Summary
Bu makalede, biz emici microbiopsy tekniği nasıl yapılır ve nasıl örnek için RNA çıkarma basit ve aynı zamanda yapılan örnekleme için-deri ve kan minimal invaziv bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir.
Abstract
Geleneksel cilt biyopsisi kozmetik hassas alanlarda veya onun invasiveness nedeniyle Pediatrik uygulamaları ile ilgili klinik araştırma sınırlar. Burada, bir emici microneedle tabanlı aygıt, emici microbiopsy, deri ve kan karışımı minimal invaziv örnekleme için kullanma Protokolü açıklar. Amacımız hızlı ilerleme klinik araştırma, cilt hastalıkları ve klinik araştırma katılımcılar için riski azaltmak için biyolojik kurulması kolaylaştırmak yardımcı olmaktır. Geleneksel cilt biyopsisi teknikleri, aksine emici microbiopsy saniye içinde gerçekleştirilebilir ve yoğun bir eğitim ile basit tasarımı gerektirmez. Bu raporda, emici microbiopsy yükleme ve uygulama, bir gönüllü de dahil olmak üzere, nasıl kullanılacağını açıklar. O zaman, biz RNA absorbe örnekten yalıtmak nasıl göstereceğim. Son olarak, nicel ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR) kan (CD3E ve CD19) ve (KRT14 ve TYR) deri mRNA ifade düzeylerini ölçmek için kullanımını göstermektedir. Biz tarif yöntemleri raf kitleri ve Kimyasalları kullanmak. Bu iletişim kuralı için deri ve kan aynı emici microbiopsy matris içinde eşzamanlı örnekleme minimal invaziv bir yaklaşım sunmaktadır. Biz insan etik komiteler, klinisyenler ve gönüllü dermatolojik araştırma için bu yaklaşımın destek olmaya bulduk.
Introduction
Cilt biyopsisi Dermatoloji deri örnekleme için en temel teknikleri ve sonraki tanı histopatolojik değerlendirmesi ile cilt hastalıkları biridir. Biyopsi tekniği bir sağlık uzmanına muayene1için hastanın cilt şüpheli lezyon kaldırmak için bir bıçak veya punch biyopsi kullanarak içerir. Teknik etkili olsa da, son derece invaziv ve bitiş noktası genellikle moleküler biyoloji teknikleri2,3karıştırmak gibi klinik araştırma sınırlar. Moleküler analiz cilt hastalıkları histopatolojik analizi, böylece ilaç bulma ve hastalık tanı4,5kolaylaştırmak yapamam çok özel biyolojik bilgi sağlamak için potansiyele sahiptir. Ayrıca, örnek talep en moleküler teknikleri nispeten küçük ve hayvan kullanımı bir azalma kurşun ve çoğaltır daha çok sayıda izin. Bu nedenle, ortada açık bir klinik araştırma moleküler analiz sağlar ve katılımcılar için risk düşürür alternatif bir tekniği için gerekir.
Böyle bir ihtiyaç alanındaki adrese, bizim grup geliştirmiştir bir roman microneedle tabanlı tanı platformu, basit ve minimal invazif şekilde6kanla karışık cilt küçük bir miktar koleksiyonu sağlayan emici microbiopsy. Bu yayının amacı emici microbiopsy moleküler analizi RNA ayıklama klinik araştırma ile kolaylaştırmak için bir örnekleme araç olarak tarif etmektir.
Daha önce microbiopsy, Cilt dokular7küçük parçalar ayıklamak için bir üç kat sac tasarım yapılan bir microneedle oluşur deri microbiopsy ilk sürümü anlatmıştık. Yenilik bu cihazın verimli doku çıkarma3izni microneedle birden çok kişi puan gelir. Buna ek olarak, dairesel deri punch biyopsi tek bir irtibat noktası sağlar ve bazı durumlarda herhangi bir örnek yakalama olmadan cilt sadece gözyaşları. Cilt microbiopsy dayanarak, biz son zamanlarda geliştirilen kan ve deri yetenekleri örnekleme olan emici microbiopsy. Cihazın son epidemiyolojik çalışma6kaynak-yoksul bölgelerde uygulanabilir olduğu gösterilmiştir.
İle basit tasarımı, emici microbiopsy bir kaç saniye içinde gerçekleştirilebilir ve kapsamlı bir eğitim gerektirmez. Ayrıca, lokal anestezik gerekli değildir ve uygulama sitesi skarlasma neden olmaz. Araştırmacılar veya tıp uzmanları ilgili örnekleme moleküler analiz için hedeflenen cilt verileri elde etmek için eğitim olmadan sağlayan mevcut protokol. Microsampling cihazlar deri araştırma yordamında gelecekte olmak için bekliyoruz.
Her ne kadar microbiopsy moleküler tanı teknikleri6,8,9,10, insan papilloma virüsü DNA tespiti, bu iletişim kuralı gibi dahil diğer cilt hastalığı çalışmalarda bildirilmiştir emici microbiopsy örnek çıkarma ve işleme teknikleri ayrıntılarını göstermek için ilk olduğunu. Ayrıca, bu açıklayan göreli gen ifade deri ve kan hücreleri microbiopsy örneklerinde profilleme ilk rapordur.
Protocol
Çalışma Metro Güney insan araştırma Etik Komitesi ve Queensland Üniversitesi insan araştırma Etik Komitesi (HREC-13-QPAH-551 ve UQ2013001551) ve Üniversitesi Güney Avustralya insan Etik Komitesi (200607) tarafından kabul edildi.
1. emici Microbiopsy imalat
- Microneedle parçalar 50 µm Medikal paslanmaz çelik levha ve emici katman (filtre kağıdı), sırasıyla kesip lazer (şekil 1).
Not: pistonu ve davanın aygıt dahil diğer parçalar, 3D baskı gibi hızlı prototipleme teknikleri ile cihazlarında. - Emici katmanda 5 min için % 70 etanol (alkol) hariç tüm parçaları ıslatın ve hava kuru onları için 30 dk sonra.
- Üç kat microneedle emici katman orta (Şekil 1a) ile bir araya getirin.
- Birleştirilmiş microneedle dalgıç yarık yerleştirin.
- Bahar üzerinde koymak ve pistonu durumda (şekil 1 c) içine yerleştirin. İğne kalite sağlamak için montaj yordamı herhangi bir şeye dokunmadan microneedle kaçının.
- Bir paket kullanmadan önce γ-radyasyon sterilizasyon için birleştirilmiş emici microbiopsy kapatın.
2. örnekleme emici Microbiopsy ile
- Tek kullanımlık eldiven ve sprey eller ve forseps, % 70 gibi araçlar, alkol.
- Uygulama sitesi bir alkol bezle sterilize.
- Microbiopsy işleminin microneedle dokunmadan γ-radyasyon sterilize paketini kullanarak kaldırın.
- Cihazın bahar kadar bir 'klik' ses ve dalgıç kilitleri yerde sıkıştırmak için dalgıç çekerek yükleyin.
- Cihazın tatmak için cilt örnekleme alanı sabit bir konumda olmasını sağlayabilmek amacı.
- Aygıtın yaklaşık cilde dik olduğundan emin olduktan sonra cihazın deri üzerine ≥1 kg kuvvet uygulamak.
Not: cildi aşağı doğru yürürlüğe uygulama microneedle yeterli nüfuz sağlamak için gereklidir. - Tetiği basılı aygıt için en az 10 yerde s absorbe olmak kan örneği için.
Not: Eğer cihazın saat10'dan önce serbest s, daha az örnek ele geçirdi.
3. RNA çıkarma
Not: RNA çıkarma yordamları üreticilerin protokolü en uygun RNA izolasyonu microbiopsied örnek için modifiye edilmiştir. Tüm reaktifler ve RNA çekme içinde kullanılan sütun aksi belirtilmedikçe kiti dahildir.
- Dalgıç ve emici microneedle davasından dışarı eller tarafından yavaşça çekin. Microneedle ucu ile temas bir şey kaldırma sırasında gelmez emin olun.
- Emici microneedle pistonu çıkarın. Steril Forseps ile Per: microneedle üzerinde iki delik üzerine ve çıkar.
- Sağlam microneedle 2 mL microcentrifuge tüpte koymak (bkz: RNA izolasyon kit değil; Malzemeler tablo) iğne yüzü aşağı bakacak şekilde dibe doğru ayıklama arabellek, 50 µL ile doldurulmuş. Örnek kaybı en aza indirgemek için tüp kuru buz 5 min için örnek işleme önce bırakın.
- Bazı örneklenen malzemeler uç--dan kaldırmak için girdap kısa bir süre (3-5 s).
- Bir rocker 42 ° C'de 30 dk metroyla microneedle kuluçkaya
Not: Arabellek çözüm emici katman hemen absorbe edilebilir. - Microneedle (iğne ters taraftan) düzey üst kısmı steril forseps kullanarak 2 mL microfuge tüp üst kenarı ile yerleştirin.
- Öyle ki microneedle üst kapağı ve tüp arasında yer tutulur tüp kapağını kapatın.
- Tüp 16.000 g x veya 30 için maksimum hızda spin s örneklenen malzeme cihazın emici katman kaldırmak için.
- Microneedle geri arabellek çözüm içine daldırma olmadan Forseps ile dikkatli bir şekilde çıkarın. Tüp tutmak ve microneedle atın.
- 3000 x g 2 dk. pipet de örnekleri ayıklanan RNA dikkatli bir şekilde yeni bir microcentrifuge tüpüne içeren süpernatant santrifüj kapasitesi.
- Merkezi Klima arabellek 250 µL arıtma sütun filtre membran üzerine ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
- Toplama tüp 16.000 g x veya 1 dk. için maksimum hızda sütununda santrifüj kapasitesi.
- %70 50 µL eklemek alkol içine adım 3.9 üzerinden toplanan örnek. De hafifçe yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.
- Karışımı (~ 100 µL) preconditioned arıtma sütuna aktarmak.
- Santrifüjü 16.000 x g 30, ardından santrifüj 2 dk 100 x g hemen, az s akışı üzerinden kaldırmak için.
- Yıkama tampon 1 (W1) 100 µL arıtma sütun ve 1 dk santrifüj içine de 8000 x g ekleyin.
- Dnaz çözüm ben arabellek RDD 35 µL ayrı bir microcentrifuge içinde hisse senedi çözüm her örnek için tüp Dnaz 5 µL ekleyerek hazırlayın. Yavaşça ters çevirme karıştırın.
Not: Dnaz tedavidir arıtma sütun, yerine PCR tabak içinde daha sonra örnek miktarı nedeniyle gerçekleştirilecek. - 40 µL doğrudan arıtma sütun membran Dnaz kuluçka karışımı ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- W1 40 µL arıtma sütun membran içine ekleyin. Santrifüj 8.000 x g, 15 s.
- Yıkama tampon 2 (W2) 100 µL arıtma sütuna pipet Dnaz tedavi ve santrifüj 8.000 x g, 1 dk sonra.
- W2 başka bir 100 µL arıtma sütununa ekleyin ve 16.000 x g. onay arıtma sütun herhangi bir kalıntı yıkama arabellek için 2 dk santrifüj kapasitesi. Herhangi bir yıkama arabellek kalırsa 16.000 x g 1 dk. için de yeniden santrifüj kapasitesi.
- Kit ile sağlanan yeni bir 0.5 mL microcentrifuge tüp arıtma sütun aktarın.
- (RNA izolasyon kit ile sağlanan değil) RNase free, yerine, elüsyon arabellek (EB) doğrudan üzerine su arıtma sütun membran 11 µL pipet. Yavaşça membran yüzeyine pipet ucu maksimum RNase free su emilimini membran içine sağlamak için RNase free su dağıtımı sırasında dokun. 2 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Sütun için sütun RNase free su dağıtmak, sonra 16.000 x g RNA elute için 1 dk santrifüj kapasitesi 1000 x g, 1 dk santrifüj kapasitesi.
Not: RNA miktar örnek küçük bir miktar nedeniyle önerilmez. - #1 puan durdurmak: cDNA sentez hemen gerçekleştirilmez, toplam RNA örnek-80 ° C'de depolamak.
Not: Eğer gerekli değil buz gibi RNA örnek düşük konsantrasyon verilen kaçının.
4. cDNA sentezi
- (Kimden adım 3,25) buzda donmuş örnek çözülme.
- CDNA üzerinden cDNA sentez kiti göre aşağıdaki yordamı ile toplam RNA sentez.
- Reaksiyon karışımı hazırlayın: Toplam RNA, 5 x TransAmp arabellek, ters transkriptaz 1 µL, 4 µL Dnaz/RNase-ücretsiz su 4 µL'ın 11 µL. Pipetting tarafından karışımı yavaşça.
- Ters transkripsiyon termal cycler cihazları üzerinde çalıştırın: 10 dk, 15 dk, 42 ° C için 25 ° C 85 ° c 5 min için bir son ters transkriptaz inactivation adım izledi.
- Noktası #2 dur:-80 ° C'de ters kopya etmek örnek kullanmak kadar saklamak.
5. qPCR reaksiyon ve veri analizi
Not: QPCR reaksiyonlar için astar NCBI astar patlama (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) kullanarak genomik DNA amplifikasyon önlemek için intron sınırları yayılmak üzere tasarlanmıştır. Bu çalışmada kullanılan referans gen RPLP0 olduğunu (daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakın).
- (Kimden adım 4.5) buzda donmuş örnek çözülme.
- QPCR ile qPCR ana mix teçhizat göre aşağıdaki yordamı gerçekleştirin.
- Aşağıdaki reaksiyon başına içeren ana karışımı hazırlayın: 2 x qPCR reaksiyon mix, 10 µM ileri astar, 0.4 µL 10 µM ters astar, su Dnaz ücretsiz 2,2 µL 0.4 µL 5 µL. Pipetting tarafından karışımı yavaşça. Triplicates örneklerinde ayarlayın.
- Bir 384-şey, PCR plaka ilk ve sonra 2 µL cDNA her örnek (iyi başına 10 µL toplam) üzerinden, her kuyuya ana karışımı 8 µL pipet.
Not: Herhangi bir şablonu kontrolü (NTC) ve ters transkriptaz kontrol (-RT) negatif denetimleri dahil edilir. - Yapıştırıcı film ile plaka mühür ve kısaca santrifüj kapasitesi.
- Amplifikasyon tepki gerçek zamanlı bir termal cycler çalıştırın: 95 ° 40 95 ° C devredir 5 ardından C için 2 dk (polimeraz etkinleştirme), s (denatürasyon), 60 ° C 10 için s (tavlama) ve 72 ° C 10 için s (uzantısı).
- Şablonları bilinen konsantrasyonları ile hazırlanan standart bir eğri üzerinden enterpolasyonla örnekleri RNA konsantrasyonu hesaplayın.
- Yazılımda bir Yeni bir deneme oluşturun.
- Seri seyreltme plakaları için ayarlamak için tanımla ve Set Up standartları'ı tıklatın.
- Seçin ve standartları ve örnekleri için kuyu düzenlemek. Uygula' yı tıklatın.
- Standart eğri değerlendirmek için sonuç sekmesinin Çözümle ' yi tıklatın. Onaylamak yamaç, R2 değeri, amplifikasyon verimlilik ve hata deneysel ölçütlere uyan.
- Görsel olarak Ct değerlerine dayalı standart eğri üzerinde bilinmeyen örnekleri madde miktarlarını kontrol edin.
Not: Standart eğri seyreltme faktörü, seçimi de dahil olmak üzere, inşaat yayımlanmış protokolleri11,12,13göre gerçekleştirilir.
- Gen ifade analizi mRNA (Ct refence gene ile normalleştirilmiş) ΔCt yöntemini kullanarak gerçekleştirin.
- Hedef gen ΔCt değer elde etmek için referans gen Ct değerinden Ct değerini çıkarın.
- Ortalama teknik ΔCt değerler çoğaltır.
- Arsa ve gen ekspresyonu istatistik yazılım11,14 ile analiz ( Tablo malzemelerigörmek).
Not: Alternatif olarak, gen ifade analizi yayımlanmış protokolleri13göre gerçekleştirilir.
Representative Results
Biz daha önce deri microbiopsy microneedle cilt yaklaşık 500 µm derin7nüfuz bildirdin. Cilt microbiopsy microneedle tasarımını emici microbiopsy (şekil 2a) üzerinde bir çok benzer. Kan emme için ortada bir emici katman emici microbiopsy oluşan iken, Cilt microbiopsy mekanik deri dokuları yakalamak için bir kanal yer. Ayrıca emici katman kullanımı liderliğindeki microneedle boyut küçük bir fark için (emici: 1,50 x 0.50 x 0,21 vs cilt mm: 1,50 x 0.50 x 0.15 mm).
Şekil 2b Uygulama siteleri 5 dk sonra emici gösterir ve cilt microbiopsies erkek gönüllü volar Sol kolunda uygulandı. İki microneedle tasarımlar arasındaki benzerliği nedeniyle, her iki cihaz uygulama sitelerden küçük eritem ile karşılaştırılabilir. Her iki uygulama site arkasında hiçbir yara izi kaldı ile 48 saat sonra fark değildi. Bu minimal invaziv bu aygıtın birden çok uygulama site ekran yardımcı olmak için düzenli olarak gerçekleştirilen veya gerçekleştirilecek potansiyeline sahiptir hipotezi destekler.
Şekil 2 c emici microbiopsy emici katman temsili resmi bir erkek volar koluna uygulanan sonra gönüllü gösterir. Şekilde gösterildiği gibi birkaç küçük parça deri microneedle ucu ele geçirildi ve biraz kan filtre kağıdı emilir. Bu cihaz cilde nüfuz ve deri ve kan aynı anda aynı emici microbiopsy matris içinde yakalanan gösterir. Sonrası örnekleme bir şekil 2B gösterir microbiopsy, microbiopsy, önceki nesil karşılaştırma için cilt. Cilt microbiopsy kanal küçük bir deri parçası yakalanan ancak microneedle kan miktarına göre emici microbiopsy küçüktü. Her iki uygulama site içinde 48 h fark değildi. Deneyde, emici microbiopsy uygulandığı ile 10-s holding zaman sonrası uygulama sırasında cilt microbiopsy hemen tasarım farklılığı nedeniyle uygulandıktan sonra serbest bırakıldı.
Şekil 3aiçinde gösterildiği gibi emici microbiopsy iki grup uygulama protokolüne dayanan bu deney dahil: 'Basın Bülteni' ve ' 10-s holding'. 'Basın Bülteni' grubu için aygıtı aynı orijinal deri microbiopsy protokolü, uygulama sitesinden hemen sonra uygulama kaldırılmakta olan cihaz kullanarak uygulandı. ' 10-s tutmak için ' grup, cihaz düzenlenen yerde 10 için uygulamadan sonra örnek toplama geliştirmek için s. Emici microbiopsy iki grup uygulama yaklaşım örnek tutar nasıl etkileyebilir göstermek için kurulmuştur. 10-s holding saat klinik olarak makul bir süre uygulama süresi kurtarılabilir örnek miktarını etkiler göstermek için seçildi.
RNA miktarı kurtarılan iki emici microbiopsy gruplarından 0,33 ± 0.39 ng 'Basın Bülteni' ve 1,43 ± 0,88 ng ' 10-s beklediğiniz için ' (şekil 3a, n = 20), ilave holding zamanla 4-fold bir artış düşündüren. Bu 10-s holding zamanla emici aygıt uygulama daha fazla RNA çıkarılan sonuçlandı gösterir. Fark emici katman (şekil 3 c) artan kan örneğinde varlığı nedeniyle olabilir. Gerçekten de, 'Basın Bülteni' grup (şekil 3b) benzer bir miktar kan emici tabaka ' 10-s holding ile karşılaştırıldığında toplanamadı ' (şekil 3 c) grubu. Ayrıca en hemen serbest bırakmak microbiopsies olumsuz olaylar olduğunu veya RNA çok düşük miktarda görüntülenen düşündüren x ekseni yakın olduğunu belirtmek gerekir. Bu nedenle, sonuç kan emici katman tarafından absorbe edilebilir için zaman alabilir gibi holding zaman cihazın performansı üzerinde bir etkisi olurdu hipotezini geçerliliği.
Cihazın kan ve deri örnekleme için tasarlanmıştır beri qPCR deri ve kan biyolojik karşılaştırma için her iki cihaz için ifade algılamak için kullanıldı. Tirozinaz, TYR, bir biyomarker melanosit ve KRT14 keratinositler uygun epidermisin içinde için bir biyomarker olarak olarak kullanılır. Deri microbiopsy Örnekleri Deneme ürününü karşılaştırma listesine dahil. Cilt ve emici microbiopsies farklı tasarım, farklılığı nedeniyle uygulanmış olsa şekil 4gösterildiği gibi ifade için her ikisi de biyolojik TYR deri ve KRT14 gösterildiği gibi her iki cihaz için karşılaştırılabilir düzeyde veri. Beyaz kan hücresi biyolojik (CD3E, T hücreleri ve CD19, B hücreleri) daha yaygın cilt microbiopsy örneklerinde emici microbiopsy örneklerinde bulunmuştur. Bu sonuç öneriyor emici microbiopsy daha iyi kan koleksiyonunda gerçekleştirilen ancak hala muhafaza deri deri microbiopsy ile karşılaştırıldığında yakalamak için kapasite (n = 5).
Şekil 1. Emici microbiopsy imalatı. (a) üç kat microneedle. (b) cihazın bölümlerdir. (c) monte emici microbiopsy. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Emici microbiopsy deri ve kan örnekleri aynı anda erkek gönüllü volar Sol kolunda bir yara izi bırakmadan yakalamak başardı. (a) emici ve cilt microbiopsies microneedles arasında bir karşılaştırma. (b) uygulama sol tarafından emici ve cilt microbiopsies 5 dk sonra uygulama siteleri. (c, d) Uygulamadan sonra emici ve cilt microbiopsies Microneedles. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Emici microbiopsy daha fazla kan ve 10-s. için uygulandığında RNA örnek yakalanan (a) 10-s sonrası uygulama holding zaman cihaz hemen serbest daha yüksek bir miktar RNA'ın sonuçlandı (n = 20). Hata çubukları temsil S.D. ortalamasını (***p< 0.0001). (b, c) 'Basın Bülteni' ve ' 10-s holding ile uygulamadan sonra emici microbiopsies temsilcisi resimleri ' yaklaşımlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Cilt ve emici microbiopsies arasında mRNA ifade düzeylerinin karşılaştırılması (n = 5). Gen ekspresyonu referans gen RPLP0ile normalleştirilmiş. Hata çubukları temsil S.D. ortalamasını (*p< 0,05). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bu sonuçlar emici microbiopsy basit ve minimal invaziv örnekleme moleküler karakterizasyonu için deri ve kan karışımı için bir araç olarak kullanılabilir gösterilmektedir. Aygıt kullanma bizim protokol uyarınca farklı uygulama protokolleri (şekil 3) ile kurtarılan RNA tutar farkı tarafından gösterildiği gibi güvenilir sonuçlar elde etmek için esastır. Bir kez örnek hulâsa, RNA çıkarılması için adım işleme sonraki örnek kurulan iletişim kuralları15,16' son derece benzerdir. Ayrıca emici microbiopsy için değiştirilmiş ilk adımda RNA ayıklama, başka bir anahtar değişimi RNase free su aşağı akım uygulamaları için sonuçlarını iyileştirmek için kullanılır. Ayrıca, bu çalışmada kullanılan referans gen RPLP0olduğunu kayda değer olduğunu. Kimin işlevi farklı hücre ve doku türleri17için bilinen, RPLP0, Melanom olmayan deri kanserlerinin ve prekanseröz lezyonlar18kullanmak için uygun başvuru gen olarak bildirilmiştir.
Bir aygıtın ana sınırlamaları microbiopsy zaman alır ve potansiyel olarak özellikle RNA gibi hassas örnekleri için örnek kaybı olasılığı artar olan aygıt üzerinden çıkartılmasıdır. Yine de, sorunun tüm steril işlenme aleti, Kuru buz üzerine 2 mL microcentrifuge boruları gibi ön soğutma tarafından üstesinden gelebilir.
Emici microbiopsy kullanımı basittir ve yoğun bir eğitim gerektirmez. Geleneksel biyopsi microbiopsy RT-qPCR gibi kurulan moleküler tanı yöntemleri ile moleküler karakterizasyonu izni olmaksızın gerekli değildir. Daha fazla ölçmek ve emici microbiopsy örnekleme yeteneğini göstermek için RNA çekme--dan insan deri dokusu dahil önceki edebiyat araştırılmıştır. Tipik 3.0 veya 4.0 mm dış görünümden biyopsi yumruk, üç çalışmalar 50'den 200'e değişiyordu ayıklanan RNA tutarları bildirdin ng cilt doku19,20,21mg başına. 1.43 ile karşılaştırarak ng emici microbiopsy ortalama (şekil 3), örneklenen cilt dokularının ağırlığını kurtarıldı RNA'ın 0,29-115 aralığı için beklenen µg cilt punch biyopsi çalışmalar aynı RNA doku oranına dayalı.
Bazı sorunları kolayca üstesinden gelebilir bu protokolü potansiyel tuzaklar değildir. Örneğin, RNA ayıklama veri önemli farklılıklar bile 10-s holding zamanla (şekil 3) önerdi. Bu sorunu çözmek için uygulama protokolü en iyi duruma getirme bir olası çözüm içerir. Parametreleri gücü gibi cilde uygulanan ve test olmalıdır zaman holding ve örnek çıkarma değişimler azaltmak için en iyi duruma getirilmiş. Diğer olası bir sorunu microbiopsy örnek bütünlüğü ve kurtarma etkisi olabilir cihaz, çıkartılmasıdır. Microbiopsy RNA çıkarılması için kaldırma etkili bir yaklaşım olmakla birlikte, yordamın tamamını sıkıcı ve örnek kirlenme sürecinde maruz. Bu nedenle, örnek işlem protokolü değişiklik son derece örnek bütünlüğünü ve örnek kaybını önlemek için arzu edilir.
Yukarıdaki iki konular ele sonra bu cihazın klinik araştırma için standart bir araç haline bekleniyor. Cihazın deri ve kan örneği aynı anda yakalar ve bu dikkate gen ifadesi verileri çözümlerken alınması gereken unutmamak gerekir. Sonuç olarak, bu iletişim kuralı olarak birleştirilmiş deri ve kan örnekleme ve göreli gen ifade profil oluşturma için işleme sonraki örnek için kolay ve minimal invaziv bir araçtır emici microbiopsy gerçekleştirmeyi ayrıntılarını açıklar.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.
Acknowledgments
NHMRC Arkadaş grupları APP1109749 ve APP1111216, Queensland Üniversitesi kuruluşunun yüzüncü yılını kutlayan burs ve uluslararası yüksek lisans araştırma bursu kabul etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
| Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
| Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
| RNA extraction | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
| Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
| cDNA synthesis | |||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
| qPCR reaction and data analysis | |||
| SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
| GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
| PCR primers | |||
| RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
| RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
| TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
| TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
| KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
| KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
| CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
| CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
| CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
| CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |
References
- Wang, C. Y., Maibach, H. I. Why minimally invasive skin sampling techniques? A bright scientific future. Cutaneous and Ocular Toxicology. 30, 1-6 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L. The skin microbiopsy. , The University of Queensland. (2015).
- Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134, 362-372 (2014).
- Chapman, P. B., et al. Improved Survival with Vemurafenib in Melanoma with BRAF V600E Mutation. New England Journal of Medicine. 364, 2507-2516 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L., et al. Microbiopsy engineered for minimally invasive and suture-free sub-millimetre skin sampling. F1000Research. 2, (2013).
- Tom, L. N., et al. Skin microbiopsy for HPV DNA detection in cutaneous warts. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 30, e216-e217 (2016).
- Sobarun, P., et al. Microbiopsy Biomarker Profiling in a Superficial Melanoma Resembling a Pigmented Basal Cell Carcinoma. JAMA Dermatology. 153, 334 (2017).
- Banan, P., Lin, L. L., Lambie, D., Prow, T., Soyer, H. P. Effects of Ex Vivo Skin Microbiopsy on Histopathologic Diagnosis in Melanocytic Skin Lesions. JAMA Dermatology. 149, 1107 (2013).
- GraphPad, GraphPad - FAQ 1753 - Prism 3 -- Calculating "Unknown" Concentrations using a Standard Curve. , Available from: https://www.graphpad.com/support/faq/prism-3-calculating-unknown-concentrations-using-a-standard-curve/ (2018).
- Kubista, M., et al.
- Goni, R., García, P., Foissac, S. The qPCR data statistical analysis. , 1-9 (2009).
- GraphPad Statistics Guide. , (1995).
- Goldstein, N. B., et al. Isolating RNA from precursor and mature melanocytes from human vitiligo and normal skin using laser capture microdissection. Experimental dermatology. 25, 805-811 (2016).
- Shearstone, J. R., Allaire, N. E., Campos-Rivera, J., Rao, S., Perrin, S. Accurate and precise transcriptional profiles from 50 pg of total RNA or 100 flow-sorted primary lymphocytes. Genomics. 88, 111-121 (2006).
- Bär, M., Bär, D., Lehmann, B. Selection and Validation of Candidate Housekeeping Genes for Studies of Human Keratinocytes-Review and Recommendations. Journal of Investigative Dermatology. 129, 535-537 (2009).
- Hoang, V. L. T., et al. RNA-seq reveals more consistent reference genes for gene expression studies in human non-melanoma skin cancers. PeerJ. 5, e3631 (2017).
- Döbbeling, U. Simultaneous RNA and DNA Extraction from Biopsy Material, Culture Cells, Plants, and Bacteria. Nucleic Acid Protocols Handbook, The. , Humana Press. 53-56 (2000).
- Bruning, O., et al. RNA isolation for transcriptomics of human and mouse small skin biopsies. BMC Research Notes. 4, 438 (2011).
- Berglund, S. R., et al. Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies. Journal of Investigative Dermatology. 127, 349-353 (2007).
