Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

Published: February 22, 2019 doi: 10.3791/58775
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois College of Medicine

Summary

אנו מתארים שני מבחני במבחנה, ויוו זיהום זה יכול לשמש כדי לנתח את פעילותם של גורמי קידוד המארח.

Abstract

ישנם מגוון רחב של אסטרטגיות פתוגנים חיידקיים להעסיק כדי לשרוד להתרבות פעם אחת בתוך התא האיקריוטים. מה שנקרא 'cytosolic' פתוגנים (ליסטריה, שיגלה flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisו ריקטסיה spp.) לקבל גישה ציטוזול תא נגוע על-ידי enzymatically ופיזית משפילים קרום vacuolar הראשי. פעם אחת ציטוזול, פתוגנים אלה הן להתרבות כמו גם ליצור כוחות מספיקים מכני לחדור קרום פלזמה של התא המארח כדי להדביק תאים חדשים. . הנה, אנחנו מראים כיצד מסוף שלב של מחזור הסלולר זיהום של ל' monocytogenes (Lm) ניתן לכמת על ידי המושבה יוצרי יחידת מבחני והן cytometry זרימה, לתת דוגמאות איך שני השפעת גורמים הפתוגן, המארח-בקידוד זה תהליך. אנו גם מראים התכתבות קרוב של Lm הדינמיקה זיהום של תאים בתרבית נגוע במבחנה, אלה בתאי הכבד נגזר עכברים נגועים ויוו. אלה מבחני מבוססי פונקציה פשוטה יחסית, ניתן בקלות לשנות-מבוססות-גילוי מסכי תפוקה גבוהה עבור מאפננים של תפקוד התאים האיקריוטים.

Introduction

זיהום מבוססי מודלים ניסיוניים הם מאתגר מיסודו בשל תלותם התנאים מדינת המוצא של המארח הפתוגן, את האסטרטגיות זיהום שונים של הפתוגן, ואת הקושי של ייחוס הפתוגן, המארח-מונחי תהליכים בהתבסס על תוצאות. החיידק ליסטריה (Lm) הפך פתוגן אידיאלי כדי לחקור את המארח ההגנה תגובות בגלל שלה גנטי, מיקרוביולוגי ללקוחות שלנו את האסטרטגיה מהיר ולא תהליכית זיהום הסלולר שלה, צלולים יחסית קשר בין פנוטיפים זיהום סלולרי-אורגניזם-ורמת שלה. זיהום הסלולר של Lm ממשיך דרך ארבעה שלבים ברורים1: (i) הפלישה הסלולר אשר מסכם עם Lm סגירות בתוך חלולית; (ii) Lm-בבימויו של התפרקות של קרום חלולית שחרורו של Lm לתוך ציטוזול; (iii) שכפול intracytosolic; חדירה פיזית (iv) של קרום פלזמה כי התוצאות גם זיהום של תאים סמוכים ישירות (כמו למשל גיליון אפיתל) או, בכל תאי בידוד, שחרורו של Lm לתוך חצרו חוץ-תאית. כל אחד משלבים אלה מקודמים על ידי ספציפי Lm-מקודד גורמים (המכונה 'הגורמים התקפה אלימה'), נמחק, לגרום למומים זיהום במודלים הסלולר והן בבעלי חיים. אסטרטגיה זו זיהום כללי התפתח באופן עצמאי על-ידי מספר של פתוגנים 'cytosolic' כביכול2.

המושבה יוצרי מבחני יחידה (CFU) מועסקים באופן נרחב כדי להעריך את שניהם במבחנה (קרי, סלולר) כמו גם ויוו (קרי, אורגניזם) תוצאות הזיהום. בנוסף את רגישותם גבוהה, במיוחד עבור זיהומים ויוו, מבחני CFU מספקים readout ברורה וחד משמעית של פתוגן פלישה והתפשטות תאיים הישרדות /. CFU מבחני היו בשימוש נרחב כדי לנתח גורמים תא באימות Lm ומארח, שמשפיעים על זיהום. מחקרים קודמים אלה להיות לנתח הפלישה הסלולר ושכפול intracytosolic אינפורמטיבי, CFU מבחני. לא, לפי מיטב ידיעתנו, השתמשו כדי לעקוב אחר השלב הרביעי של תהליך זיהום Lm : הבריחה הסלולר. כאן, אנו מתארים פשוטה יחסית ניתן לנטר אמצעי לבריחה איך הסלולר (ןלהל 'הופעתה') על ידי CFU assay (כמו גם על ידי cytometry זרימה), הצג דוגמאות איך שני גורמים הפתוגן, המארח-מקודד לווסת את השלב הזה של Lm מחזור זיהום. הניתוח של השלב מסוף של מחזור הסלולר של זיהום Lm עלולה להפוך את זה ניתן לזהות הפתוגן נוספים, גורמים ספציפיים זיהום תא מארח ופעילויות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עכברים טופלו בצורה אנושית לפי כל ההנחיות המתאימות לטיפול ולא להשתמש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים ואת השימוש בהם אושרה במחקר זה כולו על ידי אוניברסיטת מיאמי. טיפול בבעלי חיים מוסדיים וועדת שימוש (פרוטוקול 16-053).

1. מכינים את התאים לדלקת

  1. הפץ שורת התאים מקרופאג דמוי העכבר 264.7 גלם בתקשורת תרביות רקמה DMEM, בתוספת 10% עגל עוברית סרום (המכונה מעתה ואילך DMEM/FCS) באמצעות בקבוקון 125 מ ל וחממה של תרביות רקמה ומתוחזק על 37 °C/5% CO2.
  2. יום לפני הזיהום, להשתמש במגרדת התא כדי להסיר תאים מן הבקבוק הרחבה לאסוף צינור חרוטי בורג מכסה 15 מ"ל. צנטריפוגה תאים ב 800 x גרם במשך 10 דקות, decant תגובת שיקוע להשעות בגדר תא ב 1 מ"ל של DMEM/FCS (ללא אנטיביוטיקה) ולקבוע את כייל נוגדנים באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.
  3. להתאים כייל נוגדנים ל 2 x 106 תאים למ"ל ולהוסיף 0.10 מ"ל (2 x 105 תאים) בארות של תבשיל תרביות רקמה 48-. טוב. ודא כי התליה תא מכסה את כל פני השטח של הבאר.
    1. צלחת תאים בבארות נוספים עבור מקור מאוחר יותר של מדיה ממוזגים. גם מקום מ 0.10 ל DMEM/FCS משלוש בארות נוספות כדי לשמש 'אין תא פקד'.
  4. דגירה בין לילה בחממה תרביות רקמה-37 °C/5% CO2. למחרת, מסירה החממה עד inoculum החיידק יהיה זמין ומוכן לשימוש.

2. הכנת ליסטריה (Lm) זיהום

  1. לחסן 2 מ של המוח ללב אינפוזיה (BHI) עם מושבה בודדת מתוך צלחת אגר טריות קווצות שער (< 2 ימים) של Lm דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס שריפה-סבבים 130/min.
  2. למחרת, להוסיף מ 0.10 ל תרבות של 2 מ ל לילה מראש חימם BHI ולהמשיך המקננת ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות עד הצפיפות האופטית (OD600) הוא בין 0.4 ל- 0.6.
  3. לקבוע בקירוב כייל חיידקי שימוש בנוסחת ההמרה נגזר מדעית. במעבדה שלנו, תרבות Lm גדל אקספוננציאלית ב- BHI הוא כ- 1.3 x 109 המושבה ויוצרים /OD יחידות (CFU)600. למזער את כמות הזמן תרבויות חיידקי נחשפים בטמפרטורת החדר.
  4. בדיוק לפני זיהום להתאים את כייל נוגדנים ל- 5 x 107 CFU/mL באמצעות DMEM מראש ומחוממת/FCS כמו diluent.

3. זיהום

  1. עובדת במהירות ובדייקנות, להוסיף 20 µL (1 x 106 CFU; ריבוי של זיהום, MOI = 5) של טריות Lm inoculum (שלב 2.4 לעיל) כדי בארות על ידי הטיית מעט את המנה והצבת בקפידה את הטיפ pipet בתקשורת שמעליה;
    הערה: להימנע מלגעת בקירות של הבאר עם קצה pipet.
  2. בעדינות pipet התוכן של כל טוב על מנת להבטיח להשלים ערבוב; לא ללחוץ או באופן משמעותי להטות את הצלחת כמו זה יתפשט Lm את החומות של הבאר. לחזור תא תרבות מנה 37 °C/5% CO2 מיכלים.
  3. להכין פתרון גנטמיצין 10 µg/mL באמצעות מדיה ממוזגים מבארות נגוע כמו diluent.
  4. ב 30 דקות לפרסם זיהום (mpi), בזהירות להוסיף 30 µL של גנטמיצין פתרון (הריכוז הסופי 2.5 µg/mL), בעדינות pipet התכנים גם לפני ו תא החזרה תרבות מנה 37 °C/5% CO2 מיכלים.
  5. ב 60 mpi, לקצור ולס המתאימות CFU assay (נקודת זמן mpi 60) או את כרטיס FCM ניתוח (כפי שמתואר להלן בסעיפים 4 ו-5 בהתאמה).
  6. וולס הנותרים, בזמנים שונים לאחר מכן גם לקצור תאי כמו בעבר, עבור או Lm הופעתה וזמינותו, לחלוטין להסיר מדיה מן הבאר ולהחליף עם 150 µL של גנטמיצין ללא מדיה ממוזגים.

4. דגימה עיבוד וניתוח של תאיים, מתהווים Lm מאת CFU Assay

  1. הקציר, מעט להטות את המנה, הסר בזהירות את התקשורת כולה מן הבאר. להוסיף 0.50 מ ל מים מזוקקים סטריליים (dsH2O) הבאר. לאחר 30 s, להעביר את המים וכתוצאה מכך lysate (100) צינור microcentrifuge 1.5 mL ו מערבולת נמרצות במשך 10 s.
  2. להכין 10-1 ו-2 10 דילולים על-ידי הוספת 4.5 µL או µL 50 של המים lysate כדי µL 450 של dsH2O או בקצרה מערבולת כדי להבטיח ערבוב יסודי.
  3. מורחים 50 µL של 100, 10-1 ו/או 10-2 דוגמאות על גבי פלטות אגר מרק (ליברות) lysogeny.
  4. Assay עבור מתהווים Lm (שלב 3.6 לעיל), להסיר 10 µL של התקשורת על-ידי כיסוי, מחלקים אותו 5 שני µL aliquots: כדי aliquot אחד להוסיף 5 µL של DMEM/FCS וכדי את aliquot השני להוסיף 5 µL של DMEM/FCS המכיל 5 גנטמיצין µg/mL. הפקד האחרון מבדיל בין חוץ-תאית Lm (גנטמיצין רגיש) ואת וזמינותו תאיים Lm (גנטמיצין עמיד) ב CFU עוקבות.
  5. לאחר 5 דקות בטמפרטורת החדר, להוסיף 90 µL של dsH2O, מערבולת נמרצות עבור 10 s, התפשטות 50 µL על פלטות אגר ליברות.
  6. ספירת מושבות Lm על פלטות אגר LB לאחר 2 ימי דגירה ב 37 º C.

5. דגימה עיבוד וניתוח של תאיים, מתהווים Lm מאת Cytometry זרימה (FCM)

  1. להכין RAW 264.7 תאים כמתואר בצעדים 1.1-4. להתאים לתאים עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל ולהוסיף 1 מ"ל (1 x 106 תאים) בארות של תבשיל תרביות רקמה 6-. טוב.
  2. להכין את חיידק inoculum כפי שמתואר בשלב 2.1-2.3, להדביק תאים עם נפח של inoculum המתאימים MOI של 50 (5 x 107 CFU).
  3. 1.5 שעות פוסט זיהום. מדד מחירי הבתים (. של), לאסוף את המדיה מן הסט הראשון של וולס, הכנס צינור microcentrifuge 1.5 mL עם 500 µL 4% paraformaldehyde (PFA) ומקום על הקרח עד שיסתיים העיבוד של כל בארות.
  4. כדי לאסוף תאיים Lm, להוסיף 1 מ"ל של dsH2O הבאר ואחרי 60 s, להעביר את המים וכתוצאה מכך lysate צינור microcentrifuge 1.5 mL עם 500 µL של 4% מחברים. מערבולת נמרצות עבור 10 s ומקום על הקרח עד שיסתיים העיבוד של כל בארות. (דוגמת עיבוד מתואר בשלב 5.8 להלן).
  5. וולס הנותרים, להסיר מדיה והחלף 1 מ"ל של DMEM/FCS עם גנטמיצין 5 µg/mL כדי להרוג חוץ-תאית Lm ולחזור מיד תאים חממה.
  6. לאחר 30 דקות (2 מדד מחירי הבתים של) להסיר מדיה והחלף DMEM/FCS ללא גנטמיצין.
  7. לאחר 2 ו 4 h (4 ו- 6 מדד מחירי הבתים של) לקחת את השנייה, פעם שלישית נקודות על ידי איסוף lysates ומדיה צעדים 5.3 ו- 5.4.
  8. צנטריפוגה צינורות ב x 10,000 g עבור 7 מינימלית הסר תגובת שיקוע ללא גלולה מטרידה.
  9. להשעות כל גלולה ב מכתים קוקטייל של 50 µL של 4% כדורגלן ו 15 µL של phalloidin. דגירה צינורות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  10. לאחר דגירה להוסיף 1 מ"ל FACS מאגר כל שפופרת של פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
  11. ספין צינורות ב x 10,000 g עבור 7 מינימלית הסר תגובת שיקוע ללא גלולה מטרידה.
  12. להשעות כל גלולה µL 400 FACS מאגר לשימוש מיידי, או 200 µL מאגר FACS, 200 µL של 4% מחברים אם מאחסן לניתוח בשלב מאוחר יותר.
  13. להפעיל דגימות cytometry זרימה וניתוח הנתונים שנאספו.

6. דגימה עיבוד וניתוח של Lm קולוניזציה ותגובות מארח בכבד

  1. להכין Lm זיהום כפי שמתואר בשלב 2.1-2.3.
  2. לחשב את הסכום הדרוש של תת-תרבות עבור כייל הרצוי של 3 x 106 CFU/mL.
  3. בדיוק לפני זיהום לדלל את כמות החיידקים מחושב מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק מראש ומחוממת), נפח סופי של 1 מ"ל. . זה inoculum קלט זה מוזרק לתוך העכבר...
  4. באמצעות מזרק אינסולין 28 G½ 100U, לצייר µL 100 (3 x 105 CFU) של inoculum קלט ולהסיר את כל בועות האוויר גלוי.
  5. למקם את העכבר (זן C57BL/6; גברים בין 6 ל- 12 שבועות) הריסון אחזקות, השתמש מים חמים (לא יותר מ 45 ° C) להתרחב את הווריד הזנב, ואז להזריק את inoculum קלט לתוך הווריד.
  6. צלחת 10-2 ו- 10-3 דילולים של inoculum קלט על גבי לוחות 10bcm אגר ליברות, דגירה בין לילה ב 37 ° C כדי לקבוע את המינון קלט בפועל.
  7. ב. מדד מחירי הבתים, של 18 בצורה הומאנית המתת חסד העכבר (CO2 חנק ואחריו נקע בצוואר הרחם) ושימוש צפק העכבר פתוח לחתוך במספריים סטרילי כדי לאסוף את האונה הקדמית של הכבד באמצעות זוגות נפרדים של פינצטה ומספריים עבור מבחוץ פנימה של העכבר. מקם את הכבד 6 ס מ פטרי על קרח.
  8. חותכים את הכבד לקוביות קטנות ומניחים לתוך בקבוקון זכוכית עם פס מגנטי מערבבים. להוסיף 2 מ של 2 מ"ג/מ"ל collagenase D מחדש DMEM ללא FCS. דגירה הבקבוקונים-37 מעלות צלזיוס על פגים 30−45 דקות. ברגע הרקמה הוא הומוגני, להוסיף 3 מ"ל של DMEM/FCS כדי להשבית את collagenase.
  9. לסנן את התאים דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור חרוטי, הוספת יותר DMEM/FCS במידת הצורך.
  10. צנטריפוגה תאים ב x 800 גרם הצניפה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להסיר את תגובת שיקוע, להשעות את התא גלולה ב 500 µL ACK המאגר כדי lyse כדוריות דם אדומות.
  11. דגירה תאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות במאגר ACK. להשעות תאים 1 מ"ל של DMEM/FCS.
  12. צנטריפוגה תאים ב x 800 גרם הצניפה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להסיר את תגובת שיקוע, להשעות ב 1 מ"ל של DMEM/FCS. אז לספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.
  13. להעביר עונה 1 פרק 106 תאים צינור microcentrifuge 1.5 mL ו spin כדי גלולה. ואז להשעות ב 1 מ"ל של dsH2O ו מערבולת כדי lyse התאים. צלחת µL 50 על צלחות LB-מדולל ו-2 10 דילולים, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, לספור Lm לניתוח CFU.
  14. להעביר עונה 1 פרק 106 תאים לתוך צינורות FACS עבור כל דגימה רקמה על פי הסעיפים תא, לשטוף עם 1 מ"ל של מאגר FACS.
  15. צנטריפוגה תאים ב x 800 גרם הצניפה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולהסיר תגובת שיקוע.
  16. להכין מקוקטייל נוגדן המכיל את הנוגדנים עניין בהתבסס על הריכוז המומלץ עבור כל נוגדן ומאגר FACS. ראה טבלה של החומרים הכמויות המומלצות ניתוח.
  17. להשעות גלולה ב 100 µL של נוגדן קוקטייל, דגירה צינורות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  18. לאחר דגירה, להוסיף 2 מ"ל FACS מאגר כל שפופרת, להשעות את התאים.
  19. צנטריפוגה תאים ב x 800 גרם כדי הצניפה ב 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע. ואז להשעות בגדר µL 400 FACS מאגר לשימוש מיידי, או 200 µL מאגר FACS, 200 µL של 4% מחברים אם אחסון עבור מאוחר יותר.
  20. לנתח תאים ידי cytometry זרימה (ראה שלב 5.13).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הערכת תפקידה של פתוגן וגורמים מקודד מארח להשפיע על זיהום הסלולר
שימוש בתנאים זיהום המתוארים לעיל, 0.15% פראי-סוג הקלט Lm הוא התאושש לאחר h 1.5 של דגירה שיתוף עם תרבותי מקרופאגים (איור 1א'). ב ה 1.5 עוקבות של שיתוף דגירה (3 h פוסט זיהום, מדד מחירי הבתים של), הייתה עלייה 4-fold בחדר התאוששות של קיימא Lm והיה בין 3 ל 6 מדד מחירי הבתים של עלייה 7.5-fold נוספים ההתאוששות של קיימא Lm. מאז גנטמיצין לאנטיביוטיקה תא אטום מתווסף התרבויות שיתוף-מדד מחירי הבתים של 1 כדי לחסל חוץ-תאית Lm, העלייה ברמות Lm קיימא בין מדד מחירי הבתים של 1.5 ו 6 מייצגת באופן בלעדי התפשטות תאיים.

Lm רווחי במהירות הגישה ציטוזול בעקבות הפנמה שלה בתוך התאים האיקריוטים (ראה מבוא). Cytosolic Lm משייכת מכונות פלמור אקטין לפי מה שאומר זה דוחף את עצמו מסוגל לחדור קרום פלזמה. ב וזמינותו זיהום במבחנה שתוארה לעיל, אם גנטמיצין מוסר מן הבארות-מדד מחירי הבתים של 6, חוץ-תאית Lm ניתן בקלות להבחין 1 h מאוחר יותר (7 מדד מחירי הבתים של) בתקשורת שמעליה (איור 1B). CFUs לא נמצאו מבארות שליטה זה היו לא נזרע עם מקרופאגים, אבל זה אחרת טופלו באופן זהה כמו בארות הזריעה ובכך מראה כי המראה של חוץ-תאית Lm היה תלוי לחלוטין על הנוכחות של מקרופאגים, לא תוצאה של לא שלם הרג לאנטיביוטיקה (לא מוצג).

היכולת של Lm כדי לשרוד להתרבות intracellularly תלויה ברובה חבילה של הגנים הם ביטוי אשר נשלט על ידי הגורם שעתוק גורם רגולטורי חיובי (PrfA)1. בתחילה, יש החלמה דומות של המתח Lm פראי-סוג, זן מוטציה Lm למחוק את הפקטור הזה (ΔprfA) (איור 1א'). עם זאת, יש ירידה ההתאוששות של המתחprfA Δ הבאים לאחר דגירה ממושך שיתוף כזה השחזור-מדד מחירי הבתים של 6 באופן מקופלים ל- 3 פחות ההתאוששות-מדד מחירי הבתים של 1.5. כצפוי, relatedly וδprfA חיידקים לא אותרו בתקשורת שמעליה-מדד מחירי הבתים של 7 (איור 1B).

הפעילות של PrfA מוסדר ברמות מרובות. מספר גרסאות PrfA צורונים פעילים, מקודד על ידי היפר-ארסית prfA * אללים, היו מבודדים3. זן Lm הפו prfA * יש פרופיל זיהום ראשוני המקבילה המתח פראי-סוג isogenic-מדד מחירי הבתים 1.5 ו- 3 של (איור 1א'). עם זאת, בין 3 עד 6 מדד מחירי, הבתים של הקיפול-עליית המתח prfA * באופן משמעותי נבדל מזה של המתח פראי-סוג. שוב, relatedly, כצפוי, המתח prfA * זוהה בקלות בתקשורת שמעליה-מדד מחירי הבתים של 7 ברמות וחרגו שתצפית לזן Lm של פראי-סוג (איור 1B) באופן משמעותי.

בעקבות השקתו לתוך ציטוזול, Lm משייכת מכונות פלמור אקטין הסלולר שתוצאתו החיידק להיות עטוף אקטין polymerized. כדי לוודא כי חוץ-תאית Lm נגזרת של ציטוזול אקטין-עשיר של התא המארח נגוע, מקרופאגים היו גם עזב נגוע או נגועים עם GFP-לבטא prfA * זן, התקשורת שמעליה נאסף ב 1.5, 4 ו. מדד מחירי הבתים, של 6 מוכתמים phalloidin נקשר אקטין polymerized, ולא נותחו על ידי cytometry זרימה. מדיה שכיסה מקרופאגים נגוע והן נגוע הכיל אור-פיזור בגודל חיידק חלקיקי החומר (איור 2א), לעומת זאת, המדיה היחידה מן מקרופאגים נגוע דיבוק אותות GFP-חיובית בתוך gating בגודל הזה (איור 2B; החלונית השמאלית). הייתה עלייה תלויי-זמן במראה של מקרופאגים Lm בתקשורת שכיסה נגוע phalloidin-חיוביות (איור 2B; נכון שלושת לוחות). Phalloidin-חיובית המבטאת-GFP Lm אותרו גם lysates שהוכנו נגוע מקרופאגים (איור 2C; החלונית השמאלית). עם זאת, אין phalloidin-חיוביות Lm זוהה lysates שהוכנו מקרופאגים נגוע זן מוטציה לבטא-GFP Lm חסר הגורם התקפה אלימה ActA הנדרשות על מנת לגייס את מכונות פלמור אקטין המשטח החיצוני של Lm בעקבות השקתו לתוך ציטוזול (איור 2C; לוח נכון). תמיכה אלה נתונים בתרחיש לזיהום במבחנה דגם 'מתהווה' חוץ-תאית Lm נגזרות ציטוזול התא הנגוע.

בנוסף Lm-קידוד גורמים, מספר של המארח גורמים כבר זיהו את השפעת זיהום הסלולר Lm (ראה דיון). לאחרונה, הגורם המארח Perforin-2 (P2) הוכח להיות מרכיב קריטי ברמת התא ההגנות נגד מספר פתוגנים חיידקיים. תפליט הצפק מקרופאגים (PEMs) מבודד פראי-סוג (P2+ +) ו- P2- / - עכברים נגועים בתחילה וזהובה מאת Lm כפי שהיא נמדדת assay CFU-מדד מחירי הבתים של 1 (איור 3א). ב- P2+ + PEMs מספר CFUs התאושש-מדד מחירי הבתים של 6 10-fold גדול יותר לעומת רמות התאושש-מדד מחירי הבתים של 1. בדומה ממצאים שפורסמו קודם לכן, ב- P2- / - PEMs מספר CFUs התאושש-מדד מחירי הבתים של 6 הוא 80-fold גדול יותר לעומת רמות התאושש-מדד מחירי הבתים של 14. משופרת Lm התפשטות תאיים ב P2- / - PEMs היה מלווה עם רמות גבוהות של קיימא Lm זוהה בתקשורת שמעליה לעומת רמות זוהה P2+ + PEMs ( איור 3B). נתונים אלו מראים כי ב- assay במבחנה כי המראה של חוץ-תאית מתהווים Lm גם ידווח בגורמים מארח את השפעת זיהום.

זיהום in vivo וניתוח של הכבד
בנוסף מבחני זיהום במבחנה המתוארים לעיל, infectivity היחסית של זנים Lm פראי-סוג הקלוש, hyper-מידבק יכול גם להיות מוערך על ידי מבחני זיהום ויוו. עכברים היו דרך הווריד שיתוף נגועים תערובת שווה של הפראי-סוג זניםprfALm Δ ו- 18 h מאוחר יותר היו בצורה הומאנית מורדמים, כבדי תא נכרת ורווק ההכנות נעשו. תאי הכבד מבודד היו lysed ונחשפו lysates וכתוצאה מכך וזמינותו CFU יכול להבדיל בין זניםprfALm פראי-סוג וδ. לעומת היחס 1:1 בין שני אלה זנים ב inoculum המקורי ('הקלט'), היחס /wild typeprfAΔ-מדד מחירי הבתים של 18 ('פלט') היה פחות מזה אחדות (עבור עכברים 6 טווח היה 0.001 כדי 0.330; מתכוון 0.100) (איור 4). לעומת זאת, עכברים נגועים במשותף עם תערובת שווה של הפראי-סוג של prfA * Lm זנים את prfA */wild type היחס נע בין 2.4 אל 10.2 (אומר 7.1). ניסוי זה מראה כי infectivity היחסית של זנים אלה- Lm שלוש (פראי סוג, ΔprfAו- prfA *) של אורגניזם שלם דומה לזו שנצפתה מבחני זיהום במבחנה.

ניתן לנטר את המחשב המארח גם כדי לקבוע אם רמת infectivity של פראי-סוג, ΔprfA, prfA * זנים שונים הקשורים שינוי הדרגתי המקביל של התגובה החיסונית מולדת. בעבר הוכח כי תושב מקרופאגים (תאי Küpffer), חדירה דלקתיות ומונוציטים ו נויטרופילים לשחק תפקידים קריטיים, לתקצב בהגנה על הכבד במהלך Lm זיהום5,6, 7,8. התאים מקריסטלים של עכברים נגועים בעקבות המתח Lm פראי-סוג ביטוי-GFP עבור 18 h ועכברים נגוע היו מוכתמים סמנים ייחודיים לסוג התא, נותחו על ידי cytometry זרימה. במונחים של תאים שאינם-החיסון של הכבד (למשל, hepatocytes ותאי אנדותל), היו אין הבדלים לזיהוי בין עכברים נגוע ולא נגוע. לעומת זאת, היו שינויים בולטים הקשורים זיהום בכבד מבחינת היחס של תאים חיסוניים מוכתם באופן חיובי אנטיגן משותף לויקוציטים CD45 (איור 5א). באופן ספציפי, עכברים נגועים עם פראי-סוג של prfA*Lm הזנים היו רמות גבוהות באופן משמעותי של CD45+ תאים בכבד בהשוואה לעכברים נגוע, ואילו רמות CD45+ תאים בכבד עכברים נגועים בעקבות המתחprfALm Δ הקלוש לא היו בעיקר שונה מאשר רמות נצפו עכברים נגוע. לאפיין עוד שתי אוכלוסיות תאים חיסוניים תושב, חדירה, CD45+ יכול להיות קידם את התאים subtyped. כפי שנצפה על ידי אחרים9, משמרת הבולטים עם זיהום היא היעלמות כמעט מוחלטת של תושב תאים Küpffer (CD11bאמצע F4/80+בכבד) והמראה בו-זמני של אוכלוסיה שונות של CD11bשלום תאים המייצגות שחדר נויטרופילים (איור 5B; התחתונה האמצעית לוח). גם המופיעים בכבד-מדד מחירי הבתים של 18, הם CD11bאמצע F4/80– תאים מופיעים המייצגים, שכן גם הם Ly6Cהיי, שחדר דלקתיות ומונוציטים (איור 5B; לוחות האמצעי וימינה נמוך). עכברים נגועים תאים האחרון אלה הם התאים היחידים שבהם ניכר GFP אות זוהה בעקבות hs 18 של זיהום (איור 5C). ממצא זה האחרון אינו דומה לו דיווח לאחרונה על ידי ג'ונס ו D'Orazio אשר הראו כי בעכברים, Lm בעיקר קשורה Ly6Cשלום ומונוציטים זה לחדור הבטן בעקבות זיהום שמקורם במזון10. הפרופיל של CD45היי תאי הכבד של עכברים נגועים עם המתחprfA Δ Lm דומה לזה של עכברים נגוע ואילו עכברים נגועים של היפר- LmprfA * מעודו היה בצניעות משופרת רמות של הסתננות נויטרופילים ומונוציטים דלקתיות לעומת עכברים נגועים עם המתח Lm פראי-סוג (נתונים לא מוצג).

Figure 1
איור 1 : זיהום של מקרופאגים המתורבתות מאת ליסטריה (Lm). הקו תא מקרופאג העכבר 264.7 גלם נדבקו במבחנה עם פראי-סוג או Lm (wt; מלא עיגולים), הקלוש Lm (ΔprfA; עיגולים פתוח) או היפר-מידבק (prfA *; פתח ריבועים) זנים Lm (ראה טקסט לפרטים). (א) ב- 1.5, 3 ו- 6 שעות פוסט זיהום. מדד מחירי הבתים (. של), מקרופאגים היו lysed, תוכן סלולרי נותחו על ידי המושבה יוצרי assay יחידה (CFU). (B) נגועים מקרופאגים שטופלו בקצרה גנטמיצין אנטיביוטי כדי למנוע שאינו הפנימו Lm ו- מדד מחירי הבתים של 6 התקשורת בשכבת-על היה אסף נותחו על ידי CFU וזמינותו. קו מנוקד מייצג את מגבלת זיהוי של וזמינותו. כל נקודת נתונים מייצג טוב/זיהום עצמאית, ערכים P נקבעו על ידי מבחן t של סטודנט. הראו התוצאות של ניסוי נציג יחיד מתבצעות שלוש פעמים עם תוצאות דומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : אקטין מכורך Lm נותחו על ידי cytometry זרימה. שורת התאים מקרופאג העכבר 264.7 גלם נותרו גם uninfected או נגוע במבחנה עם הבעת-GFP Lm. התקשורת שמעליה הוסר, centrifuged, ואת החומר שנאסף מוכתם phalloidin מחייב אקטין. החומר מוכתם היה נותחו על ידי cytometry זרימה, המוצג הוא אור-פיזור החלקות (A) המציין את gating המשמש את רמות ה-GFP - ו phalloidin-הקשורים של חוץ-תאית (קרי, מדיה, נגזר) Lm שמוצג (B). (B) האזור המסומן מייצג את ה-GFP/אקטין כפול חיובי Lm ושפע שלהם כאחוז של האירועים הכולל בתוך השערים פיזור אור. (ג) העכבר מקרופאגים נדבקו בנגיף או לבטא-GFP Lm או זן לבטא-GFP Lm שחסרו את הגן קידוד ActA (ΔactA) זה מגייס את מכונות פלמור אקטין של התא המארח Lm תא השטח. . מדד מחירי הבתים, של 6 תאים נגועים היו lysed, תוכן סלולרי שפורסמו, כולל תאיים Lm, היו מוכתם אקטין, נותחו על ידי cytometry זרימה. הראו התוצאות של ניסוי נציג יחיד מתבצעות שלוש פעמים עם תוצאות דומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : זיהום של פראי-סוג ו Perforin-2 נוקאאוט מקרופאגים מאת Lm. מקרופאגים הצפק מבודד גם סוג בר (P2+ +; מלא עיגולים) או נוקאאוט (P2- / -; עיגולים מנוקד) נדבקו במבחנה עם Lm. (א) ב 1 6 מדד מחירי הבתים של מקרופאגים היו lysed ואת תוכן סלולרי נותחו על ידי CFU וזמינותו. (B) מקרופאגים הצפק נגועים שטופלו בקצרה גנטמיצין לאנטיביוטיקה ואת -מדד מחירי הבתים של 2.5 ו-6 התקשורת בשכבת-על היה שנאספו נותחו על ידי CFU וזמינותו. כל נקודת נתונים מייצג טוב/זיהום עצמאית, ערכים P נקבעו על ידי מבחן t של סטודנט. הראו התוצאות של ניסוי נציג יחיד מתבצעות שלוש פעמים עם תוצאות דומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: Lm זיהום של העכבר. קבוצות של עכברים 6 נדבקו בנגיף תערובת שווה של גם פראי-סוג Lm (wt), הקלוש Lm (ΔprfA) זנים או תערובת שווה של פראי-סוג Lm ו- hyper-מידבק (prfA *) זנים. -מדד מחירי הבתים של 18 עכברים פרוטוקול Lm הנטל הכבד נקבע על ידי CFU וזמינותו. בניסוי זה הנו המתח Lm פראי-סוג של ג'ין ההתנגדות לאנטיביוטיקה שמאפשרת להיות מכובד של Lm אנטיביוטיקה רגישים זנים מוטציה. Homogenates כבד מצופים על המכיל אנטיביוטיקה שניהם, היחס של מוטציות ובני פראי-סוג Lm ומדיה תרופתיים שורטטו. הקו המנוקד מייצג את היחס חשבונאי/פראי-סוג של המינון המזהם. ברמות המוחלטות פראי-סוג Lm ב שני גדודים של עכברים היו 12 ו- 15 CFU/106 בכבד תאים, בהתאמה. הראו התוצאות של ניסוי נציג יחיד מבוצעות שתי פעמים עם תוצאות דומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : תגובה חיסונית לזיהום Lm בכבד עכבר. עכברים היו שגם זנים לבטא-CFU של GFP Lm נגוע או מערכתית נגוע עם 2 x 105 על ההכנות תא בודד ה 18 של כבדי נותחו על ידי cytometry זרימה עבור ביטוי של החיסון מיאלואידית ספציפיים או סמנים. (א) האחוז של תאים מכתימים חיובית עבור סמן משטח תאים ספציפיים החיסון CD45+ לכל 106 מבודד הכולל בכבד תאים חיים המוצג עבור עכברים נגוע ועכברים נגוע גם הפראי-סוג (wt Lm), הקלוש (ΔprfA), או Lm זנים hyper-מידבק (prfA *). התוויה הממוצע של שלושה עכברים לכל קבוצה, ערכים P נקבעו על ידי מבחן t של סטודנט. (B) מוצג הפאנלים שמאל הם לפרופיל ההגדלה של הכבד מכתים CD45 תאים בודדים נגוע העכבר (למעלה), של הפרט wt Lm- נגוע (למטה); הפאנלים האמצעית מוצגת רמות הביטוי של סמני מיאלואידית ספציפי CD11b ו- F4/80 של CD45+ תאים; על לוחות נכון מוצג את רמות ביטוי Ly6C של התאים מגודרת המצוין. שבלוח הימני מוצג כיסוי של Ly6C+ תאים מן העכברים נגוע נגועים כולל אחוז, עוצמות קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) של CD11b+ F4/80– תאים חיוביים לשער Ly6C המצוין. המוצג הוא עכבר נציג של עכברים 3 לכל קבוצה. (ג) Ly6C+ תאים שמקורם הכבדים של עכברים נגוע ולא נגוע (המתואר (B); לוחות נכון אמצעית) נותחו לביטוי GFP מאת cytometry זרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בשל תוכנית תהליכית וברכבות זיהום הסלולר שלה, Lm הוא פתוגן אידיאלי כדי לחקור את פעילות הסלולר להשפיע זיהום. זוהו מספר גורמים המארח, המשפיעות באופן חיובי או שלילי Lm זיהום הסלולר11,12,13,14. לארח שתיים כאלה גורמים מאופיין במעבדה שלנו, Perforin-2 ו- Heme מווסת המדכא (P2, שלום), לווסת את תכונות שונות של תהליך זיהום Lm . כפי שמוצג באיור3, תאים לקוי P2 הם רגישים מאוד Lm וגם רגישות משופרת הזה הוא נכון של עכברים knockout4P2. השוואתי מפורט של מקרופאגים לבטא-P2, חשוכת-P2 הראה כי התאים האחרונים נוצר מאוד acidified Lm-המכיל phagosomes שתוצאתם משופרת ביטוי גנים התקפה אלימה. ההיפותזה ביטוי גנים התקפה אלימה דיפרנציאלית תורמת הרגישות משופרת של מקרופאגים חשוכת-P2 נתמכה על ידי שרק היפר-ארסית prfA * להתאמץ, כי, כפי שצוין קודם לכן, מבטא התקפה אלימה גנים ברמה גבוהה צורונים, נגוע לבטא-P2, מקרופאגים חשוכת-P2 מידה4. לפיכך, זמינות היפר- Lm מעודו אפשרו לבדוק את ההשערה כי הגורם המארח P2 מסדיר באופן שלילי הפתוגן התקפה אלימה גורם פריסה. בשביל שלום, הראינו כי גורם מארח זה מסדיר את וגדילת של Lm כך את הופעתה של התא הנגוע היא מוגבלת; זו פעילות תאית הוא כנראה בסיסי עבור הרגישות משופרת של עכברים שלום לקויה של Lm זיהום15,16.

במחקרים שתועדו הסלולר הפעילויות המתרחשות בתוך דקות של זיהום, זה קריטי כי לפני הדגירה שלהם משותף, כי החיידק והן התאים מארח לא יתר על המידה נחשפים לטמפרטורות המשתנות או סביבתיים אחרים תנאי זה יכול להפעיל תגובות הלחץ חופפים (ופעילויות וחיסול) הנוצרות על-ידי זיהום. עבור המחקרים שתוארו לעיל, כולל כאלה נקודות פשוט לכאורה כמו מזעור זמן טיפול של Lm בדיוק לפני ליזום זיהום. לדוגמה, אם תרבות חיידקי הוא יוסר חממה חזק 37 ° C, מותר לשבת על גבי ספסל, שינויי טמפרטורה וחמצן זמינות (בין היתר) יפעיל עיבודים שעשויים להשפיע על השלב הראשוני של עוקבות אינטראקציה עם התא המארח. באופן דומה, התאים המארחים רגישים גם משמרות טמפרטורה ומדיה שעשויים להשפיע על תגובות זיהום ראשוני. למרות בפועל זה בלתי אפשרי לחלוטין לחסל כל תנודות בקטריאלי, התא המארח culturing תנאים, על ידי הפחתת אותם ככל האפשר, והקמת תוכנית הפעלה סטנדרטית, וריאציה בין ניסויים יהיה ממוזער.

משתנה נוסף, אשר לדעתנו חשיבות אשר גם לא מוערך, הוא זה של השימוש באנטיביוטיקה תא תרבות זיהום דגמים. גנטמיצין לעתים קרובות אנטיביוטיקה הבחירה כי זה יחסית אטום קרום פלזמה האיקריוטים. בספרות הן מבוגרים והן הנוכחי, הוא בדרך כלל משמש-µg 50/mL להרוג חוץ-תאית (קרי, ללא-הפנימו) חיידקים. לאחרונה זה ישירות הוכח כי כאשר נוכח µg 25/mL, אין מספיק פיזור של גנטמיצין על פני קרום האיקריוטים להרוג Lmתאיים17. מניסיוננו, רמה זו של גנטמיצין הורג Lm מיד לאחר יצירת קשר, ואילו רמות הרבה יותר נמוך, ב ה-2-5 µg/mL מגוון kill > 99.9% Lm בתוך פחות מ 5 דקות4. לורנס ועמיתיו הראו כי שימוש נרחב גנטמיצין הריכוזים של 25-50 µg/mL גם מספיק כדי להרוג תאיים Yersinia pestis18. מעניין, קבוצה זו גם הראו הבדלים ניכרים בין תא סוגי במונחים של גנטמיצין permeabilization סימון תנאים אופטימליים הזה צריך להיות נחוש כפילת תא כל פתוגן-מארח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK Lysing Buffer Gibco  A1049201
ArC Amine Reactive Compensation Beads  Life Technologies A10346
BHI (Brain Heart Infusion) broth EMD Milipore 110493
Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Collagenase D Roche 11088858001
DMEM media  Gibco  11965-092
FACS tubes  BD Falcon 352054
FBS - Heat Inactivated  Sigma-Aldrich F4135-500ML
Hanks’ Balanced Salt solution Sigma-Aldrich H6648-6X500ML
LB agar Grow Cells MS MBPE-4040
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit  Life Technologies L349S9
Rhodamine Phalloidin  Thermo Fischer R415
SP6800 Spectral Analyzer Sony
Syringe 28 G 1/2" 1cc BD 329461
TPP Tissue Culture 48 Well Plates  MIDSCI TP92048
TPP Tissue Culture 6 Well Plates  MIDSCI TP92406
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42
Antigen
CD11b  Biolegend Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70
CD11c Biolegend Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418
CD45 Biolegend Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11
F4/80 Biolegend Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8
Live/Dead Invitrogen Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100
Ly6C Biolegend Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4
MHC II Biolegend Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2
NK 1.1 Biolegend Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
  2. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
  3. Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
  4. McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
  5. Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
  6. Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
  7. Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
  8. Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
  9. Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
  10. Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
  11. Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  12. Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
  13. Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
  14. Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
  15. Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
  16. Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
  17. Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
  18. VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 144 זיהום עכברים חיידקים פתוגנים ליסטריה cytometry זרימה ביולוגיה של התא
שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gayle, P., Freitag, N. E., Strbo,… More

Gayle, P., Freitag, N. E., Strbo, N., Schesser, K. Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (144), e58775, doi:10.3791/58775 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter