea puede ser funcionada independientemente, dependiendo de los experimentadores preguntas y necesidades.
Selección de objetos es un aspecto crítico de la OLT y norte22,24. Objetos ideales son bastante pesados fácilmente desplazados por un ratón y de material, como vidrio o metal, que un ratón no se puede dañar por masticar o rasguño. Madera, espuma, u objetos plásticos blandos no son apropiados ya que se deforman fácilmente y son difíciles de mantener libres de olores. Además, los objetos utilizados en los ensayos deben todos ser relativamente similares en tamaño, textura, olor y material. Figura 1 muestra un ejemplo de un objeto adecuado que podría ser utilizado. Esta figurita de plástico naranja de un polluelo se llena con arena para darle peso suficiente y sellado para evitar la fuga de limpieza reactivos u otros agentes causantes del mal olor. Debido a la forma de la parte superior, los ratones son incapaces de subir encima ni se siente sobre este objeto. La OLT o norte, este objeto mejor se empareja con otro objeto de similar tamaño, peso, material, color y complejidad, como una figurita de plástico similar de un conejo. Para garantizar la investigación del objeto verdaderamente refleja la preferencia por la novedad, todos los objetos deben estar validados por valor intrínseco equivalente con un mínimo de 8 ratones en la misma cepa, sexo y edad del grupo experimental como se describen en sección 2.9 del protocolo. Además, los objetos deben ser al azar en términos de qué objeto es el objeto novedoso o movido entre ratones en el mismo estudio para asegurar que las características inherentes de los objetos no afecta a preferencia. Colocación del objeto también puede afectar el éxito o fracaso de la OLT y NORT. Objetos deben ser contrapesado en las arenas y no ser demasiado cerca de las paredes. Una esquina concurrida por un objeto es un lugar atractivo para los ratones esconderse y esto será confundir medidas de investigación.
Un requisito previo importante para la recolección de datos es definir "investigación activa", que es cuando un ratón activa un objeto con su nariz apuntada hacia el objeto no más de 2 cm de distancia. Un ratón en movimiento sobre la parte superior del objeto o mirando más allá del objeto no califica como investigación activa. Además, desde la OLT y NORT dependen un ratón Recordando la ubicación espacial o las características reales del objeto, debe haber suficiente estudio de éstos durante los ensayos de entrenamiento. Así, el investigador debe definir un tiempo mínimo de investigación y excluir a cualquier temas que no cumplen con ese nivel de referencia de investigación, tradicionalmente fijado en 20 segundos21.
Cuantificación del tiempo de investigación del objeto se puede lograr de varias maneras ya sea con o sin software de análisis costosos. Si se utiliza puntuación manual, como se describe aquí, la más completa colección de datos se logra registrando la fecha y hora en el video cuando el ratón está investigando el objeto. Los tiempos de arranque y parada de investigación del objeto en los tres ensayos individuales crea un registro permanente de marcas de tiempo imparcial y facilita el cálculo preciso manual de datos en comparación con métodos alternativos como el uso de un cronómetro para aditiva, registrar el tiempo total que un ratón investiga cada objeto.
También hay paquetes de software comerciales de investigación objeto de recuento. Software disponible en el mercado puede proporcionar una gran cantidad de datos más allá de la mano anotando datos descritos aquí, incluyendo distancia total viajó, cantidad de tiempo empleado en ciertas áreas de la arena y la velocidad de movimiento de16,23. Software, una vez correctamente calibrado y confirmado para detectar confiablemente la investigación del objeto, también puede producir datos mucho más rápidos que manual de puntuación. Este rendimiento de datos más rápido a la larga, puede, producir ahorros netos en comparación con las humanos-horas requeridas para la puntuación manual. Sin embargo, más paquetes de software para el análisis conductual tienen altos costos iniciales que pueden ser prohibitivos para muchos laboratorios y puntuación manual a menudo puede ser realizada por los investigadores del estudiante, haciendo que los costos por hora de scoring de comportamiento mínimo. Software comercial viene también con frecuencia con restricciones sobre cuántos usuarios pueden acceder al software al mismo tiempo, limitar los ahorros de tiempo y rendimiento de procesamiento de datos. Aunque hay muchas ventajas a estos paquetes de software, no son necesarios para reunir la información esencial de tiempo investigando objetos de OLT y NORT. La habilidad de adquirir manualmente estos datos hace tareas de novela financieramente más accesibles a una variedad más amplia de los investigadores.
Una característica adicional de este protocolo es que el primer período de sesiones de habituación es esencialmente un ensayo en campo abierto, que permite obtener datos sobre la actividad y los niveles de ansiedad. Niveles de actividad pueden ser cuantificados usando la distancia total recorrida o velocidad, de media, si se dispone de software de seguimiento. Del mismo modo, con software de seguimiento, las medidas de ansiedad pueden derivar tiempo de permanencia en el centro de la arena o la distancia recorrida en el centro. Estos datos también pueden ser adquiridos manualmente por superponer el vídeo de la arena con una cuadrícula y cuantificación de cruces. Estos datos de campo abierto pueden ayudar a descartar un déficit motor grave o ansiedad excesiva que pudiera interferir con la investigación del objeto más tarde.
Las pruebas estadísticas utilizadas en este protocolo son representativos de los métodos tradicionales de análisis. Cuando se comparan 2 grupos de ratones, se recomienda una prueba t de dos muestras, dos colas para probar la significación de la diferencia en porcentaje tiempo investigando el objeto movido o novela entre grupos. Si los tamaños de muestra son desiguales, excepcionalmente alta variabilidad o mostrar variabilidad desigual entre los grupos, que una prueba no paramétrica es recomendada por el contrario, como muchos de los supuestos subyacentes de la prueba de t se violó en estas condiciones. Al comparar 3 o más grupos de ratones, ANOVAs se recomiendan para probar si el grupo tiene un efecto significativo en porcentaje tiempo investigando el objeto movido o novela. Pruebas de corrección de error post hoc, como la prueba de Tukey o corrección de Bonferroni comparaciones pares, puede entonces aplicarse para probar la diferencia de tiempo de investigación por ciento entre cada par de grupos. Con la OLT, una manera adicional para analizar los datos es probar un cambio significativo en porcentaje tiempo investigando el objeto movido de formación a los ensayos de la OLT. Con solamente un grupo de ratones, esta prueba tendría la forma de una pares, dos colas prueba t, prueba de cambios significativos en el tiempo por ciento con el objeto movido de formación OLT en cada ratón (teniendo en cuenta que estas son emparejados los análisis y no independiente medidas, ya que cada ratón cede dos puntos de datos). Con dos grupos de ratones, un medidas repetidas ANOVA de dos vías se utilizará, la medida repetida siendo el juicio (entrenamiento versus OLT) y el segundo factor de asignación de grupo. Pruebas post-hoc para las diferencias entre grupos de tratamiento deben comparar los grupos entre sí dentro de los ensayos.
Por otra parte, si pruebas de memoria en la OLT o NORT sean todo lo que está siendo probado, puede utilizarse un one-sample t-test porcentaje tiempo investigando un objeto versus el valor fijo de 50%. Un tiempo porcentaje significativamente superior al 50% sugiere memoria para el objeto. Uno por ciento, significativamente por debajo del 50% sugiere aversión (por alguna razón), y opciones de objeto deben ser reevaluados. Sin embargo, la prueba de t de una muestra no puede revelar si dos o más grupos difieren unos de otros. Por ejemplo, en un experimento con dos grupos de ratones, si grupo A pasaron el 60% del tiempo con el objeto de la novela para p = 0.049 a una muestra de la prueba t comparación al 50% y el grupo B sólo gastó 59% del tiempo con el objeto de la novela para p = 0,051 , Grupo A es significativamente diferente del 50% (y no es grupo B). Sin embargo, es erróneo concluir que estos dos grupos son significativamente diferentes entre sí. Un A comparación de dos muestras t-test y B pueden revelar fácilmente que estos dos grupos son estadísticamente indistinguibles. Si el objetivo final es comparar el rendimiento de la memoria de dos o más grupos, los grupos deben compararse estadísticamente entre sí, no sólo en comparación con un estándar externo. Una pauta similar se aplica para una comparación de tiempo con un objeto se movió entre la formación y el OLT. En este caso, encontrar una diferencia significativa en el tiempo por ciento con un objeto movido entre OLT y el entrenamiento en un grupo y no en otro no muestran que estos grupos son estadísticamente diferentes. Los grupos deben post-hoc comparada entre sí dentro de cada ensayo, no sólo a través de los ensayos en grupo.
Es importante tener en cuenta que el tiempo de investigación de cualquier ratón individual no puede utilizarse como evidencia para o contra la memoria. Más bien, memoria para el objeto ubicación o identidad en estas tareas sólo se deduce basándose en datos agregados que estadísticamente se compararon a datos agregados de otro grupo o a los niveles de probabilidad fijo (50% de tiempo, 0 relación de discriminación). El tamaño de muestra necesario dependerá en gran medida el tamaño del efecto de una particular manipulación y variabilidad en el comportamiento, los cuales a su vez dependerá de los ratones que se utilizan. Edad, sexo y manipulaciones de todo impacto de la variabilidad. En los datos del ejemplo presentados en la Figura 3A y 3B, n = 14 sujetos fueron utilizados, dando un tamaño de efecto de 0,68 y potencia de 0.65 para una prueba de t pareada con α = 0.05. Si una potencia de 0,8 fueron deseada para esta comparación, se requiere un tamaño de muestra de 18.
Esta discusión está enmarcada en los valores de p y cortes de importancia porque estas suelen ser las medidas y análisis más registrados datos OLT y norte y por lo tanto probablemente familiar para los experimentadores y los revisores. Esta dependencia de los valores de p ha sido fuertemente criticado como estadísticamente válido26. Sin embargo, aunque los métodos de análisis alternativos existen y son apoyados en algunas revistas27, ninguno han sido ampliamente adoptada por los campos biomédicos y conductuales estándar26.
En Resumen, este protocolo con eficacia pruebas de memoria en ratones a costes mínimos. Recomendaciones para modificaciones apropiadas en el protocolo se incluyen para asegurar la implementación exitosa con cualquier modelo de roedor pequeños. Aplicación de este protocolo de lesiones específicas o modelos de intervención terapéutica puede revelar valiosa relevancia funcional que complementa los mecanismos celulares y moleculares estudiados.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por R00 NS089938 de NIH y financiación de lesión cerebral crónica y descubrimiento de temas en la Universidad Estatal de Ohio a EDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sign White - 9% Translucent and Opaque Colored Cast Acrylic (Chemcast) | TAP Plastics | NA | 1/4" x 15.75" x 15.75" with Routed Edges |
| Sign White - 9% Translucent and Opaque Colored Cast Acrylic (Chemcast) | TAP Plastics | NA | 1/4" x 15.75" x 16.5" with Routed Edges |
| Sign White - 9% Translucent and Opaque Colored Cast Acrylic (Chemcast) | TAP Plastics | NA | 1/4" x 16.5" x 16.5" with Routed Edges |
| TAP Acryllic Cement (1 pt.) | TAP Plastics | NA | |
| 16 G Hypo Applicator | TAP Plastics | NA | |
| Debut Video Capture Software Pro Edition | NCH Software | NA | |
| Stanely SAE/Metric Comb Square | Grainger | 6R171 | |
| Logitech Pro Stream Webcam C922x | CDW | 4429927 | |
| Belkin 16' USB 2.0 Active Extension Cable | CDW | 570691 | |
| Panduit Pan-Way LD Surface Raceway (8') | CDW | 300902 | |
| Spatial/Environmental Cues | Variable | NA | |
| Objects for testing | Variable | NA | |
| 70% ethanol | Variable | NA | |
| Double-sided tape | Variable | NA |
References
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