Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

استخدام مسببات الأمراض بكتيرية للتحقيق لاستجابات المضيف الخلوية ومستوى أورجانيسميك

Published: February 22, 2019 doi: 10.3791/58775
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois College of Medicine

Summary

ونحن تصف كلا فحوصات الإصابة في المختبر وفي الحية التي يمكن استخدامها لتحليل أنشطة العوامل المضيفة-ترميز.

Abstract

وهناك مجموعة متنوعة من استراتيجيات توظيف مسببات الأمراض البكتيرية البقاء على قيد الحياة وتتكاثر مرة واحدة داخل الخلية حقيقية النواة. مسببات الأمراض ما يسمى 'سيتوسوليك' (الليستريه المستوحدة، فليكسنيري دوسنتارياو بوركهولدريا pseudomallei، فرانسيسيلا تولارنسيسو الريكتسية spp.) الوصول إلى سيتوسول الخلية المصابة بها جسديا وانزيماتيكالي اللاإنسانية الغشاء فاكولار الأولية. مرة واحدة في سيتوسول، هذه العوامل الممرضة سواء تتكاثر، فضلا عن إنشاء قوات ميكانيكية كافية لاختراق غشاء بلازما الخلية المضيفة لتصيب خلايا جديدة. وهنا نعرض كيف يمكن قياس التدفق الخلوي بتشكيل مستعمرة فحوصات وحدة هذه الخطوة المحطة الطرفية دورة العدوى الخلوية لام الليستريه (Lm) وإعطاء أمثلة عن كيف كلا تأثير العوامل الخاصة بالعوامل الممرضة والمضيفة المشفرة هذه عملية. نعرض أيضا إصابة تناظر وثيق Lm العدوى ديناميات الخلايا المزروعة في المختبر وتلك الخلايا الكبدية المستمدة من الفئران المصابة المجراة. هذه الاختبارات الدالة على أساس بسيط نسبيا ويمكن الارتقاء بسهولة للقائم على اكتشاف شاشات الفائق للتضمين وظيفة الخلية حقيقية النواة.

Introduction

نماذج تجريبية على أساس الإصابة بطبيعتها صعبة بسبب اعتمادها على ظروف انطلاق الدولة المضيفة والممرض ومختلف الاستراتيجيات الإصابة بمسببات المرض وصعوبة إسناد العمليات يحركها العوامل الممرضة والمضيفة استناداً إلى النتائج. بكتيريا الليستريه المستوحدة (Lm) قد أصبح ممرض مثالي سبر ردود الدفاع المضيف بسبب لها الصوبة الوراثية والميكروبيولوجية واستراتيجيتها للعدوى الخلوي السريع وبروسيسيفي وواضحة نسبيا العلاقة بين تعمل العدوى المستوى الخلوي وأورجانيسميك به. العدوى الخلوية من Lm العائدات من خلال أربع مراحل متميزة1: (ط) غزو الهاتف الخلوي الذي يختتم Lm يجري المحاطة المنقبضة؛ (ثانيا) Lm-توجه انحلال الغشاء المنقبضة وإطلاق Lm في سيتوسول؛ (ثالثا) النسخ المتماثل إينتراسيتوسوليك؛ واختراق غشاء البلازما تنتج أما العدوى من الخلايا المجاورة مباشرة (مثل ورقة الظهارية)، أو في زنزانات انفرادية، إطلاق سراح Lm في الوسط خارج الخلية الجسدية (رابعا). كل مرحلة من هذه المراحل التي تروجها محددة Lm-ترميز العوامل (يشار إليها على أنها 'عوامل الفوعة')، عند حذف، يسبب تشوهات العدوى في النماذج الخلوية والحيوانات على حد سواء. هذه الاستراتيجية العامة العدوى تطورت بشكل مستقل بعدد من العوامل الممرضة 'سيتوسوليك' ما يسمى2.

تشكيل مستعمرة فحوصات وحدة (زيمبابوي) تستخدم على نطاق واسع لتقييم سواء في المختبر (أي الخلوية) كذلك كما في الحية (أي، أورجانيسميك) نتائج الإصابة. بالإضافة إلى حساسيتها عالية، خاصة بالنسبة للإصابات في المجراة، توفير فحوصات زيمبابوي قراءات لا لبس فيها لغزو العوامل الممرضة والبقاء على قيد الحياة/الانتشار داخل الخلايا. فحوصات زيمبابوي قد استخدمت على نطاق واسع لتحليل المحددات خلية Lm والمضيفة التي تؤثر على الإصابة. وكانت هذه الدراسات السابقة لتحليل الغزو الخلوية والنسخ المتماثل إينتراسيتوسوليك الإعلامية، فحوصات زيمبابوي لم، على حد علمنا، تستخدم لتعقب المرحلة الرابعة من عملية العدوى Lm : الهروب الخلوية. هنا، يمكننا وصف بسيط نسبيا يمكن رصد وسائل الهروب كيف الخلوية (يشار إليه فيما يلي 'ظهور') مقايسة زيمبابوي (فضلا عن التدفق الخلوي) وأمثلة تبين كيف كل العوامل الخاصة بالعوامل الممرضة والمضيفة المشفرة تنظيم هذه المرحلة من Lm دورة العدوى. تحليل المرحلة النهائية من دورة العدوى Lm الخلوية قد تجعل من الممكن تحديد الممرض إضافية وعوامل محددة لعدوى الخلية المضيفة والأنشطة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الفئران يعاملون معاملة إنسانية وفقا لجميع المبادئ التوجيهية الحكومية المناسبة للرعاية و "استخدام الحيوانات المختبرية" "معاهد الصحة الوطنية" واستخدامها تمت الموافقة لهذه الدراسة بأكملها جامعة ميامي مؤسسات الرعاية الحيوانية و "استخدام اللجنة" (بروتوكول 16-053).

1. إعداد الخلايا للإصابة

  1. نشر خط الخلية مثل بلعم الماوس 264.7 الخام في وسائل الإعلام زرع الأنسجة دميم تستكمل مع مصل العجل الجنين 10% (يشار إليها من الآن فصاعدا دميم/FCS) باستخدام قارورة 125 مل وحاضنة استنبات الأنسجة الإبقاء على 37 °C/5% CO2.
  2. اليوم قبل الإصابة، استخدام مكشطة خلية إزالة خلايا من قارورة التوسع وجمع في أنبوب مخروطي ملولبة 15 مل. الطرد المركزي خلايا في 800 x غ لمدة 10 دقائق، وصب المادة طافية وتعليق بيليه الخلية في 1 مل من دميم/FCS (بدون المضادات الحيوية) وتحديد عيار استخدام هيموسيتوميتير أو عداد الآلي خلية.
  3. ضبط عيار إلى 2 × 106 خلايا/مل وإضافة مل 0.10 (2 × 105 خلايا) إلى الآبار لطبق استنبات الأنسجة 48-جيدا. التأكد من أن تعليق خلية يغطي كامل سطح البئر.
    1. لوحة خلايا في آبار إضافية عن مصدر لاحق لوسائل الإعلام مكيفة. كما وضع مل 0.10 من دميم/FCS في ثلاث آبار إضافية لتكون بمثابة 'لا خلية تحكم'.
  4. تبني بين عشية وضحاها في حاضنة زراعة الأنسجة في 37 °C/5% CO2. في اليوم التالي، لا تقم بإزالة من حاضنة حتى العدوى البكتيريا مستعدة وجاهزة للاستخدام.

2-إعداد الليستريه المستوحدة (Lm) للإصابة

  1. تلقيح 2 مل ضخ القلب الدماغ (بهي) مع مستعمرة واحدة من صفيحة أجار السنة اللهب أثناء طازجة (< 2 أيام) من Lm واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهز في تناوب 130/دقيقة.
  2. في اليوم التالي، إضافة مل 0.10 من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 2 مل قبل استعد بهي وتستمر حضانة في 37 درجة مئوية مع الهز حتى الكثافة البصرية (OD600) ما بين 0.4 و 0.6.
  3. تحديد عيار البكتيرية تقريبية استخدام صيغة تحويل المستمدة من التجربة العملية. في المختبر، ولدينا ثقافة Lm متزايدة أضعافاً مضاعفة في بهي هو حوالي 1.3 × 109 مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي)/OD600. تصغير مقدار الوقت الثقافات البكتيرية تتعرض لدرجة حرارة الغرفة.
  4. قبل الإصابة بضبط عيار 5 × 107 زيمبابوي/مل تستخدم دميم/FCS المعالجون مسبقاً كمخفف.

3-العدوى

  1. العمل بسرعة ودقة، إضافة 20 ميليلتر (1 × 106 زيمبابوي؛ تعدد العدوى، موي = 5) طازج Lm العدوى (الخطوة 2-4 أعلاه) إلى الآبار بإمالة الطبق قليلاً، ووضع بعناية نصيحة بيبيت في وسائط الإعلام السطحية؛
    ملاحظة: تجنب لمس جدران البئر مع تلميح بيبيت.
  2. بلطف بيبيت محتويات كل بئر لضمان إكمال خلط؛ لا اهتز أو إمالة اللوحة كبيرة كهذا سوف تنتشر Lm على جدران البئر. العودة طبق ثقافة الخلية إلى 37 °C/5% CO2 حاضنة.
  3. تعد حلاً جنتاميسين 10 ميكروغرام/مل باستخدام وسائل الإعلام مكيفة من الآبار غير مصاب كمخفف.
  4. في 30 دقيقة بعد الإصابة (mpi)، بعناية إضافة محتويات الخلية العودة الثقافة الطبق وكذلك قبل 30 ميليلتر من الجنتاميسين الحل (التركيز النهائي 2.5 ميكروغرام/مل) ولطف بيبيت إلى 37 °C/5% CO2 حاضنة.
  5. في 60 معهد ماكس بلانك، حصاد الآبار المناسبة لزيمبابوى المقايسة (60 نقطة الوقت mpi) أو تحليل FCM (كما هو موضح أدناه في القسمين 4 و 5، على التوالي).
  6. للآبار المتبقية، وفي أوقات مختلفة بعد ذلك أما حصاد الخلايا كما قبل، أو لفحص ظهور Lm ، تماما إزالة الوسائط من البئر واستبدال 150 ميليلتر وسائط مكيفة خالية من الجنتاميسين.

4-أخذ عينات من معالجة وتحليل داخل الخلايا والناشئة Lm بمقايسة زيمبابوي

  1. للحصاد وآماله الطبق قليلاً وإزالة الوسائط كاملة بعناية من البئر. إضافة 0.50 مل ماء المقطر المعقم (dsH2س) إلى البئر. بعد 30 ثانية، نقل المياه الناتجة ليستي (100) إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة ودوامه بشدة لمدة 10 s.
  2. إعداد 10-1 و 10-2 تخفيف بإضافة أما 4.5 ميليلتر أو 50 ميليلتر من الماء ليساتي إلى 450 ميليلتر من dsH2س وإيجاز دوامة لضمان خلط دقيق.
  3. نشر 50 ميليلتر من 10010-1 و 10-2 عينات على لوحات أجار مرق (رطل) ليسوجيني.
  4. للاعتداء ل الناشئة Lm (الخطوة 3، 6 أعلاه) وإزالة 10 ميليلتر لوسائل الإعلام تتراكب وتقسيمه إلى مختبرين اثنين 5 ميليلتر: إلى قاسمة واحد إضافة 5 ميليلتر من دميم/FCS وقاسمه الثانية إضافة 5 ميليلتر من دميم/FCS التي تحتوي على 5 ميكروغرام/مل الجنتاميسين. عنصر التحكم هذا الأخير يميز بين الخلية Lm (الجنتاميسين الحساسة) والاعتداء داخل الخلايا Lm (الجنتاميسين المقاومة) في زيمبابوي اللاحقة.
  5. بعد 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، إضافة ميليلتر 90 dsH2س، ودوامه قوة ل 10 s، وانتشار 50 ميليلتر في لوحات أجار رطل.
  6. تعداد المستعمرات Lm على ألواح أجار رطل بعد 2 يوما حضانة عند 37 درجة مئوية.

5-أخذ عينات من معالجة وتحليل داخل الخلايا والناشئة Lm بالتدفق الخلوي (FCM)

  1. إعداد الخلايا 264.7 الخام كما هو موضح في الخطوات 1، 1-4. ضبط الخلايا إلى 1 × 106 خلايا/مل وإضافة 1 مل (1 × 106 خلايا) إلى الآبار لطبق استنبات الأنسجة 6-جيدا.
  2. تعد العدوى البكتيريا كما هو موضح في الخطوة 2، 2، 1-3 وتصيب الخلايا مع حجم العدوى تناظر موي 50 (5 × 107 زيمبابوي).
  3. في ساعة ونصف بعد الإصابة (hpi)، جمع وسائل الإعلام من أول مجموعة من الآبار ووضع في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل مع 500 ميليلتر بارافورمالدهيد 4% (PFA) ومكان على الجليد حتى تم تجهيز جميع الآبار.
  4. جمع داخل الخلايا Lmوإضافة 1 مل من dsH2س إلى البئر، وبعد 60 ثانية، نقل المياه الناتجة ليستي إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل مع 500 ميليلتر من 4% منهاج عمل بيجين. الدوامة بقوة عن 10 s ومكان على الجليد حتى تم تجهيز جميع الآبار. (ويرد تجهيز عينة في الخطوة 5، 8 أدناه).
  5. للآبار المتبقية، قم بإزالة الوسائط واستبدال مع 1 مل من دميم/السفح مع 5 ميكروغرام/مل الجنتاميسين لقتل خارج الخلية Lm وعلى الفور بإعادة الخلايا إلى حاضنة.
  6. وبعد 30 دقيقة (2 hpi) قم بإزالة الوسائط واستبدل دميم/السفح دون الجنتاميسين.
  7. بعد ح 2 و 4 (hpi 4 و 6) تأخذ الثانية والثالثة الوقت النقاط عن طريق جمع وسائل الإعلام وليساتيس كخطوات 5.3 و 5.4.
  8. الطرد المركزي أنابيب في 10,000 س ز للمادة 7 الحد الأدنى إزالة طافية دون بيليه مثيرة للقلق.
  9. تعليق كل بيليه في تلطيخ كوكتيل ميليلتر 50% 4 منهاج عمل بيجين و 15 ميليلتر من فالويدين. احتضان أنابيب في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  10. بعد الاحتضان إضافة 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لكل أنبوب وماصة صعودا وهبوطاً لمزيج.
  11. تدور أنابيب في 10,000 س ز للمادة 7 الحد الأدنى إزالة طافية دون بيليه مثيرة للقلق.
  12. تعليق كل بيليه في 400 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية للاستخدام الفوري، أو 200 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وميليلتر 200% 4 منهاج عمل بيجين في حالة تخزين لتحليلها في وقت لاحق.
  13. تشغيل عينات تدفق الخلوي وتحليل البيانات التي تم جمعها.

6-أخذ العينات تجهيز وتحليل الاستعمار Lm واستجابات المضيف في الكبد

  1. إعداد Lm للإصابة كما هو موضح في الخطوة 2، 2، 1-3.
  2. حساب المبلغ اللازم لثقافة فرعية لعيار المرجوة من 3 × 106 زيمبابوي/مل.
  3. قبل الإصابة بإضعاف كمية البكتيريا المحسوبة متوازن الملح الحل (حبس حرارة قبل هانك) بحجم نهائي في 1 مل. هذا هو العدوى الإدخال التي يتم ضخها في الماوس.
  4. باستخدام حقنه الأنسولين 100U G½ 28، رسم 100 ميليلتر (3 × 105 زيمبابوي) من العدوى الإدخال وإزالة أي فقاعات الهواء مرئية.
  5. ضع الماوس (سلالة C57BL/6؛ الذكور بين 6 و 12 أسبوعا القديمة) إلى ضبط النفس الذي عقد واستخدام المياه الدافئة (أي أكثر من 45 درجة مئوية) إلى تمدد الوريد الذيل، ثم العدوى الإدخال بحقن الوريد.
  6. لوحة 10-2 و 10-3 تخفيف من العدوى الإدخال على لوحات 10bcm أجار رطل واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية لتحديد الجرعة الإدخال الفعلي.
  7. في hpi 18، معاملة إنسانية euthanize الماوس (CO2 الخنق متبوعاً بخلع عنق الرحم) واستخدام مقص معقم الماوس مفتوحة قطع الصفاق لجمع فص جبهي الكبد باستخدام أزواج منفصلة من ملاقط ومقصات للخارج والداخل الماوس. وضع الكبد في 6 سم طبق بيتري على الجليد.
  8. قطع الكبد إلى مكعبات صغيرة ووضع في قنينة زجاجية مع شريط إثارة مغناطيسية. إضافة 2 مل من 2 مغ/مل كولاجيناز د تشكيلها في دميم دون FCS. احتضان القنينات في 37 درجة مئوية في محرض مغناطيسي لدقيقة 30−45. حالما يتم تجانس الأنسجة، أضف 3 مل من دميم/FCS لإلغاء تنشيط في كولاجيناز.
  9. تصفية الخلايا عن طريق مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي، إضافة مزيد من دميم/FCS إذا لزم الأمر.
  10. الطرد المركزي خلايا في 800 x ز بيليه عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وإزالة المادة طافية وتعليق خلية بيليه في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت ACK خلايا الدم الحمراء.
  11. احتضان خلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في ACK المخزن المؤقت. تعليق الخلايا في 1 مل من دميم/FCS.
  12. الطرد المركزي خلايا في 800 x ز بيليه عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وإزالة المادة طافية وتعليق في 1 مل من دميم/FCS. بعد ذلك، عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو عداد الآلي خلية.
  13. نقل الخلايا6 1 x 10 إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة وتدور لبيليه. ثم تعليق في 1 مل dsH2س ودوامه الخلايا. لوحة 50 ميليلتر في لوحات رطل في غير مخفف و 10-2 تخفيف واحتضان في 37 درجة مئوية لتعداد Lm لتحليل زيمبابوي.
  14. نقل 1 × 106 خلايا في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية لكل عينة الأنسجة وفقا لعدد خلايا وتغسل مع 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
  15. الطرد المركزي خلايا في 800 x ز بيليه عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وإزالة المادة طافية.
  16. إعداد كوكتيل جسم الذي يحتوي على الأجسام المضادة التي تهم استناداً إلى التركيز الموصى به لكل جسم ونظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت. انظر الجدول للمواد المستخدمة في التحليل المبالغ الموصى بها.
  17. تعليق بيليه في 100 ميليلتر من جسم كوكتيل واحتضان أنابيب في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  18. وبعد الحضانة، إضافة 2 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لكل أنبوبة وتعليق الخلايا.
  19. الطرد المركزي خلايا في 800 x ز لبيليه في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية. ثم تعليق بيليه في 400 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية للاستخدام الفوري، أو 200 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وميليلتر 200% 4 منهاج العمل إذا تخزينها في وقت لاحق.
  20. تحليل الخلايا بالتدفق الخلوي (راجع الخطوة 5.13).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تقييم دور الممرض وترميز المضيف العوامل التي تؤثر على العدوى الخلوية
استخدام الإصابة بالشروط الموضحة أعلاه، يتم استرداد 0.15 في المائة من البرية من نوع الإدخال Lm بعد 1.5 ساعة حضانة المشتركة مع مثقف الضامة (الشكل 1أ). في ح 1.5 اللاحقة لاحتضان المشارك (ح 3 وظيفة العدوى، hpi)، كانت هناك زيادة النوبات في الانتعاش من قابلة للتطبيق لم ومن 3 إلى 6 hpi كان هناك زيادة إضافية قدرها 7.5-fold في استرداد مجدية Lm. منذ يتم إضافة الجنتاميسين المضادات الحيوية الخلية كتيمة لثقافات المشارك في hpi 1 للقضاء على الخلية Lm، يمثل زيادة مستويات Lm قابلة للتطبيق بين 1.5 و 6 hpi كوليرا حصرا الانتشار داخل الخلايا.

Lm المكاسب سرعة الوصول إلى سيتوسول بعد استيعاب داخل خلايا حقيقية النواة (انظر المقدمة). ويؤيد سيتوسوليك Lm مع الآلية بلمرة الأكتين بها مما يعني أنه يدفع نفسها قادرة على اختراق غشاء البلازما. في فحص الإصابة في المختبر الموصوفة أعلاه، إذا تمت إزالة الجنتاميسين من الآبار في 6 hpi، خارج الخلية Lm يمكن سهولة الكشف عن ح 1 في وقت لاحق (7 hpi) في وسائل الإعلام السطحية (الشكل 1ب). تم انتشال لا كفوس من آبار المراقبة التي كانت تبذر لا مع الضامة ولكن أن تعامل خلاف ذلك مطابق تماما الآبار المبذورة مما أظهر أن مظهر خارج الخلية Lm كانت تعتمد اعتماداً كلياً على وجود الضامة و لا نتيجة لقتل المضادات الحيوية غير كاملة (غير معروضة).

القدرة على Lm البقاء على قيد الحياة وتتكاثر إينتراسيلولارلي يعتمد إلى حد كبير على مجموعة من الجينات التعبير الذي يسيطر عامل النسخ "العوامل التنظيمية الإيجابية" (برفا)1. في البداية، هناك انتعاش قابلة لمقارنة لسلالة Lm البرية من نوع وسلالة متحولة Lm المحذوفة لهذا العامل (Δبرفا) (الشكل 1أ). ومع ذلك، هناك انخفاض لاحقة في انتعاش سلالةبرفا Δ بعد الحضانة المشتركة طويلة مثل الانتعاش في 6 hpi 3-fold أقل من الانتعاش في 1.5 hpi. لا فائدتين وتوقعات، تم اكتشاف البكتيريابرفا Δ في وسائل الإعلام السطحية في hpi 7 (الشكل 1ب).

وينظم نشاط برفا على مستويات متعددة. وكانت عددا من المتغيرات برفا active مؤثرا، مرمزة بواسطة فرط ضراوة برفا * الآليلات، معزولة3. وقد سلالة Lm امتلاك برفا * الشخصية عدوى أولية التي مماثلة لسلالة البرية من نوع اسوي في hpi 1.5 و 3 (الشكل 1أ). ومع ذلك، بين hpi 3 و 6، إلى حد كبير زيادة إضعاف من سلالة برفا * تختلف عن سلالة البرية من نوع. مرة أخرى، فائدتين وتوقعات، اكتشفت سلالة برفا * سهولة في وسائط الإعلام السطحية في hpi 7 مستويات تتجاوز إلى حد كبير التي لوحظت بالنسبة لسلالة Lm البرية من نوع (الشكل 1ب).

بعد الإفراج عنها إلى سيتوسول، يؤيد Lm مع إليه البلمرة أكتين الخلوية التي ينتج عن بكتيريا يجري يلفها من أكتين مبلمرة. للتأكد من أن الخلية Lm مشتق من سيتوسول أكتين الغنية من الخلية المضيفة المصابة، الضامة كانت أما ترك غير مصاب أو مصابة بالإعراب عن التجارة والنقل برفا * سلالة وجمعت وسائل الإعلام السطحية في 1.5 و 4 و 6 من hpi، الملون مع فالويدين الذي يربط أكتين مبلمرة، وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. وسائط وتتراكب الضامة كل غير مصاب ومصابة الوارد تشتت الضوء الحجم بكتيريا الجسيمية (الشكل 2أ)، ومع ذلك، تمتلك وسائل الإعلام فقط من الضامة المصابة إشارات إيجابية بروتينات فلورية خضراء داخل هذا الحجم النابضة (الشكل 2ب؛ اللوحة اليمنى). كانت هناك زيادة تعتمد على الوقت في مظهر إيجابي فالويدين Lm في وسائط الإعلام وتتراكب المصابة الضامة (الشكل 2ب؛ حق ثلاثة أفرقة). فالويدين-إيجابية معربا عن بروتينات فلورية خضراء Lm اكتشفت أيضا في ليساتيس إعداد من الضامة المصابة (الشكل 2ج؛ اللوحة اليمنى). ومع ذلك، تم الكشف عن لا إيجابية فالويدين Lm في ليساتيس إعداد من الضامة المصابة بسلالة متحولة معربا عن بروتينات فلورية خضراء Lm تفتقر إلى عامل الفوعة ActA المطلوب لتوظيف الآلات بلمرة الأكتين على السطح الخارجي ل Lm بعد صدوره في سيتوسول (الشكل 2ج؛ اللوحة اليمنى). هذه البيانات دعم سيناريو في عدوى في المختبر النموذجي خارج الخلية 'الناشئة' Lm مستمدة من سيتوسول الخلية المصابة.

وبالإضافة إلى Lm-ترميز العوامل، حددت عددا من العوامل قد المضيف أن أثر العدوى Lm الخلوية (انظر المناقشة). في الآونة الأخيرة، عامل المضيف بيرفورين-2 (P2) قد ثبت أن يكون عنصرا حاسما في مستوى الخلية الدفاعات ضد عدد من مسببات الأمراض البكتيرية. الضامة البريتوني الإفرازات (PEMs) المعزولة من البرية من نوع (P2+ +) والفئران-/- P2مصابون في البداية نسبيا قبل Lm مقاسا بمقايسة زيمبابوي في hpi 1 (الشكل 3أ). في P2+ + PEMs انتشال عدد كفوس في 6 hpi هو أكبر 10 إضعاف مقارنة بالمستويات التي انتعشت في 1 hpi. مماثلة للنتائج المنشورة سابقا، في P2-/- PEMs انتشال عدد كفوس في 6 hpi 80-fold أكبر مقارنة بالمستويات التي انتعشت في 1 hpi4. تعزيز Lm الانتشار داخل الخلايا في P2-/- PEMs كان مصحوبا بزيادة مستويات قابلة للتطبيق لم تم الكشف عن وسائط الإعلام السطحية بالمقارنة مع المستويات التي رصدت في P2+ + ( PEMs 3 الشكلب). وتوضح هذه البيانات أن في فحص في المختبر أن مظهر الناشئة خارج الخلية Lm يمكن أيضا تقريرا عن عوامل المضيف أن الإصابة أثر.

في فيفو العدوى وتحليل للكبد
بالإضافة إلى فحوصات الإصابة في المختبر الموصوفة أعلاه، يمكن أيضا تقييم العدوى النسبي Lm السلالات البرية من نوع والموهنة، وفرط ضراوة خلال الاختبارات المجراة في العدوى. الفئران كانت عن طريق الوريد المصاب يشترك مع أن خليط متساو من نوع البرية وسلالاتبرفالم Δ وح 18 في وقت لاحق قد euthanized معاملة إنسانية، وكبد قصت ووحيدة الخلية الاستعدادات. تم تفكيك خلايا الكبد معزولة وليساتيس الناتجة عن تعرض مقايسة زيمبابوي التي يمكن أن تميز بين السلالات البرية من نوع و Δبرفالم . مقارنة بنسبة 1:1 لهذه السلالات اثنين في العدوى الأصلي (المدخلات)، كانت نسبة/wild typeبرفاΔ في hpi 18 ('الإخراج') أقل بكثير من الوحدة (للفئران 6 كان النطاق 0.001 إلى 0.330؛ يعني 0.100) (الشكل 4). وفي المقابل، الفئران المصابين بأن خليط متساو من نوع البرية و برفا * Lm سلالات/wild type نسب برفا *تتراوح من 2.4 إلى 10.2 (يعني 7.1). هذه التجربة تبين أن العدوى النسبي لهذه السلالات Lm الثلاثة (نوع البرية و Δبرفا وبرفا *) في الكائن حي سليمة تشبه التي لوحظت في فحوصات الإصابة في المختبر.

ويمكن أيضا رصد المضيف لتحديد عما إذا كان مستوى العدوى البرية من نوع و Δبرفا برفا * سلالات مختلفة ترتبط بتدرج مقابلة للاستجابة المناعية الفطرية. سبق أنه ثبت أن الضامة المقيم (الخلايا Küpffer) والتسلل إلى وحيدات التحريضية والعدلات لعب الأدوار الحاسمة والمترابطة في حماية الكبد خلال5، Lm العدوى6، 7،8. خلايا المعدة من الفئران مصابة والفئران المصابة بسلالة Lm البرية من نوع التعبير عن التجارة والنقل ح 18 ملطخة بعلامات خاصة بنوع الخلية وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. من حيث عدم المناعة خلايا الكبد (مثل خلايا الكبد وخلايا بطانية)، لم تكن هناك الاكتشاف فروق بين فئران مصابة ومصاب. وفي المقابل، كانت هناك التغييرات الملحوظة المتعلقة بالإصابة في الكبد من حيث نسبة الخلايا المناعية إيجابية الملون مستضد الكريات البيض شيوعاً CD45 (الشكل 5ألف). على وجه التحديد، كانت الفئران المصابة مع السلالات البرية من نوع وبرفا*Lm مستويات أعلى بكثير من CD45 الخلايا+ في الكبد مقارنة بفئران مصابة بينما مستويات CD45+ خلايا الكبد في الفئران المصابة لم تكن خاصة تختلف عن المستويات التي لوحظت في فئران مصابة بسلالةبرفالم Δ الموهن. كذلك تميز كل السكان المقيمين والمتسللة الخلية المناعية، CD45+ يمكن أن تعزز الخلايا سوبتيبيد. كما لاحظ آخرون9، تحولاً ملحوظا مع العدوى هو اختفاء شبه كامل للمقيمين من الخلايا Küpffer (CD11bمنتصف F4/80+في الكبد) ومظهر ملازم للسكان متميزة من CD11bمرحبا الخلايا التي تمثل تسلل العَدلات (الشكل 5ب؛ الفريق الأوسط السفلي). كما تظهر في الكبد في 18 hpi، هي CD11b تظهرمنتصف F4/80– الخلايا التي، نظراً لأنهم أيضا Ly6Cمرحبا، تمثل التسلل إلى التهاب وحيدات (الشكل 5ب؛ أقل من الألواح الوسط واليمين). في الفئران المصابة من هذه الخلايا هذه الخلايا فقط التي تم الكشف عن إشارة ملموسة في التجارة والنقل عقب hs 18 من الإصابة (الشكل 5ج). هذا الاستنتاج الأخير مشابهة للتي ذكرت مؤخرا جونز و D'Orazio الذين أظهرت أن الفئران، Lm أساسا يرتبط مع Ly6Cمرحبا وحيدات تسلل القناة الهضمية بعد10من العدوى المنقولة عن طريق الأغذية. يشبه الشخصية CD45مرحبا خلايا الكبد في الفئران المصابة بسلالةبرفا Δ Lm لفئران مصابة بينما عززت الفئران المصابة بسلالة لمبرفا * فرط ضراوة متواضعة إلى مستويات تسلل العَدلات والتهاب وحيدات مقارنة بالفئران المصابة بسلالة Lm البرية من نوع (البيانات لا تظهر).

Figure 1
الشكل 1 : العدوى من مثقف الضامة من الليستريه المستوحدة (Lm)- خط خلية سنخية الماوس 264.7 الخام أصيبوا في المختبر مع أما البرية من نوع Lm (wt؛ الدوائر شغلها) الموهن Lm (Δبرفا؛ الدوائر المفتوحة) أو فرط ضراوة (برفا *؛ فتح المربعات) سلالات Lm (انظر النص للحصول على التفاصيل). (أ) تم تفكيك الضامة في 1.5 و 3 و 6 ساعات بعد الإصابة (hpi)، وتم تحليل محتويات الخلايا بتشكيل مستعمرة المقايسة وحدة (زيمبابوي). (ب) يعاملون الضامة المصابة بإيجاز مع الجنتاميسين المضادات الحيوية للقضاء على عدم استيعاب Lm وفي 6 hpi وسائط الإعلام تتراكب كان جمعها وتحليلها من قبل مقايسة زيمبابوي. يمثل الخط المنقط حد الكشف المقايسة. تمثل كل نقطة بيانات مستقلة بئر/عدوى وتم تحديد قيم P باختبار t للطالب. أظهرت نتائج تجربة تمثيلية واحدة وتجري ثلاث مرات مع نتائج مماثلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : ربط أكتين Lm تحليلها بواسطة التدفق الخلوي- خط خلية سنخية الماوس 264.7 الخام أما تركت وقاية أو إصابة في المختبر مع الإعراب عن بروتينات فلورية خضراء Lm. تمت إزالة الوسائط الفوقية، تثفيل، والمواد التي تم جمعها ملطخة فالويدين أكتين-ملزمة. مواد ملطخة تحليلها بواسطة التدفق الخلوي وسيظهر المؤامرات تشتت الضوء (A) يشير إلى النابضة المستخدمة لمستويات التجارة والنقل وفالويدين المرتبطة بها خارج الخلية (أي، المستمدة من وسائل الإعلام) Lm المبينة في (ب). (ب) المنطقة المشار إليها تمثل إيجابية مزدوجة بروتينات فلورية خضراء/أكتين Lm ووفرة بهم كنسبة مئوية من مجموع الأحداث ضمن أبواب تشتت الضوء. (ج) كانوا مصابين الضامة الماوس بالإعراب عن بروتينات فلورية خضراء Lm أو سلالة الإعراب عن بروتينات فلورية خضراء Lm تفتقر إلى الجين ترميز ActA (ΔactA) أن المجندين إليه أكتين-البلمرة الخلية المضيفة سطح الخلية Lm . في hpi 6، تم تفكيك الخلايا المصابة والمحتويات الخلوية المفرج عنهم، بما في ذلك داخل الخلايا Lm، الملون أكتين وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. أظهرت نتائج تجربة تمثيلية واحدة وتجري ثلاث مرات مع نتائج مماثلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : العدوى البرية من نوع والضامة خروج المغلوب بيرفورين-2 التي لم. الضامة البريتوني معزولة أما من نوع البرية (P2+ +؛ شغل الدوائر) أو خروج المغلوب (P2-/-؛ دوائر منقط) أصيبوا في المختبر مع Lm. (أ) في 1 و 6 hpi، تم تفكيك الضامة وتحليل محتويات الخلايا بواسطة المقايسة زيمبابوي. (ب) الضامة البريتوني المصابين عولجوا بإيجاز مع الجنتاميسين المضادات الحيوية وفي hpi 2.5 و 6 وسائط الإعلام تتراكب كان جمعها وتحليلها من قبل مقايسة زيمبابوي. تمثل كل نقطة بيانات مستقلة بئر/عدوى وتم تحديد قيم P باختبار t للطالب. أظهرت نتائج تجربة تمثيلية واحدة وتجري ثلاث مرات مع نتائج مماثلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: لم عدوى الماوس- مجموعات من الفئران 6 كانوا مصابين خليط متساو من أما البرية من نوع Lm (wt) ويخفف Lm سلالات (Δبرفا) أو أن خليط متساو البرية من نوع Lm وفرط ضراوة (برفا *) سلالات. في 18 hpi الفئران Lm تحددها العبء في الكبد المقايسة زيمبابوي. في هذه التجربة يملك سلالة Lm البرية من نوع جينات مقاومة المضادات الحيوية التي تتيح لها أن تكون متميزة من السلالات متحولة Lm حساسة للمضادات الحيوية. كانت مطلية هوموجيناتيس الكبد في كلا المحتوية على المضادات الحيوية وتم رسم وسائط خالية من المضادات الحيوية ونسبة متحولة والبرية من نوع Lm . خط منقط يمثل نسبة الجرعة إصابة المسخ/البرية من نوع. وكانت مستويات مطلقة البرية من نوع Lm في الأفواج اثنان من الفئران الخلايا6 الكبد زيمبابوي/10 12 و 15، على التوالي. أظهرت نتائج تجربة تمثيلية واحدة تتم مرتين مع نتائج مماثلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : الاستجابة المناعية للعدوى Lm في الكبد ماوس. وكانت الفئران أما مصابة أو عناصره المصابين 2 × 105 الإعراب عن "زيمبابوي من بروتينات فلورية خضراء" Lm سلالات التحضيرات 18 h. خلية واحدة من كبد حللت بالتدفق الخلوي للتعبير عن علامات المناعة والنقوي محددة. (أ) النسبة المئوية للخلايا المصبوغة إيجابية لعلامة سطح الخلية الخاصة بالمناعة CD45+ كل 106 معزولة مجموع يعيش خلايا الكبد لفئران مصابة وفئران مصابة أما البرية من النوع (wt Lm)، يخفف (Δبرفا)، أو Lm سلالات فرط ضراوة (برفا *). المرسومة هو متوسط ثلاثة فئران كل مجموعة، وتم تحديد قيم P باختبار t للطالب. (ب) تظهر في لوحات اليسار هي الشخصية المصبوغة من الكبد CD45 تلطيخ الخلايا من ماوس غير مصاب فردية (أعلى) وفردية wt Lm-إصابة (أسفل)؛ في لوحات الأوسط يظهر مستويات التعبير علامات محددة النقوي CD11b و F4/80 CD45+ الخلايا؛ ويرد على لوحات حق مستويات التعبير Ly6C الخلايا بوابات المشار إليه. يظهر في أقصى يمين لوحة تراكب Ly6C+ الخلايا من الفئران مصابة ومصاب بما في ذلك بالنسبة المئوية والأسفار متوسط الشدة (MFI) CD11b+ F4/80– الخلايا إيجابية لبوابة Ly6C المشار إليها. يظهر ماوس ممثل من الفئران 3 كل مجموعة. (ج) Ly6C+ الخلايا المستمدة من كبد فئران مصابة ومصاب (وصف (ب)؛ لوحات الوسط واليمين) حللت لتعبير بروتينات فلورية خضراء بالتدفق الخلوي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بسبب برنامجها العدوى الخلوي السريع وبروسيسيفي وهو Lm ممرض مثالي للتحقيق في الأنشطة الخلوية التي تؤثر على الإصابة. قد حددت عددا من العوامل المضيفة سواء سلبا أو إيجاباً تؤثر على Lm العدوى الخلوية11،12،،من1314. اثنين مثل استضافة عوامل تتسم في المختبر، بيرفورين-2 ومثبطات ينظم الهيم (P2 ومرحبا)، تنظيم السمات المميزة لعملية العدوى Lm . كما هو موضح في الشكل 3، الخلايا ناقصة P2 معرضة بدرجة عالية ل Lm وهذه القابلية المحسنة أيضا صحيحاً ل الفئران خروج المغلوب P24. أظهرت دراسات مقارنة مفصلة للإعراب عن P2 وتفتقر إلى P2 الضامة أن الخلايا الأخيرة شكلت عالية المحمضة Lm-التي تحتوي على فاجوسوميس التي أدت إلى تعزيز التعبير الجيني ضراوة. وأيده فرضية أن التعبير الجيني الفوعة التفاضلية يسهم في تعزيز قابلية الضامة P2-تفتقر إلى استنتاج مفاده أن فرط ضراوة برفا * سلالة، كما أن، المذكورة آنفا، الفوعة تعرب عن المصابين الجينات على مستوى عال مؤثرا، معربا عن P2 والضامة تفتقر إلى P2 نفس القدر4. وهكذا، توافر سلالة Lm فرط ضراوة مكن لاختبار الفرضية القائلة بأن عامل المضيف P2 ينظم سلبا على الممرض الفوعة عامل النشر. مرحبا، ونحن قد أظهر أن هذا العامل المضيف ينظم الاتجار بداخل الخلايا Lm مثل أنه مقيد بخروجها من الخلية المصابة؛ من المرجح أن هذا النشاط الخلوي الأسس لتعزيز قابلية الفئران تفتقر ل Lm العدوى15،16.

وفي الدراسات التي توثق الأنشطة الخلوية التي تحدث خلال دقائق إصابة، من الأهمية بمكان أن قبل الحضانة المشتركة، أن كلا من البكتيريا والخلايا المضيفة ليست مفرطة عرضه لتقلب درجات الحرارة أو الاتفاقيات البيئية الأخرى الظروف التي يمكن تنشيط استجابات الإجهاد التداخل (وارباك) الأنشطة الناجمة عن العدوى. لأن الدراسات المذكورة أعلاه، وهذا يشمل هذه النقاط التي تبدو بسيطة كتقليل وقت التعامل مع Lm فقط قبل بدء الإصابة. على سبيل المثال، إذا كانت ثقافة بكتيرية إزالتها من هز حاضنة 37 درجة مئوية ويسمح للجلوس على مقاعد البدلاء، سيتم تنشيط تحولات في توافر درجة الحرارة والأكسجين (ضمن أمور أخرى) التعديلات التي قد تؤثر على المرحلة الأولية من اللاحقة التفاعل مع الخلية المضيفة. وبالمثل، الخلايا المضيفة أيضا حساسة لتغيرات درجة الحرارة ووسائل الإعلام التي قد تؤثر على استجابات الإصابة الأولى. على الرغم من أن في الممارسة العملية فإنه من المستحيل تماما إزالة جميع التقلبات في البكتيريا وسيتم تصغير الخلية المضيفة استزراع ظروف، والحد منها بقدر الإمكان ووضع خطة تشغيل قياسية، الاختلاف بين التجارب.

متغير إضافي، التي في رأينا أيضا هي لا تقدر أهمية منها حق قدرها، واستخدام المضادات الحيوية في خلية ثقافة العدوى نماذج. الجنتاميسين هو غالباً المضادات الحيوية للاختيار لأنها كتيمة نسبيا لغشاء البلازما حقيقية النواة. في الكتابات القديمة والحالية على حد سواء، فإنه يستخدم عادة في 50 ميكروغرام/مل لقتل خارج الخلية (أي غير-استيعاب) البكتيريا. مؤخرا مباشرة أثبتت أنه عندما حضر 25 ميكروغرام/ملليلتر، هناك نشر كافية من الجنتاميسين عبر غشاء حقيقية النواة لقتل داخل الخلايا Lm17. في تجربتنا، هذا المستوى من الجنتاميسين يقتل Lm فورا عند الاتصال، بينما مستويات أقل بكثير، في قتل مجموعة 2 إلى 5 ميكروغرام/مل > 99.9% Lm في أقل من 5 دقائق4. لورينز والزملاء قد أظهرت أن تركيزات الجنتاميسين يستخدم على نطاق واسع من 25 – 50 ميكروغرام/مل تكفي أيضا لقتل داخل الخلايا واليرسينيا بيستيس18. من المثير للاهتمام، وهذه المجموعة أظهرت أيضا اختلافات كبيرة بين الخلية التي ينبغي أن تحدد أنواع من حيث permeabilization الجنتاميسين تسليط الضوء على تلك الظروف المثلى لكل زوج خلية المضيف الممرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing Buffer Gibco  A1049201
ArC Amine Reactive Compensation Beads  Life Technologies A10346
BHI (Brain Heart Infusion) broth EMD Milipore 110493
Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Collagenase D Roche 11088858001
DMEM media  Gibco  11965-092
FACS tubes  BD Falcon 352054
FBS - Heat Inactivated  Sigma-Aldrich F4135-500ML
Hanks’ Balanced Salt solution Sigma-Aldrich H6648-6X500ML
LB agar Grow Cells MS MBPE-4040
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit  Life Technologies L349S9
Rhodamine Phalloidin  Thermo Fischer R415
SP6800 Spectral Analyzer Sony
Syringe 28 G 1/2" 1cc BD 329461
TPP Tissue Culture 48 Well Plates  MIDSCI TP92048
TPP Tissue Culture 6 Well Plates  MIDSCI TP92406
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42
Antigen
CD11b  Biolegend Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70
CD11c Biolegend Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418
CD45 Biolegend Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11
F4/80 Biolegend Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8
Live/Dead Invitrogen Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100
Ly6C Biolegend Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4
MHC II Biolegend Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2
NK 1.1 Biolegend Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
  2. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
  3. Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
  4. McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
  5. Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
  6. Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
  7. Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
  8. Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
  9. Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
  10. Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
  11. Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  12. Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
  13. Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
  14. Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
  15. Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
  16. Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
  17. Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
  18. VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 144، العدوى، الفئران، قياس تدفق مسببات الأمراض الميكروبية، الليستريه المستوحدة،، بيولوجيا الخلايا
استخدام مسببات الأمراض بكتيرية للتحقيق لاستجابات المضيف الخلوية ومستوى أورجانيسميك
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gayle, P., Freitag, N. E., Strbo,… More

Gayle, P., Freitag, N. E., Strbo, N., Schesser, K. Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (144), e58775, doi:10.3791/58775 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter