Summary
이 문서에서는, 흡수 성 microbiopsy 기술을 수행 하는 방법 및 어떻게 샘플에서에서 사용할 수 있습니다 피부와 혈액의 간단 하 고 동시 샘플링에 대 한 RNA 추출에 대 한 최소 침 습 방식으로 보여 줍니다.
Abstract
기존의 피부 생 검 임상 연구 관련 cosmetically 민감한 부분 또는 그것의 침입으로 인해 소아 응용 프로그램 제한 합니다. 여기, 우리 피부와 혈액 혼합물의 최소 침 습 샘플링에 대 한 흡수 성 미세 바늘 기반 장치, 흡수 성 microbiopsy를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 목표는 임상 연구, 임상 연구 참가자에 대 한 위험을 감소 하 고 피부 질환에 대 한 생체의 설립에에서 급속 한 진행을 촉진 하는 데 도움이. 기존의 피부 생 검 기술, 달리 흡수 성 microbiopsy 초 이내에 수행할 수 있습니다 그리고 그것의 간단한 설계 집중 훈련을 필요로 하지 않습니다. 이 보고서에서 우리는 흡수 성 microbiopsy, 로드 및 응용 프로그램, 자원 봉사자 등의 사용을 설명 합니다. 다음, 우리는 흡수 샘플에서 RNA를 분리 하는 방법을 보여 줍니다. 마지막으로, 양이 많은 반전 녹음 방송 PCR (RT-정량) mRNA 식 수준 혈액 (CD3E 와 CD19)과 피부 (KRT14 및 TYR)의 척도 사용 하 여를 설명 합니다. 우리가 설명 하는 방법을 선반 장비 및 시 약을 사용 합니다. 이 프로토콜 피부와 같은 흡수 성 microbiopsy 매트릭스 내에서 혈액의 동시 샘플링에 대 한 최소한 침략 적 접근을 제안 한다. 우리는 인간의 윤리 위원회, 임상 및 자원 봉사자가 피부과 연구이 접근의 지지를 발견 했다.
Introduction
피부 생 검 후속 진단 histopathological 평가 통해 피부 질환 및 피부 샘플링에 대 한 피부과에서 가장 필수적인 기술 중 하나입니다. 생 검 기술은 블레이드 또는 펀치 생 검 검사1에 대 한 환자의 피부에 의심 스러운 병 변 제거를 사용 하 여 의료 전문가 포함 한다. 기술은 효과적 이다, 하지만 매우 침략 적 하 고 끝점은 일반적으로 분자 생물학 기법2,3관련 된 임상 연구를 제한 합니다. 피부 질환의 분자 분석은 histopathological 분석 수 없습니다, 따라서 촉진 약물 발견과 질병 진단4,5매우 특정 생물 학적 정보를 제공할 가능성이 있다. 게다가, 가장 분자 기법에서 샘플 수요는 비교적 작은 수 있습니다 동물 사용에서 감소로 이어질 고 많은 수의 복제를 허용. 따라서, 거기는 명확한 임상 연구에 분자 분석을 가능 하 게 하 고 참가자에 대 한 위험을 낮춘 다는 대체 기술에 대 한 필요.
필드에 이러한 필요를 해결 하기 위해 우리의 그룹 소설 microneedle 기반 진단 플랫폼, 흡수 성 microbiopsy, 피부 간단 하 고 최소 침 습 방식으로6에 피가 섞인의 작은 금액의 수집을 가능 하 게 개발 했다. 이 간행물의 목적은 임상 연구에서 RNA 추출 통해 분자 분석을 촉진 하는 샘플링 도구로 흡수 성 microbiopsy를 설명 하기 위해.
이전에, 우리는 microbiopsy, 피부 조직7의 작은 조각을 추출 하는 3 층 강판 디자인의 미세 바늘으로 구성 되어 피부 microbiopsy의 첫 번째 버전을 설명 했습니다. 이 소자의 참신 효율적인 조직 추출3허용 microneedle에서 여러 접점에서 온다. 반면, 원형 피부 펀치 생 검 단 하나의 접점을 제공 하 고 어떤 경우에 어떤 샘플을 캡처 없이 피부를 단순히 눈물. 피부 microbiopsy을 바탕으로, 우리 최근 흡수 성 microbiopsy 피와 피부 샘플링 기능을 개발 했다. 장치 최근 역학 연구6자원이 부족 한 지역에 사용 하기 위해 실현 되도록 표시 되었습니다.
그것의 간단한 설계, 흡수 성 microbiopsy 몇 초 이내에 수행할 수 있습니다 하 고 광범위 한 훈련을 필요로 하지 않습니다. 또한, 로컬 마 취가 필요 하지 않습니다, 그리고 응용 프로그램 사이트에 흉터가 발생 하지 않습니다. 현재 프로토콜 관련 샘플링 대상된 피부 분자 분석에 대 한 데이터를 얻기 위해 교육 없이 연구원 또는 의료 전문가 수 있습니다. 우리는 피부 연구에 루틴을 미래에 될 microsampling 장치를 기대 합니다.
Microbiopsy는 분자 진단 기술6,,89,10, 인간 유 두 종 바이러스 DNA 탐지,이 프로토콜에 관련 된 다른 피부 질환 연구에 보고 되어 샘플 추출 및 처리 기술을 흡수 성 microbiopsy에 대 한 세부 정보를 설명 하기 위해 처음이 이다. 또한, 이것은 피부 및 microbiopsy 샘플에서 혈액 세포의 상대 진 식 프로 파일링 설명 첫 번째 보고서 이다.
Protocol
연구는 지하철 남쪽 인간 연구 윤리 위원회 및 대학의 퀸즐랜드 인간의 연구 윤리 위원회 (HREC-13-QPAH-551 및 UQ2013001551) 및 대학의 사우스 오스트레일리아 인간의 윤리 위원회 (200607)에 의해 승인 되었다.
1. 흡수 성 Microbiopsy 제조
- 레이저 각각 50 µ m 의료 학년 스테인레스 스틸 시트 및 흡수 성 레이어 (지), 미세 바늘 부분을 잘라 (그림 1).
참고: 플런저와 소자의 경우를 포함 하 여 다른 부분 3D 인쇄와 같은 급속 한-프로토 타입 기술로 조작 됩니다. - 공기 건조 30 분 후와 5 분 동안 70% 에탄올 (EtOH)에서 흡수 성 레이어를 제외한 모든 부분을 담근 다.
- (그림 1a) 중간에 흡수 층으로 3 층 미세 바늘을 조립.
- 플런저의 슬릿에 조립된 미세 바늘을 삽입 합니다.
- 봄에 넣고 경우 (그림 1c)에 플런저를 삽입. 바늘 질을 보장 하기 위해 조립 절차에 만지기 microneedle을 하지 마십시오.
- 사용 하기 전에 γ 방사선 살 균에 대 한 패키지 조립된 흡수 성 microbiopsy 인감.
2입니다. 흡수 성 Microbiopsy 샘플링
- 일회용 장갑, 그리고 스프레이 손과 도구를 70%로 겸 등 착용 EtOH.
- 알코올 닦아 응용 프로그램 사이트를 청소.
- 과정에서 미세 바늘을 건드리지 않고는 γ 방사선 멸 균 패키지에 microbiopsy를 제거 합니다.
- 때까지 '클릭' 소리 봄, 플런저 자물쇠 장소에 압축을 플런저를 당겨 장치를 로드 합니다.
- 샘플링 영역 고정된 위치에 되도록 샘플 수를 피부에 장치를 목표로 합니다.
- 장치는 피부에 수직으로 약 인지 확인 다음 피부에 장치에 힘의 ≥1 kg을 적용 합니다.
참고: 아래쪽 피부에 힘을 적용 해야는 미세 바늘의 충분 한 침투를 보장 합니다. - 방 아 쇠를 누르고 장치 최소 10 자리에 흡수 될 혈액 샘플에 대 한 s.
참고: 장치 10 전에 해제 되 면 s, 캡처한 적은 샘플입니다.
3. RNA 추출
참고: RNA 추출 절차는 microbiopsied 샘플에서 RNA의 최적의 절연에 대 한 제조 업체의 프로토콜에서 수정 되었다. 달리 명시 되지 않는 한 모든 시 약 및 RNA 추출에 사용 되는 열 키트에 포함 되어 있습니다.
- 당겨 플런저 및 흡수 성 미세 바늘 케이스에서 밖으로 손을 부드럽게. 제거 하는 동안에 미세 바늘의 팁 아무것도 접촉으로 제공 되지 않습니다 확인 하십시오.
- 플런저에서 흡수 성 미세 바늘을 제거 합니다. 소독 집게의 쌍은 미세 바늘에 두 개의 구멍에 누른 그것을 꺼내.
- 2 mL microcentrifuge 튜브에 그대로 미세 바늘을 넣어 (RNA 격리 키트;에서 재료의 표참조) 하단 쪽으로 바늘 면 추출 버퍼의 50 µ L로 prefilled. 샘플 손실을 최소화 하기 위해 샘플을 처리 하기 전에 5 분 동안 드라이 아이스에 튜브를 둡니다.
- 소용돌이 짧게 (3-5 s) 끝에서 샘플된 자료의 일부를 제거 하.
- 42 ° c.에 30 분 동안 로커에 튜브에서 미세 바늘을 품 어
참고: 버퍼 솔루션 흡수 됩니다 흡수 층으로 즉시. - 소독 집게를 사용 하 여 2 mL microfuge 관의 위쪽 가장자리와 미세 바늘 (바늘에서 반대 측) 레벨의 상단 부분을 배치 합니다.
- 미세 바늘의 상단 캡과 튜브 사이에 개최 되는 튜브의 뚜껑을 닫습니다.
- 튜브 또는 최대 속도 30 g x 16, 000에서 스핀 소자의 흡수 층에서 샘플된 자료를 제거 하는 s.
- 제거는 microneedle 신중 하 게 집게로 다시 버퍼 솔루션에 담 그 기 없이. 튜브를 유지 하 고는 미세 바늘을 삭제.
- 원심에서 3000 x g 2 분 피 펫에 대 한 샘플 신중 하 게 새로운 microcentrifuge 관으로 추출 된 RNA를 포함 하는 상쾌한.
- 정화 열 필터 멤브레인에 컨디셔닝 버퍼의 250 µ L을 추가 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 열 g x 16, 000 또는 1 분에 최대 속도로 컬렉션 튜브에 원심
- 70%의 50 µ L 추가 EtOH 단계 3.9에서 수집 된 샘플으로. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 잘 섞는다.
- Preconditioned 정화 열에 혼합물 (~ 100 µ L)를 전송 합니다.
- 30 16000 x g에서 원심 분리 뒤 즉시, 100 x g에서 2 분 동안 원심 분리기 통해 흐름을 제거 하는 s.
- 8000 x g에서 정화 열과 1 분 동안 원심 분리기에 워시 버퍼 1 (W1) 100 µ L를 추가 합니다.
- 나 별도 microcentrifuge에 버퍼 RDD의 35 µ L 재고 솔루션 각 샘플에 대 한 튜브 DNase의 5 µ L을 추가 하 여 DNase 솔루션을 준비 합니다. 부드럽게 반전에 의해 혼합.
참고: DNase 치료 않고 수행 될 정화 열에 PCR 접시에 나중에, 샘플의 수량 때문에 것입니다. - 정화 열 막에 직접 DNase 인큐베이션 믹스의 40 µ L를 추가 합니다. 15 분 동안 실 온에서 품 어.
- 정화 열 막으로 W1의 40 µ L를 추가 합니다. 15 8000 x g에서 원심 분리기 s.
- DNase 치료 후 8000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기 정화 열에 워시 버퍼 2 (W2) 100 µ L를 플라스틱.
- 정화 열에 W2의 또 다른 100 µ L을 추가 하 고 16000 x g. 확인 모든 잔여 워시 버퍼에 대 한 정화 열에서 2 분 동안 원심. 어떤 워시 버퍼가 남아 있으면 다시 1 분 동안 16000 x g에서 원심.
- 키트에 제공 된 새로운 0.5 mL microcentrifuge 관을 정화 열을 전송.
- RNase 무료 물 (RNA 격리 키트에 제공 되지 않음), 차입 버퍼 (EB) 대신 정화 열의 막에 직접 11 µ L 플라스틱 부드럽게 RNase 무료 물 막으로 RNase 무료 물의 최대 흡수 되도록 분배 하는 동안 막의 표면에 피 펫의 끝을 터치 합니다. 2 분 동안 실 온에서 품 어.
- 1000 x g 열에서 RNase 무료 물 배포 다음 16000 x g elute RNA를 1 분에 대 한 원심에 1 분 동안 열 원심
참고: RNA 정량화는 샘플의 작은 수량으로 인해 권장 하지 않습니다. - 중지 포인트 #1: cDNA 합성 즉시 수행 되지 않은 경우-80 ° C에서 총 RNA 샘플을 저장.
참고:는 RNA 샘플의 낮은 농도 주어진 경우 필요 하지 않은 고정 하지 마십시오.
4입니다. cDNA 합성
- (단계 3.25)에서 얼음에 냉동된 샘플 녹여
- 다음 절차에 따라 cDNA 합성 키트 총 RNA 로부터 cDNA를 음성 합성.
- 반응 혼합 준비: 총 RNA, TransAmp 버퍼, 역전사의 1 µ L, DNase/RNase 무료 물 4 µ L x 5의 4 µ L의 11 µ L. 부드럽게 pipetting으로 혼합.
- 열 cycler 기구에 반전 녹음 방송 실행: 10 분, 15 분 동안 42 ° C 25 ° C에서 85 ° C 5 분 최종 역전사 비활성화 단계 뒤.
- 중지 포인트 #2:-80 ° C에서 역방향 베낀된 샘플 사용까지 저장.
5. 정량 반응 및 데이터 분석
참고: 정량 Pcr 반응 위한 뇌관 intron 경계 NCBI 뇌관 폭발 (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 사용 하 여 게놈 DNA의 증폭을 피하기 위해 되도록 설계 되었습니다. 이 연구에 사용 된 참조 유전자는 RPLP0 (에 대 한 자세한 토론 섹션 참조).
- (단계 4.5)에서 얼음에 냉동된 샘플 녹여
- 아래 절차에 따라 정량 마스터 믹스 키트와 함께 정량 Pcr을 수행 합니다.
- 반응 당 다음을 포함 하는 마스터 믹스 준비: 2 x qPCR 반응 혼합, 10 µ M 앞으로 뇌관, 10 µ M 역 뇌관의 0.4 µ L, 2.2 µ L DNase 무료 물 0.4 µ L의 5 µ L. 부드럽게 pipetting으로 혼합. Triplicates에서 예제를 설정 합니다.
- 384-잘 PCR 플레이트 첫번째와 2 µ L 각 샘플 (잘 당 10 µ L의 총)에서 cDNA의의 각 음에 마스터 믹스의 8 µ L 플라스틱
참고: 서식 파일 제어 (NTC)와 역전사 제어 (-RT) 부정적인 컨트롤로 포함 되어 있습니다. - 접착 필름, 접시를 봉인 하 고 짧게 원심.
- 증폭 반응 실시간 열 cycler에 실행: 5 95 ° C의 40 주기 다음 2 분 (중 합 효소 활성화), 95 ° C s (변성), 10 60 ° C (열 처리) s와 10 위한 72 ° C s (확장).
- 알려진된 농도와 템플릿에서 준비 표준 곡선에서 보간에 의해 샘플의 RNA 농도 계산 합니다.
- 소프트웨어에는 새 실험 을 만듭니다.
- 정 및 기준을 설정 직렬 희석 번호판에 대 한 설정을 클릭 합니다.
- 선택 하 고 표준 및 샘플에 대 한 우물을 정렬. 적용을 클릭 합니다.
- 표준 곡선을 평가 하기 위해 결과 탭에서 분석 을 클릭 합니다. 기울기, R2 값을 확인 하, 증폭 효율과 오류 실험 기준을 충족.
- Ct 값에 따라 표준 곡선에 시각적으로 알 수 없는 샘플의 수량을 확인 합니다.
참고: 표준 곡선, 희석 비율의 선택 등의 건설 게시 프로토콜11,,1213에 따라 수행 됩니다.
- (Ct refence 유전자 정규화) ΔCt 메서드를 사용 하 여 유전자의 mRNA 표정 분석을 수행 합니다.
- ΔCt 값을 가져오는 참조 유전자의 Ct 값에서 대상 유전자의 Ct 값을 뺍니다.
- 기술 복제의 ΔCt 값을 평균입니다.
- 플롯 및 통계 소프트웨어11,14 유전자 발현 분석 ( 재료의 표참조).
참고: 또는 유전자 표정 분석 게시 프로토콜13에 따라 수행 됩니다.
Representative Results
우리는 이전 피부 microbiopsy의 미세 바늘 침투 피부 약 500 µ m 깊은7을 보고 있다. 피부 microbiopsy의 미세 바늘 디자인 흡수 성 microbiopsy (그림 2a)에 대 한 매우 비슷합니다. 피 흡수에 대 한 중간에 흡수 성 층 흡수 성 microbiopsy에 의하여 이루어져 있다, 하는 동안 피부 microbiopsy 피부 조직의 기계적 캡처에 대 한 채널을 포함. 흡수 성 레이어를 사용 하 여 또한 이끌어 냈다 microneedle 차원에서 약간의 차이 (흡수 성: 1.50 x 0.50 x 0.21 m m vs 피부: 1.50 x 0.50 x 0.15 m m).
그림 2b 흡수 후 응용 프로그램 사이트 5 분을 보여줍니다 및 피부 microbiopsies 남성 자원 봉사자의 volar 왼쪽된 팔에 적용 했다. 두 개의 microneedle 디자인 간의 유사성으로 인해 두 장치에서 응용 프로그램 사이트 비교, 작은 홍 반으로 했다. 두 응용 프로그램 사이트 뒤에 아무 흉터 왼쪽 48 h 후 눈에 띄는 되지 않았다. 이이 최소한 침략 적 장치는 여러 응용 프로그램 사이트를 화면 하거나 정기적으로 수행 하는 가설을 지원 합니다.
그림 2 c 자원 봉사 남자의 volar 팔에 적용 되 고 후 흡수 microbiopsy의 흡수 성 층의 대표적인 그림을 보여줍니다. 피부에 대 한 몇 가지 작은 조각, 미세 바늘의 팁 근처 캡처된 그림 같이 그리고 일부 혈액 필터 종이에 흡수 되었다. 이 장치는 피부에 침투 하 고 피부와 같은 흡수 성 microbiopsy 매트릭스 내에서 동시에 혈액 나타냅니다. 그림 2d 보여줍니다 후 샘플링 피부 microbiopsy, 비교를 위해 microbiopsy의 이전 세대. 피부 microbiopsy의 채널 캡처, 피부의 작은 조각을 하지만 미세 바늘에 혈액의 양을 흡수 성 microbiopsy에 상대적으로 작은. 두 응용 프로그램 사이트 48 h 내 눈에 띄는 되지 않았다. 실험에서 흡수 성 microbiopsy 10의 개최와 함께 적용 된 후 응용 프로그램, 피부 동안 microbiopsy 즉시 이후에 릴리스된 디자인 차이로 인해 적용.
그림 3a같이 흡수 microbiopsy의 2 개 그룹 응용 프로그램 프로토콜에 따라이 실험에 참여 했다: '속보'와 ' 10의 지주 '. '속보' 그룹에 대 한 장치는 장치 응용 프로그램 사이트에서 신청 후 즉시 제거 되 고 동일한 원래 피부 microbiopsy 프로토콜을 사용 하 여 적용 되었다. 10 ' s 지주에 대 한 ' 그룹, 장치에서에서 열렸다 장소 10에 대 한 응용 프로그램 후 샘플 컬렉션을 개선 하는 s. 흡수 성 microbiopsy의 2 개 그룹 응용 프로그램 접근 샘플 금액에 영향을 미칠 수 어떻게 보여 주기 위해 설치 되었다. 10의 처리 시간 응용 프로그램 시간 복구 샘플의 크기에 영향을 보여 임상적으로 적절 한 시간으로 선정 되었다.
RNA의 양이 되었고 '속보' 0.33 0.39 ± ng 1.43 ± 0.88 ng ' 10의 지주에 대 한 두 개의 흡수 성 microbiopsy 그룹에서 회복 ' (그림 3a, n = 20), 추가 처리 시간을 4-fold 증가 제안. 이 더 많은 RNA 추출 결과 10-s 보유 시간 흡수 장치 적용을 나타냅니다. 차이 흡수 성 레이어 (그림 3c)에서 증가 혈액 샘플의 존재 때문일 수 있습니다. 실제로, '속보' 그룹 (그림 3b) ' 10-s 지주에 비해 흡수 층으로 혈액의 비슷한 금액을 수집 하지 못했습니다 ' 그룹 (그림 3c). 그것은 대부분은 즉시 출시 microbiopsies 제안 하는 그들은 부정적인 이벤트 또는 RNA의 매우 낮은 금액을 표시 하는 x 축에 가까운 했다 주목 해야한다. 따라서, 결과 처리 시간 소자의 성능에 영향을 미칠 혈액 흡수 층에 의해 흡수 될 시간이 걸릴 수 있습니다으로 가설 검증.
장치는 혈액 및 피부 샘플링 설계 되었다, 이후 정량 비교를 위해 두 장치에 대 한 피부와 혈액 biomarkers의 식을 감지 하 사용 되었다. 우리 melanocytes와 keratinocytes 가능한 표 피에 대 한 biomarker로 KRT14 에 대 한 바이오 마커 tyrosinase, TYR, 사용. 피부 microbiopsy 샘플 비교 실험에 포함 됐다. 그림 4에 표시 된, 비록 피부와 흡수 성 microbiopsies는 디자인, 차이로 인해 다르게 적용 된 식 레벨 모두 피부 생체 TYR 와 KRT14 에 표시 된 대로 두 장치에 대 한 비교 했다는 데이터입니다. 흰색 혈액 세포 생체 (CD3E, T 세포와 CD19, B 세포) 피부 microbiopsy 예제에서 보다 흡수 성 microbiopsy 예제에서 더 널리 퍼진 것을 발견 했다. 이 결과 제안 흡수 성 microbiopsy 혈액 수집에 더 나은 수행 하지만 여전히 피부에 비해 피부 microbiopsy 캡처에 대 한 용량을 유지 (n = 5).
그림 1입니다. 흡수 성 microbiopsy의 제조. (a) 3 층 미세 바늘입니다. (장치의 b) 모든 부분입니다. (c) 조립된 흡수 성 microbiopsy입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 흡수 성 microbiopsy 남성 자원 봉사자의 volar 왼쪽된 팔에 흉터를 남기지 않고 동시에 피부와 혈액 샘플을 캡처할 수 있었다. (a) 흡수 성 및 피부 microbiopsies의 바늘 사이 비교. (b) 응용 프로그램 신청 후 흡수 성 및 피부 microbiopsies 5 분에 의해 왼쪽 사이트. (c, d) 신청 후 흡수 성 및 피부 microbiopsies의 바늘입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 흡수 성 microbiopsy 캡처 더 많은 혈액과 10 미에 대 한 적용 될 때 RNA 샘플 (장치를 즉시 발표 보다 RNA의 다량 귀착되 었 다 a) 10-s 후 응용 프로그램 처리 시간 (n = 20). 오차 막대는 뜻에서 사 우 스 다코타를 나타내는 (* * *p< 0.0001). (b의 c) '속보'와 ' 10의 지주 신청 후 흡수 microbiopsies의 대표 사진을 ' 접근. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 피부와 흡수 성 microbiopsies 사이 mRNA 식 레벨의 비교 (n = 5). 유전자 발현 참조 유전자 RPLP0와 정규화 되었습니다 했다. 오차 막대는 뜻에서 사 우 스 다코타를 나타내는 (*p< 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 결과 분자 특성에 대 한 피부와 혈액 혼합물의 간단 하 고 최소한 침략 적 샘플링에 대 한 흡수 성 microbiopsy 도구로 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 우리의 프로토콜에 따라 장치 응용 프로그램은 다른 응용 프로그램 프로토콜 (그림 3)를 사용 하 여 복구할 RNA 금액에 차이 의해와 같이 신뢰할 수 있는 결과 얻기 위해 필수적. 샘플 추출 되 면 RNA 추출에 대 한 단계를 처리 하는 다음 샘플은 설립된 프로토콜15,16와 매우 비슷합니다. 게다가 초기 단계에서 RNA 추출 흡수 성 microbiopsy에 대 한 수정, 또 다른 주요 변화 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 결과 개선 하기 위해 RNase 무료 물의 사용 이다. 또한,이 연구에 사용 된 참조 유전자 RPLP0는 언급 가치가 있다.입니다. RPLP0, 그 함수는 다른 세포와 조직 유형17, 비 흑색 종 피부 암 및 전 암 병 변18에 사용 하기 위해 적합 한 참조 유전자로 보고 되었습니다.
소자의 주요 한계 중 하나는 시간이 많이 걸리는 이며 잠재적으로 샘플 손실, 특히 RNA 같은 민감한 샘플의 기회를 증가 장치에서 microbiopsy의 제거 이다. 그럼에도 불구 하 고, 문제는 미리 2 mL microcentrifuge 튜브 드라이 아이스 등 모든 살 균 처리 도구, 냉각에 의해 극복할 수 있습니다.
흡수 성 microbiopsy 사용 하 여 간단 하 고 집중적인 훈련을 필요로 하지 않습니다. 기존의 생 microbiopsy 허용 설립된 분자 진단 기법, 실시간 정량 Pcr 등 분자 특성으로 필요 하지 않습니다. 추가 계량 하 고 흡수 성 microbiopsy의 샘플링 능력, 인간의 피부 조직에서 RNA 추출 관련 이전 문학 조사 했다. 3 연구 50에서 200에 배열 했다 추출 된 RNA 금액 보고, 전형적인 3.0 또는 4.0 m m 스킨에서 펀치 생 검 피부 조직19,,2021밀리 그램 당 ng. 비교는 1.43 평균 (그림 3), 샘플된 피부 조직의 무게에 흡수 성 microbiopsy에서 복구 된 RNA의 ng 0.29-115에서 범위 것으로 예상 된다 µ g 피부 펀치 생 검 연구에서 동일한 RNA 조직의 비율에 따라.
이 프로토콜은 아니다 잠재적인 함정 없이 문제 들을 쉽게 극복 될 수 있다. 예를 들어 RNA 추출 데이터 10의 보유 시간 (그림 3)와 상당한 변이 제안 했다. 문제를 해결 하려면 하나의 잠재적인 솔루션 응용 프로그램 프로토콜 최적화 포함 됩니다. 힘 등 피부에 적용 하 고 시간 잡고 해야 테스트 하 고 샘플 추출에 변화를 줄이기 위해 최적화. 다른 잠재적인 문제는 샘플 무결성 및 복구에 영향을 줄 수 있는 장치에서 microbiopsy의 제거. 비록 RNA 추출에 대 한 microbiopsy를 제거 하는 것은 효과적인 접근, 전체 절차는 지루한, 그리고 샘플 과정에서 오염에 노출 될 수 있습니다. 따라서, 샘플 처리 프로토콜의 수정 샘플 무결성 보장 및 샘플 손실을 방지 하기 위해 원하는 높은 이다.
위의 두 가지 문제 해결은 일단 장치 임상 연구를 위한 표준 도구가 될 것입니다 예상 된다. 장치는 동시에 피부와 혈액 샘플을 캡처 및이 수 고려 한다 유전자 표현 데이터를 분석할 때 중요 하다. 결론적으로,이 프로토콜 결합 된 피부와 혈액 샘플링 및 상대 진 식 프로 파일링에 대 한 처리 이후 샘플에 대 한 간단 하 고 최소한 침략 적 도구로 흡수 성 microbiopsy을 수행의 세부 사항을 설명 합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언.
Acknowledgments
우리는 NHMRC 동호회 APP1109749 및 APP1111216, 퀸즐랜드의 대학 센테니얼 장학금 및 국제 대학원 연구 장학금을 인정 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
| Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
| Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
| RNA extraction | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
| Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
| cDNA synthesis | |||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
| qPCR reaction and data analysis | |||
| SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
| GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
| PCR primers | |||
| RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
| RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
| TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
| TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
| KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
| KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
| CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
| CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
| CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
| CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |
References
- Wang, C. Y., Maibach, H. I. Why minimally invasive skin sampling techniques? A bright scientific future. Cutaneous and Ocular Toxicology. 30, 1-6 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L. The skin microbiopsy. , The University of Queensland. (2015).
- Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134, 362-372 (2014).
- Chapman, P. B., et al. Improved Survival with Vemurafenib in Melanoma with BRAF V600E Mutation. New England Journal of Medicine. 364, 2507-2516 (2011).
- Kirstein, O. D., et al. Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani. International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).
- Lin, L. L., et al. Microbiopsy engineered for minimally invasive and suture-free sub-millimetre skin sampling. F1000Research. 2, (2013).
- Tom, L. N., et al. Skin microbiopsy for HPV DNA detection in cutaneous warts. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 30, e216-e217 (2016).
- Sobarun, P., et al. Microbiopsy Biomarker Profiling in a Superficial Melanoma Resembling a Pigmented Basal Cell Carcinoma. JAMA Dermatology. 153, 334 (2017).
- Banan, P., Lin, L. L., Lambie, D., Prow, T., Soyer, H. P. Effects of Ex Vivo Skin Microbiopsy on Histopathologic Diagnosis in Melanocytic Skin Lesions. JAMA Dermatology. 149, 1107 (2013).
- GraphPad, GraphPad - FAQ 1753 - Prism 3 -- Calculating "Unknown" Concentrations using a Standard Curve. , Available from: https://www.graphpad.com/support/faq/prism-3-calculating-unknown-concentrations-using-a-standard-curve/ (2018).
- Kubista, M., et al.
- Goni, R., García, P., Foissac, S. The qPCR data statistical analysis. , 1-9 (2009).
- GraphPad Statistics Guide. , (1995).
- Goldstein, N. B., et al. Isolating RNA from precursor and mature melanocytes from human vitiligo and normal skin using laser capture microdissection. Experimental dermatology. 25, 805-811 (2016).
- Shearstone, J. R., Allaire, N. E., Campos-Rivera, J., Rao, S., Perrin, S. Accurate and precise transcriptional profiles from 50 pg of total RNA or 100 flow-sorted primary lymphocytes. Genomics. 88, 111-121 (2006).
- Bär, M., Bär, D., Lehmann, B. Selection and Validation of Candidate Housekeeping Genes for Studies of Human Keratinocytes-Review and Recommendations. Journal of Investigative Dermatology. 129, 535-537 (2009).
- Hoang, V. L. T., et al. RNA-seq reveals more consistent reference genes for gene expression studies in human non-melanoma skin cancers. PeerJ. 5, e3631 (2017).
- Döbbeling, U. Simultaneous RNA and DNA Extraction from Biopsy Material, Culture Cells, Plants, and Bacteria. Nucleic Acid Protocols Handbook, The. , Humana Press. 53-56 (2000).
- Bruning, O., et al. RNA isolation for transcriptomics of human and mouse small skin biopsies. BMC Research Notes. 4, 438 (2011).
- Berglund, S. R., et al. Optimized Methodology for Sequential Extraction of RNA and Protein from Small Human Skin Biopsies. Journal of Investigative Dermatology. 127, 349-353 (2007).
