Summary
In questo articolo, dimostriamo come viene eseguita la tecnica assorbente microbiopsy e come l'esempio può essere utilizzato per l'estrazione di RNA per campionamento semplice e simultanea della pelle e sangue in modo minimamente invasivo.
Abstract
La biopsia della pelle convenzionale limita la ricerca clinica che coinvolge aree esteticamente sensibili o applicazioni pediatriche a causa della sua invasività. Qui, descriviamo il protocollo per l'utilizzo di un dispositivo basato su microneedle assorbente, microbiopsy assorbente, per campionamento minimamente invasiva della miscela di pelle e sangue. Il nostro obiettivo è quello di contribuire a facilitare il rapido progresso nella ricerca clinica, l'istituzione di biomarcatori per la malattia della pelle e riducendo il rischio per i partecipanti alla ricerca clinica. In contrasto con tecniche di biopsia della pelle convenzionale, il microbiopsy assorbente può essere eseguita in pochi secondi e non richiede addestramento intensivo grazie al suo design semplice. In questo rapporto, descriviamo l'uso di assorbenti microbiopsy, anche di carico e applicazione, il volontario. Quindi, vi mostriamo come isolare RNA dal campione assorbito. Infine, dimostriamo l'uso di quantitativa trascrizione d'inversione PCR (RT-qPCR) per quantificare i livelli di espressione di mRNA di sangue (CD3E e CD19) e la pelle (KRT14 e TYR). I metodi che descriviamo utilizzano fino la mensola kit e reagenti. Questo protocollo offre un approccio mini-invasivo per campionamento simultaneo di pelle e sangue all'interno della stessa matrice assorbente microbiopsy. Abbiamo trovato questo comitati di etica umana, medici e volontari per essere di supporto di questo approccio alla ricerca dermatologica.
Introduction
La biopsia della pelle è una delle tecniche più essenziali in dermatologia per il campionamento della pelle e la successiva diagnosi di malattie della pelle attraverso la valutazione istopatologica. La tecnica di biopsia comporta un professionista medico con una lama o punch biopsia per rimuovere la lesione sospettosa sulla pelle del paziente per l'esame1. Anche se la tecnica è efficace, altamente invasiva e limita la ricerca clinica come punto finale coinvolge solitamente biologia molecolare tecniche2,3. Analisi molecolare di malattie della pelle ha il potenziale per fornire informazioni biologiche altamente specifiche che l'analisi istopatologica non può, facilitando così la droga scoperta e malattia diagnosi4,5. Inoltre, la richiesta di campione nelle tecniche più molecolare è comparativamente piccola e può portare ad una riduzione nell'uso di animali e consentono un numero maggiore di ripetizioni. Perciò, vi è un chiaro bisogno di per una tecnica alternativa che consente l'analisi molecolare nella ricerca clinica e riduce il rischio per i partecipanti.
Per affrontare tale necessità nel campo, il nostro gruppo ha sviluppato una piattaforma diagnostica basata su microneedle romanzo, microbiopsy assorbente, che consente la raccolta di una quantità molto piccola di pelle miscelata con sangue in un modo semplice e minimamente invasiva6. Lo scopo di questa pubblicazione è quello di descrivere l'assorbente microbiopsy come uno strumento di campionamento per facilitare l'analisi molecolare mediante estrazione di RNA nella ricerca clinica.
In precedenza, abbiamo descritto la prima versione di microbiopsy, microbiopsy della pelle, che consiste di un microneedle di un disegno di piatto d'acciaio di tre-strato per estrarre piccoli pezzi di pelle tessuti7. La novità di questo dispositivo viene da più punti di contatto da microneedle che permette di estrazione efficiente tessuto3. Al contrario, una biopsia del punzone circolare pelle fornisce un unico punto di contatto e semplicemente le lacrime la pelle senza catturare qualsiasi campione in alcuni casi. Basato sulla pelle microbiopsy, recentemente abbiamo sviluppato il microbiopsy assorbente che ha sia sangue e pelle capacità di campionamento. Il dispositivo è stato indicato per essere fattibile per uso in ambienti poveri di risorse in un recente studio epidemiologico6.
Grazie al suo design semplice, la microbiopsy assorbente può essere eseguita in pochi secondi e non richiede una formazione completa. Inoltre, anestetico locale non è necessaria, e il sito di applicazione non causare cicatrici. Il presente protocollo consente di ricercatori o medici professionisti senza campione rilevante di formazione per ottenere dati di pelle mirate per l'analisi molecolare. Ci aspettiamo Microcampionamento dispositivi di diventare routine nella ricerca della pelle in futuro.
Anche se il microbiopsy è stato segnalato in altri studi di malattia della pelle che ha coinvolto tecniche diagnostiche molecolari6,8,9,10, come il virus del papilloma umano rilevazione del DNA, questo protocollo è il primo per dimostrare i dettagli delle tecniche di estrazione e la lavorazione di campione per il microbiopsy assorbente. Ulteriormente, questo è il primo rapporto che descrive la relativa espressione genica della pelle e cellule del sangue in campioni di microbiopsy.
Protocol
Lo studio è stato approvato dal comitato etico di Metro Sud umana ricerca e Università del Queensland umana ricerca comitato etico (HREC-13-QPAH-551 e UQ2013001551) e il comitato etico umano di University of South Australia (200607).
1. assorbente Microbiopsy Fabrication
- Laser taglio microneedle parti da 50 µm foglio di acciaio inox medicale e strato assorbente (carta da filtro), rispettivamente (Figura 1).
Nota: Altre parti, tra cui lo stantuffo e il caso, del dispositivo sono fabbricati con le tecniche di prototipazione rapida, come la stampa 3D. - Immergere tutte le parti, fatta eccezione per lo strato assorbente nel 70% di etanolo (EtOH) per 5 min e aria asciugateli per 30 min in seguito.
- Assemblare i microaghi di tre-strato, con lo strato assorbente nel mezzo (Figura 1a).
- Inserire i microaghi assemblato nella fessura dello stantuffo.
- Mettere la molla e inserire lo stantuffo nella custodia (Figura 1C). Evitare i microaghi toccare nulla nella procedura di montaggio per garantire la qualità dell'ago.
- Sigillare il microbiopsy assorbente assemblato in un pacchetto per la sterilizzazione di γ-radiazione prima di utilizzare.
2. il campionamento con la Microbiopsy assorbente
- Indossare guanti monouso e spray mani e strumenti, quali pinze, con 70% EtOH.
- Disinfettare il sito di applicazione con un batuffolo imbevuto di alcool.
- Rimuovere il microbiopsy dal pacchetto sterilizzato γ-radiazione senza toccare il microneedle nel processo.
- Caricare il dispositivo tirando lo stantuffo per comprimere la molla fino a quando c'è un 'click' il suono e le serrature di stantuffo in luogo.
- Puntare il dispositivo verso la pelle da campionare, assicurando che l'area di campionamento è in una posizione fissa.
- Assicurarsi che il dispositivo è quasi perpendicolare alla pelle, quindi applicare ≥ 1 kg di forza per il dispositivo sulla pelle.
Nota: Applicando una forza verso il basso nella pelle è necessaria per garantire la sufficiente penetrazione del microneedle. - Premere il grilletto e tenere il dispositivo in luogo per un minimo di 10 s per il campione di sangue essere assorbito.
Nota: Se il dispositivo viene rilasciato prima di 10 s, c'è meno campione catturato.
3. estrazione del RNA
Nota: Le procedure di estrazione di RNA sono state modificate dal protocollo di costruttori per l'isolamento ottima di RNA da microbiopsied campione. Tutti i reagenti e colonna utilizzata nell'estrazione del RNA sono inclusi nel kit, se non altrimenti indicato.
- Tirare fuori il pistoncino e assorbente microneedle dal caso di mani delicatamente. Assicurarsi che la punta della microneedle non tocchi nulla durante la rimozione.
- Rimuovere i microaghi assorbente dallo stantuffo. Tenere sui due fori sul microneedle con un paio di pinze sterili e tirarlo fuori.
- Mettere i microaghi intatto in un tubo del microcentrifuge 2 mL (non dal kit di isolamento del RNA; Vedi Tabella materiali) preriempiti con 50 µ l di tampone di estrazione, con il lato dell'ago rivolta verso il basso verso il basso. Per minimizzare la perdita di campione, lasciare il tubo su ghiaccio secco per 5 min prima di elaborare il campione.
- Vortice brevemente (3-5 s) per rimuovere alcuni dei materiali campionati dalla punta.
- Incubare i microaghi nel tubo su un rocker per 30 min a 42 ° C.
Nota: La soluzione tampone sarà assorbita nello strato assorbente immediatamente. - Posizionare la parte superiore del livello di microaghi (lato opposto dall'ago) con il bordo superiore del tubo 2ml microfuge utilizzando pinze sterili.
- Chiudere il coperchio del tubo, tale che la parte superiore del microneedle è tenuta sul posto tra il tappo e tubo.
- Girare il tubo a 16.000 x g o alla massima velocità per 30 s di rimuovere i materiali inclusi nel campione dallo strato assorbente del dispositivo.
- Rimuovere attentamente il microneedle con le pinzette senza immersione in soluzione tampone. Tenere il tubo e scartare i microaghi.
- Centrifugare i campioni a 3.000 x g per 2 min. pipetta il supernatante contenente il RNA estratto con cura in un nuovo tubo del microcentrifuge.
- Aggiungere 250 µ l di tampone condizionata sulla membrana del filtro di colonna di purificazione e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
- Centrifugare la colonna del tubo di raccolta a 16.000 x g o alla massima velocità per 1 min.
- Aggiungere 50 µ l di 70% EtOH nel campione prelevato da 3,9 di passaggio. Miscelare bene pipettando delicatamente su e giù.
- Trasferire la miscela (~ 100 µ l) nella colonna precondizionati purificazione.
- Centrifugare per 2 min x 100g immediatamente, seguita da una centrifugazione a 16.000 x g per 30 s per rimuovere il flusso continuo.
- Aggiungere 100 µ l di tampone di lavaggio 1 (W1) la colonna di purificazione e centrifugare per 1 min a 8.000 x g.
- Preparare soluzione dnasi aggiungendo 5 µ l di dnasi ho soluzione madre di 35 µ l di tampone RDD in una microcentrifuga separata del tubo per ogni campione. Miscelare capovolgendo delicatamente.
Nota: Il trattamento della dnasi è da eseguire sulla colonna di purificazione, anziché nella piastra di PCR in seguito, a causa della quantità del campione. - Aggiungere 40 µ l di miscela di incubazione dnasi direttamente nella membrana di colonna di purificazione. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
- Aggiungere 40 µ l di W1 nella membrana di colonna di purificazione. Centrifuga a 8.000 x g per 15 s.
- Pipettare 100 µ l di tampone di lavaggio 2 (W2) nella colonna di purificazione dopo il trattamento della dnasi e centrifugare per 1 min a 8.000 x g.
- Aggiungere un altro 100 µ l di W2 nella colonna di purificazione e centrifugare per 2 min a 16.000 x g. Check la colonna di purificazione per qualsiasi tampone di lavaggio residua. Ri-Centrifugare a 16.000 x g per 1 min, se rimane qualsiasi tampone di lavaggio.
- Trasferire la colonna di purificazione ad un nuovo tubo del microcentrifuge 0,5 mL fornito nel kit.
- Pipettare 11 µ l di RNAsi-libera dell'acqua (non fornito nel kit di isolamento di RNA), invece di Buffer di eluizione (EB), direttamente sulla membrana della colonna di purificazione. Toccare delicatamente la punta della pipetta sulla superficie della membrana durante l'erogazione di acqua RNAsi-libera per garantire il massimo assorbimento di acqua RNAsi-libera nella membrana. Incubare a temperatura ambiente per 2 min.
- Centrifugare la colonna per 1 min a 1.000 x g per distribuire l'acqua RNAsi-libera nella colonna, quindi centrifugare per 16.000 x g a 1 min per eluire RNA.
Nota: Quantificazione di RNA non è consigliabile a causa della piccola quantità del campione. - Interrompere il punto #1: conservare il campione di RNA totale a-80 ° C se la sintesi del cDNA non viene eseguita immediatamente.
Nota: Evitare il congelamento se non necessario data la bassa concentrazione di campione del RNA.
4. sintesi del cDNA
- Scongelare il campione congelato sul ghiaccio (da passo 3,25).
- Sintesi di cDNA da RNA totale con kit di sintesi di cDNA secondo la procedura descritta di seguito.
- Preparare la miscela di reazione: 11 µ l di RNA totale, 4 µ l di 5 x TransAmp Buffer, 1 µ l della trascrittasi inversa, 4 µ l di acqua privo di DNasi e RNasi. Mescolare delicatamente pipettando.
- Eseguire la trascrizione d'inversione su un apparato termociclatore: 25 ° C per 10 min, 42 ° C per 15 minuti, seguita da una fase di inattivazione finale della trascrittasi inversa a 85 ° C per 5 min.
- Interrompere il punto #2: conservare il campione trascritto inverso a-80 ° C fino all'utilizzo.
5. qPCR reazione e analisi dei dati
Nota: Gli iniettori per qPCR reazioni sono stati progettati per varcano i confini introne per evitare l'amplificazione di DNA genomic utilizzando Primer di NCBI BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Il gene di riferimento utilizzato in questo studio è RPLP0 (vedere la sezione di discussione per ulteriori informazioni).
- Scongelare il campione congelato sul ghiaccio (da passo 4,5).
- Eseguire qPCR con il kit di mix master qPCR secondo la procedura descritta di seguito.
- Preparare il mix master contenente i seguenti per reazione: 5 µ l di miscela di reazione x qPCR 2, 0,4 µ l di primer in avanti di 10 µM, 0,4 µ l di primer inverso di 10 µM, 2,2 µ l di acqua esente da DNasi. Mescolare delicatamente pipettando. Impostare i campioni in triplici copie.
- Pipettare 8 µ l di master mix in ciascun pozzetto di una 384 pozzetti PCR piastra prima e poi 2 µ l di cDNA da ciascun campione (un totale di 10 µ l per pozzetto).
Nota: Nessun controllo di modello (NTC) e nessun controllo della trascrittasi inversa (-RT) sono inclusi come controlli negativi. - Sigillare la piastra con la pellicola adesiva e centrifugare.
- Eseguire la reazione di amplificazione in un termociclatore in tempo reale: 95 ° C per 2 min (attivazione della polimerasi), seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 5 s (denaturazione), 60 ° C per 10 s (ricottura) e 72 ° C per 10 s (estensione).
- Calcolare la concentrazione di RNA di campioni interpolando da una curva standard preparata da modelli con concentrazioni note.
- Creare un Nuovo esperimento nel software.
- Fare clic su Definisci e Set Up standard per impostare una diluizione seriale per piastre.
- Selezionare e organizzare i pozzetti standard e campioni. Fare clic su applica.
- Fare clic su analizza nella scheda risultato per valutare la curva standard. Confermare la pendenza, il valore di R2 , errore ed efficienza di amplificazione soddisfano i criteri sperimentali.
- Controllare la quantità di campioni incogniti visivamente sulla curva standard in base ai loro valori di Ct.
Nota: La costruzione di una curva standard, compresa la scelta del fattore di diluizione, viene eseguita secondo protocolli pubblicati11,12,13.
- Eseguire analisi di espressione genica di mRNA utilizzando il metodo ΔCt (Ct è normalizzato ad un gene di riferimento).
- Sottrarre il valore Ct del gene bersaglio dal valore di Ct del gene di riferimento per ottenere il valore di ΔCt.
- Media dei valori di ΔCt di tecniche replicati.
- Tracciare e analizzare l'espressione genica con statistiche software11,14 (Vedi Tabella materiali).
Nota: In alternativa, l'analisi di espressione genica viene effettuata secondo protocolli pubblicati13.
Representative Results
Precedentemente abbiamo riferito che i microaghi di microbiopsy la pelle penetra la pelle circa 500 µm profonda7. Il design di microneedle della pelle microbiopsy è molto simile a quella su microbiopsy assorbente (Figura 2a). Mentre il microbiopsy assorbente è costituito da uno strato assorbente in mezzo per assorbimento di sangue, la pelle microbiopsy conteneva un canale per l'acquisizione meccanica dei tessuti della pelle. L'uso dello strato assorbente hanno portato anche a una leggera differenza nella dimensione microneedle (assorbente: 1,50 x 0,50 x 0,21 mm vs della pelle: 1,50 x 0,50 x 0,15 mm).
Figura 2b Mostra i siti di applicazione 5 min dopo assorbente e pelle microbiopsies sono stati applicati sul braccio sinistro volar del volontario del maschio. A causa della somiglianza tra i due disegni di microneedle, i siti di applicazione da entrambi i dispositivi erano comparabili, con eritema minore. Entrambe le sedi di applicazione non erano evidenti dopo 48 h senza cicatrici di sinistra dietro. Ciò sostiene l'ipotesi che questo dispositivo come minimo dilagante ha il potenziale per aiutare schermo più siti di applicazione o per essere eseguita su base regolare.
Figura 2 c Mostra un quadro rappresentativo dello strato assorbente della microbiopsy assorbente dopo essere applicato al braccio volar di un maschio di volontariato. Come illustrato nella figura, alcuni piccoli pezzi di pelle sono stati catturati vicino alla punta della microneedle, e un po' di sangue è stato assorbito nel filtro di carta. Questo indica che il dispositivo ha penetrato la pelle e catturato sia sangue simultaneamente all'interno della stessa matrice di assorbente microbiopsy la pelle. Figura 2d Mostra un post-campionamento pelle microbiopsy, la generazione precedente di microbiopsy, per il confronto. Il canale di microbiopsy la pelle catturato un piccolo pezzo di pelle, ma la quantità di sangue sui microaghi era piccola rispetto la microbiopsy assorbente. Entrambe le sedi di applicazione non erano evidenti entro 48h. Nell'esperimento, il microbiopsy assorbente è stato applicato con un tempo di attesa 10-s post-applicazione, mentre la pelle microbiopsy è stato rilasciato immediatamente dopo l'applicazione a causa della differenza nel design.
Come mostrato in Figura 3a, due gruppi di microbiopsy assorbenti sono stati coinvolti in questo esperimento basato sul protocollo di applicazione: 'Immediato rilascio' e che tiene 10-s'. Per il gruppo di «Rilascio immediato», il dispositivo è stato applicato utilizzando lo stesso protocollo di microbiopsy pelle originale, con il dispositivo viene rimosso dal sito di applicazione immediatamente dopo l'applicazione. Per lo svolgimento di 10-s' gruppo, il dispositivo è stato tenuto in posizione dopo l'applicazione per 10 s per migliorare la raccolta dei campioni. I due gruppi di microbiopsy assorbenti sono stati istituiti per dimostrare come l'approccio di applicazione poteva influenzare la quantità di campione. Il tempo di tenuta 10-s è stato scelto come un tempo clinicamente ragionevole per dimostrare che il tempo di applicazione interessa la quantità di campione recuperabile.
La quantità di RNA recuperato da due gruppi di assorbente microbiopsy erano 0,33 ± 0,39 ng 'Immediato rilascio' e 1,43 ± 0,88 ng per detenzione di 10-s' (Figura 3a, n = 20), suggerendo un aumento di 4 volte con il tempo di tenuta supplementare. Ciò indica che l'applicazione del dispositivo assorbente con il tempo di tenuta 10-s ha provocato più RNA estratto. La differenza può essere dovuta alla presenza di campione di sangue maggiore nello strato assorbente (Figura 3C). Infatti, il gruppo 'Immediato rilascio' (Figura 3b) non è riuscito a raccogliere una simile quantità di sangue con lo strato assorbente rispetto alla detenzione di 10-s' gruppo (Figura 3C). Si deve anche osservare che più immediatamente rilasciato microbiopsies erano vicini all'asse x, suggerendo erano eventi negativi o visualizzato una quantità molto bassa di RNA. Di conseguenza, il risultato convalidato l'ipotesi che il tempo di mantenimento avrebbe un impatto sulle prestazioni del dispositivo come potrebbe richiedere tempo per il sangue di essere assorbita dallo strato assorbente.
Poiché il dispositivo è stato progettato per il sangue e pelle campionamento, qPCR sia usato per rilevare l'espressione di biomarcatori di pelle e sangue per entrambi i dispositivi per il confronto. Abbiamo usato la tirosinasi, TYR, come biomarcatore per melanociti e KRT14 come biomarcatore per cheratinociti nell'epidermide vitale. Campioni di pelle microbiopsy sono stati inclusi nell'esperimento per il confronto. Come mostrato nella Figura 4, anche se la pelle e microbiopsies assorbenti sono stati applicati in modo diverso a causa della differenza nel design, l'espressione livelli per entrambi pelle biomarcatori TYR e KRT14 erano comparabili per entrambi i dispositivi come indicato dal dati. Biomarcatori di globuli bianchi (CD3E, cellule di T e CD19, cellule B) sono stati trovati per essere più prevalente nei campioni microbiopsy assorbente che nei campioni di pelle microbiopsy. Questo risultato suggerisce che l'assorbente microbiopsy eseguito meglio nella raccolta del sangue ma ancora mantenuto la capacità per l'acquisizione di pelle rispetto al microbiopsy di pelle (n = 5).
Figura 1. La fabbricazione di assorbente microbiopsy. (a) i microaghi di tre-strato. (b) tutte le parti del dispositivo. (c) la microbiopsy assorbente assemblato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. L'assorbente microbiopsy era in grado di catturare contemporaneamente campioni di pelle e sangue senza lasciare una cicatrice sul braccio sinistro volar del volontario maschio. (a) un confronto tra il microneedles di microbiopsies della pelle e assorbente. (b) l'applicazione siti sinistra di assorbente e pelle microbiopsies 5 minuti dopo l'applicazione. (c, d) Microneedles di microbiopsies assorbente e la pelle dopo l'applicazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. L'assorbente microbiopsy catturato più sangue e campione di RNA quando applicato per 10-s. (a) il tempo di mantenimento post-applicazione 10-s ha provocato una maggiore quantità di RNA rispetto immediatamente il rilascio del dispositivo (n = 20). Barre di errore rappresentano S.D. dalla media (* * *p< 0,0001). (b, c) Immagini rappresentative della microbiopsies assorbente dopo applicazione con 'Immediato rilascio' e che tiene 10-s' approcci. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Il confronto dei livelli di espressione di mRNA tra pelle e microbiopsies assorbente (n = 5). L'espressione genica era stata normalizzata con gene di riferimento RPLP0. Barre di errore rappresentano S.D. dalla media (*p< 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questi risultati dimostrano che il microbiopsy assorbente può essere usata come strumento per campionamento semplice e minimamente invasiva della miscela di pelle e sangue per la caratterizzazione molecolare. Applicazione del dispositivo in conformità con il nostro protocollo è essenziale per ottenere risultati affidabili, come mostrato dalla differenza di RNA importo recuperato con differenti protocolli applicativi (Figura 3). Una volta che il campione viene estratto, l'esempio successiva elaborazione passo per estrazione del RNA è altamente simile a protocolli stabiliti15,16. Oltre ai primi passi nella estrazione di RNA che vengono modificati per il microbiopsy assorbente, un altro cambiamento chiave è l'uso di acqua RNAsi-libera per migliorare i risultati per applicazioni a valle. Inoltre, vale la pena ricordare che il gene di riferimento utilizzato in questo studio è RPLP0. RPLP0, cui la funzione è ben nota per differenti delle cellule e del tessuto tipi17, è stato segnalato come un gene di riferimento adeguato per l'uso in tumori cutanei non-melanoma e lesioni precancerose18.
Uno dei principali limiti del dispositivo è la rimozione di microbiopsy dal dispositivo, che richiede tempo e potenzialmente aumenta la probabilità di perdita del campione, specialmente per campioni sensibili come RNA. Tuttavia, il problema può essere superato da tutti gli strumenti di trattamento di sterilizzazione, come tubi di 2 mL microcentrifuga su ghiaccio secco di preraffreddamento.
L'uso della microbiopsy assorbente è semplice e non richiede una formazione intensiva. La biopsia convenzionale non è necessaria come microbiopsy permette la caratterizzazione molecolare con tecniche di diagnosi molecolare stabilita, ad esempio RT-qPCR. Per quantificare e dimostrare la capacità di campionamento di assorbente microbiopsy ulteriormente, è stata studiata letteratura precedente che ha coinvolto l'estrazione di RNA da tessuti di pelle umana. Da una tipico 3.0 o 4.0 millimetri pelle punch biopsia, tre studi hanno riferito gli importi di RNA estratti variavano da 50 a 200 ng per mg di pelle tessuto19,20,21. Paragonando l'1,43 ng di RNA che è stato recuperato dalla microbiopsy assorbente in media (Figura 3), il peso dei tessuti della pelle campionata è previsto alla gamma da 0,29-115 µ g basato sullo stesso rapporto del RNA--tessuto dagli studi di biopsia del punzone della pelle.
Questo protocollo non è senza trabocchetti potenziali, anche se alcuni dei problemi può essere facilmente superato. Ad esempio, i dati di estrazione di RNA ha suggerito una considerevole variazione anche con il tempo di tenuta 10-s (Figura 3). Per risolvere il problema, una potenziale soluzione coinvolge ottimizzare il protocollo di applicazione. Parametri quali la forza applicata sulla pelle e tempo di mantenimento deve essere testato e ottimizzato per ridurre le variazioni nell'estrazione del campione. L'altro problema potenziale è la rimozione del microbiopsy dal dispositivo, che potrebbe compromettere l'integrità del campione e il recupero. Anche se rimuovere il microbiopsy per l'estrazione di RNA è un approccio efficace, l'intera procedura è noiosa, e il campione potrebbe essere esposto a contaminazione nel processo. Di conseguenza, la modifica del protocollo di trattamento del campione altamente è voluta al fine di garantire l'integrità del campione e prevenire la perdita di campione.
Una volta che le due questioni di cui sopra sono indirizzate, si prevede che il dispositivo diventerà uno strumento standard per la ricerca clinica. È importante notare che il dispositivo acquisisce il campione di sangue e pelle contemporaneamente e questo dovrebbe essere presi in considerazione quando si analizzano i dati di espressione genica. In conclusione, questo protocollo descrive i dettagli di esecuzione microbiopsy assorbente come uno strumento facile e minimamente invasivo per pelle combinata e prelievo di sangue e il campione successivo di elaborazione per la relativa espressione genica.
Disclosures
Conflitti di interesse non dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo riconoscere NHMRC borse APP1109749 e APP1111216, University of Queensland Centennial borsa e borsa di ricerca post-laurea internazionale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
| Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
| Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
| RNA extraction | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
| Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
| cDNA synthesis | |||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
| qPCR reaction and data analysis | |||
| SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
| GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
| PCR primers | |||
| RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
| RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
| TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
| TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
| KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
| KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
| CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
| CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
| CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
| CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |
References
- Wang, C. Y., Maibach, H. I. Why minimally invasive skin sampling techniques? A bright scientific future. Cutaneous and Ocular Toxicology. 30, 1-6 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L. The skin microbiopsy. , The University of Queensland. (2015).
- Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134, 362-372 (2014).
- Chapman, P. B., et al. Improved Survival with Vemurafenib in Melanoma with BRAF V600E Mutation. New England Journal of Medicine. 364, 2507-2516 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L., et al. Microbiopsy engineered for minimally invasive and suture-free sub-millimetre skin sampling. F1000Research. 2, (2013).
- Tom, L. N., et al. Skin microbiopsy for HPV DNA detection in cutaneous warts. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 30, e216-e217 (2016).
- Sobarun, P., et al. Microbiopsy Biomarker Profiling in a Superficial Melanoma Resembling a Pigmented Basal Cell Carcinoma. JAMA Dermatology. 153, 334 (2017).
- Banan, P., Lin, L. L., Lambie, D., Prow, T., Soyer, H. P. Effects of Ex Vivo Skin Microbiopsy on Histopathologic Diagnosis in Melanocytic Skin Lesions. JAMA Dermatology. 149, 1107 (2013).
- GraphPad, GraphPad - FAQ 1753 - Prism 3 -- Calculating "Unknown" Concentrations using a Standard Curve. , Available from: https://www.graphpad.com/support/faq/prism-3-calculating-unknown-concentrations-using-a-standard-curve/ (2018).
- Kubista, M., et al.
- Goni, R., García, P., Foissac, S. The qPCR data statistical analysis. , 1-9 (2009).
- GraphPad Statistics Guide. , (1995).
- Goldstein, N. B., et al. Isolating RNA from precursor and mature melanocytes from human vitiligo and normal skin using laser capture microdissection. Experimental dermatology. 25, 805-811 (2016).
- Shearstone, J. R., Allaire, N. E., Campos-Rivera, J., Rao, S., Perrin, S. Accurate and precise transcriptional profiles from 50 pg of total RNA or 100 flow-sorted primary lymphocytes. Genomics. 88, 111-121 (2006).
- Bär, M., Bär, D., Lehmann, B. Selection and Validation of Candidate Housekeeping Genes for Studies of Human Keratinocytes-Review and Recommendations. Journal of Investigative Dermatology. 129, 535-537 (2009).
- Hoang, V. L. T., et al. RNA-seq reveals more consistent reference genes for gene expression studies in human non-melanoma skin cancers. PeerJ. 5, e3631 (2017).
- Döbbeling, U. Simultaneous RNA and DNA Extraction from Biopsy Material, Culture Cells, Plants, and Bacteria. Nucleic Acid Protocols Handbook, The. , Humana Press. 53-56 (2000).
- Bruning, O., et al. RNA isolation for transcriptomics of human and mouse small skin biopsies. BMC Research Notes. 4, 438 (2011).
- Berglund, S. R., et al. Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies. Journal of Investigative Dermatology. 127, 349-353 (2007).
