Summary
We beschrijven beide tests in vitro en in vivo infectie die kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de activiteiten van host-encoding factoren.
Abstract
Er zijn een verscheidenheid van strategieën bacteriële pathogenen in dienst om te overleven en eenmaal binnen de eukaryote cel vermenigvuldigen. De zogenaamde 'cytosolische' pathogenen (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisen Rickettsia spp) toegang tot de geïnfecteerde cel cytosol door fysiek en enzymatisch verlaagt het primaire vacuolar membraan. Eenmaal in het cytosol, deze ziekteverwekkers zowel vermenigvuldigen als het genereren van voldoende mechanische krachten te doordringen van het plasma-membraan van de gastheercel om nieuwe cellen infecteren. Hier, laten we zien hoe deze terminal stap van de cellulaire infectie cyclus van L. monocytogenes (Lm) kunnen worden gekwantificeerd door zowel kolonie-vormende eenheid testen en stroom cytometry en voorbeelden geven van hoe beide factoren pathogen - en host-gecodeerde effect dit proces. We tonen ook een nauwe correspondentie van Lm infectie dynamiek van gekweekte cellen in vitro geïnfecteerd en die van de hepatische cellen afgeleid van muizen geïnfecteerd in vivo. Deze functie gebaseerde testen zijn relatief eenvoudig en kunnen gemakkelijk worden opgeschaald voor ontdekking gebaseerde high-throughput schermen voor modulatoren van eukaryotische cel functie.
Introduction
Infectie-gebaseerde experimentele modellen zijn inherent uitdagend vanwege hun afhankelijkheid van de startende staat voorwaarden van de gastheer en ziekteverwekker, de verschillende pathogen infectie strategieën en de moeilijkheid van de toerekening van de pathogeen - en gastinstellingen gestuurde processen gebaseerd op de resultaten. De bacterie Listeria monocytogenes (Lm) is een ideale pathogen sonde host defense reacties vanwege haar genetische en microbiologische werkwillig, haar snelle en processive cellulaire infectie-strategie en de relatief duidelijk geworden relatie tussen de mobiele - en organismic-level infectie fenotypen. De cellulaire infectie van Lm verloopt via vier fasen1: (i) cellulaire invasie die wordt afgesloten met Lm worden omsloten binnen een vacuole; (ii) Lm-gestuurde ontbinding van de vacuole membraan en introductie van Lm in het cytosol; (iii) intracytosolic replicatie; en (iv) fysieke penetratie van het plasma-membraan dat in ofwel de infectie van de direct aangrenzende cellen (zoals in een epitheliale blad) of, in de eenzame cellen resulteert, introductie van Lm in de extracellulaire milieu. Elk van deze fasen worden gepromoot door specifieke Lm-gecodeerd factoren (hierna aangeduid als 'virulentiefactoren') die, wanneer verwijderd, infectie defecten veroorzaken in zowel cellulaire en dierlijke modellen. Deze algemene infectie strategie is onafhankelijk geëvolueerd door een aantal van de zogenaamde 'cytosolische' ziekteverwekkers2.
Kolonie-vormende eenheid (CFU) testen te evalueren zowel in vitro algemeen werkzaam zijn (dat wil zeggen, cellulaire) zo goed als in vivo (d.w.z. organismic) infectie resultaten. Naast hun hoge gevoeligheid, met name voor in vivo infecties, voorzien CFU assays in een duidelijke uitlezing pathogen invasie en intracellulair overleven/proliferatie. CFU testen zijn uitgebreid gebruikt voor het analyseren van zowel Lm en gastheer cel bepalende factoren die van invloed zijn infectie. Zo informatief als deze voorafgaande studies zijn geweest voor het analyseren van cellulaire invasie en intracytosolic replicatie, CFU testen hebben, tot de beste van onze kennis, niet gebruikt voor het bijhouden van de vierde fase van het proces van de infectie Lm : cellulaire ontsnappen. Hier beschrijven we relatief eenvoudig hoe cellulaire ontsnappingsvoorzieningen (hierna te noemen 'opkomst') kan worden gecontroleerd door CFU assay (en stroom cytometry) en Toon voorbeelden van hoe beide factoren pathogen - en host-gecodeerde regelen deze fase van de Lm infectie cyclus. De analyse van de terminale fase van de cellulaire Lm infectie cyclus kan maken het mogelijk om extra pathogenen en host cel infectie-specifieke factoren en activiteiten te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muizen werden humaan behandeld overeenkomstig alle richtlijnen van de desbetreffende overheid voor de verzorging en gebruiken van proefdieren van het National Institutes of Health en het gebruik ervan werd goedgekeurd voor deze hele studie door de Universiteit van Miami institutionele dierenverzorgers en gebruik Comité (protocol 16-053).
1. voorbereiding van de cellen voor infectie
- Muis macrofaag-achtige cellijn RAW 264.7 in DMEM weefsel voedingsbodems aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (voortaan aangeduid als DMEM/FCS) doorgeven met behulp van een kolf van 125 mL en een weefselkweek incubator gehandhaafd op 37 °C/5% CO2.
- De dag voordat de infectie, gebruik een cel schraper te verwijderen van cellen uit de uitbreiding kolf en verzamelen in een schroefdop van de conische tube van 15 mL. Cellen bij 800 x g gedurende 10 minuten centrifugeren, decanteren supernatant schorten de cel pellet in 1 mL DMEM/FCS (zonder antibiotica) en bepalen van de titer die met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller.
-
Aanpassen van de titer tot 2 x 106 cellen/mL en Voeg 0,10 mL (2 x 105 cellen) aan putjes van een 48-well weefselkweek schotel. Zorg ervoor dat de celsuspensie heeft betrekking op het gehele oppervlak van de put.
- De cellen van de plaat in extra putten voor een latere bron van geconditioneerde media. Ook het plaatsen van 0,10 mL van DMEM/FCS in drie aanvullende bronnen om te dienen als een 'cel oncontroleerbaar'.
- Na een nacht bebroeden in een incubator weefselkweek op 37 °C/5% CO2. De volgende dag, Verwijder niet uit incubator totdat de bacterie entmateriaal is bereid en klaar voor gebruik.
2. voorbereiding Listeria monocytogenes (Lm) van de infecties
- Hersenen-hart infusie (BHI) 2 mL beënten met een één kolonie van een vers-streaked agarplaat (< 2 dagen) van Lm en na een nacht bebroeden bij 37 ° C met schudden bij 130 rotaties/min.
- De volgende dag, Voeg 0,10 mL overnachting cultuur tot 2 mL pre opgewarmd BHI en blijven incuberen bij 37 ° C met schudden tot de optische dichtheid (OD600) tussen 0.4 en 0.6 is.
- Geschatte bacteriële titer met behulp van een empirisch afkomstige conversieformule bepalen. In ons lab, een exponentieel groeiende Lm cultuur in BHI is ongeveer 1.3 x 109 kolonievormende eenheden (kve) /OD600. Minimaliseer de hoeveelheid tijd bacteriële culturen worden blootgesteld aan kamertemperatuur.
- Pas de titer tot en met 5 x 107 CFU/mL voorverwarmde DMEM/FCS als oplosmiddel gebruiken vlak voor infectie.
3. infectie
- Werkt snel en precies, Voeg 20 µL (1 x 106 CFU; multipliciteit van infectie, MOI = 5) van de vers bereide Lm entmateriaal (stap 2.4 hierboven) te putten door lichtjes kantelen van de schotel en zorgvuldig het plaatsen van het uiteinde van de pipet in de bovenliggende media;
Opmerking: raak de wanden van de put met de pipet-tip. - Zachtjes Pipetteer de inhoud van elk putje om ervoor te zorgen volledige mengen; niet schudden of kantelen aanzienlijk de plaat, zoals dit zal Lm verspreid over de muren van de put. Cel cultuur schotel terugkomen 37 °C/5% CO2 incubator.
- Bereid een 10 µg/mL gentamicine oplossing met behulp van geconditioneerde media uit niet-geïnfecteerde putten als oplosmiddel.
- Op 30 minuten na de infectie (mpi), zorgvuldig de inhoud van de evenals vóór en terugkeer cel cultuur schotel toevoegen 30 µL van de gentamicine oplossing (eindconcentratie 2,5 µg/mL) en zachtjes Pipetteer aan 37 °C/5% CO2 incubator.
- Oogst op 60 mpi, passende putten voor CFU assay (60 mpi tijdstip) of FCM analyse (zoals hieronder beschreven in de hoofdstukken 4 en 5, respectievelijk).
- Voor de resterende putten, op verschillende tijdstippen daarna ofwel oogst cellen zoals vóór of, voor de bepaling van de opkomst Lm , volledig uit put media verwijderen en met 150 µL van gentamicine-vrije geconditioneerde media vervangen.
4. bemonstering van de verwerking en analyse van intracellulaire en opkomende Lm door CFU Assay
- Oogsten, iets tilt de schotel en verwijder voorzichtig de hele media uit de put. Voeg 0,50 mL gedestilleerd steriel water (dsH2van O) naar de waterput. Na 30 s, dragen de resulterende water lysate (100) voor een tube van 1,5 mL microcentrifuge en vortex krachtig gedurende 10 s.
- 10-1 en 10-2 verdunningen voorbereiden door toe te voegen of 4.5 µL of 50 µL van het water lysate tot 450 µL van dsH2O en kort vortex om homogenisatie van het mengsel.
- Verspreiden van 50 µL van de 100, 10-1 en/of 10-2 monsters op lysogenie Bouillon (LB) agar platen.
- Assay voor opkomende Lm (stap 3.6 hierboven), verwijderen van 10 µL van de overlay-media en het in twee 5 µL aliquots verdelen: aan één aliquot toevoegen 5 µL van DMEM/FCS en het tweede monster 5 µL van DMEM/FCS met 5 µg/mL gentamicine. Het laatste besturingselement wordt onderscheid gemaakt tussen extracellulaire Lm (gentamicine gevoelig) en intracellulaire Lm (gentamicine resistente) in de daaropvolgende CFU assay.
- Na 5 min bij kamertemperatuur, 90 µL van dsH2O, vortex krachtig gedurende 10 s en verspreiding 50 µL toevoegen op LB agar platen.
- Opsommen van Lm kolonies op LB agar platen na 2 dagen incubatie bij 37 ° C.
5. bemonstering van de verwerking en analyse van intracellulaire en opkomende Lm door Stroom Cytometry (FCM)
- Opstellen RAW 264.7 cellen zoals beschreven in stap 1.1-4. Aanpassen van cellen aan 1 x 106 cellen/mL en 1 mL (1 x 106 cellen) toe te voegen aan putjes van een 6-well weefselkweek schotel.
- Bacterie entmateriaal bereiden zoals beschreven in stap 2.1-2.3 en infecteren van cellen met een volume van entmateriaal overeenkomt met een MOI van 50 (5 x 107 CFU).
- 1,5 uur post infectie (hpi), media ophalen eerste set van putten en plaats in een tube microcentrifuge 1,5 mL met 500 µL van 4% paraformaldehyde (PFA) en plaats op ijs totdat alle putjes zijn verwerkt.
- Het verzamelen van intracellulaire Lm, voeg 1 mL dsH2O naar de waterput en na 60 s, de resulterende water lysate overbrengen in een tube microcentrifuge 1,5 mL met 500 µL van 4% PFA. Vortex krachtig gedurende 10 s en plaats op ijs totdat alle putjes zijn verwerkt. (Monster verwerking is beschreven in stap 5,8 hieronder.)
- Voor de resterende putten, media verwijderen en vervangen door 1 mL van DMEM/FCS met 5 µg/mL gentamicine te doden extracellulaire Lm en cellen snel terug te keren naar incubator.
- Na 30 min (2 hpi) media verwijderen en vervangen door DMEM/FCS zonder gentamicine.
- Na 2 en 4 h (4 en 6 hpi) nemen de tweede en derde keer punten door het verzamelen van media en lysates als stap 5.3 en 5.4.
- Centrifugeer buizen bij 10.000 x g gedurende 7 min. verwijderen bovendrijvende vloeistof zonder storende pellet.
- Opschorten van elke pellet in kleuring cocktail van 50 µL van 4% PFA en 15 µL van phalloidin. Incubeer buizen in het donker bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
- Voeg na een incubatieperiode van 1 mL FACS buffer aan elke buis en Pipetteer omhoog en omlaag te mengen.
- Spin buizen bij 10.000 x g gedurende 7 min. verwijderen bovendrijvende vloeistof zonder storende pellet.
- Opschorten van elke pellet in 400 µL van FACS buffer voor onmiddellijk gebruik of 200 µL van FACS buffer en 200 µL van 4% PFA als slaan voor latere analyse.
- Voorbeelden van op een stroom cytometry uitvoeren en analyseren van de verzamelde gegevens.
6. bemonstering van de verwerking en analyse van Lm kolonisatie en Host Reacties in de lever
- Voorbereiden op Lm infectie zoals beschreven in stap 2.1-2.3.
- Bereken de benodigde hoeveelheid subcultuur voor gewenste titer van 3 x 106 CFU/mL.
- Verdun de hoeveelheid berekende bacteriën met voorverwarmde Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) in een eindvolume van 1 mL enkel voorafgaand aan de infectie. Dit is de input entmateriaal die is geïnjecteerd in de muis.
- Behulp van een 28 G½ 100U insuline spuit, trekken 100 µL (3 x 105 van CFU) input entmateriaal en zichtbare luchtbellen te verwijderen.
- Plaatst u de muisaanwijzer (stam C57BL/6; mannen tussen 6 en 12 weken oud) in het bedrijf terughoudendheid en gebruik warm water (niet meer dan 45 ° C) de staart ader te verwijden, dan de invoer entmateriaal injecteren in de ader.
- Plaat 10-2 en 10-3 verdunningen van het input entmateriaal op LB agar 10bcm platen en na een nacht bebroeden bij 37 ° C te bepalen van de werkelijke invoer dosering.
- Op 18 hpi, humaan euthanaseren muis (CO2 verstikking gevolgd door cervicale dislocatie) en het gebruik van steriele schaar geslepen open muis buikvlies voor het verzamelen van de frontale kwab van de lever met behulp van afzonderlijke paren schaar of pincet voor de buitenkant en binnenkant van de muis. Plaats de lever in een 6 cm petrischaal op ijs.
- Snijd de lever in kleine blokjes en leg in een glazen ampul met een magnetische roer bar. Voeg toe 2 mL 2 mg/mL collagenase D gereconstitueerd in DMEM zonder FCS. Incubeer flesjes bij 37 ° C op een magneetroerder voor 30−45 min. Zodra het weefsel is gehomogeniseerd, voeg 3 mL DMEM/FCS voor inactivering van de collagenase.
- Filtreer de cellen door een 70 µm cel zeef in een conische buis, meer DMEM/FCS toe te voegen indien nodig.
- Centrifugeer cellen bij 800 x g pellet bij 4 ° C gedurende 10 min, verwijderen van supernatant en Suspendeer cel pellet in 500 µL van ACK buffer lyse van rode bloedcellen.
- Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 min. in ACK buffer. Cellen in 1 mL DMEM/FCS opschorten.
- Centrifugeer cellen bij 800 x g pellet bij 4 ° C gedurende 10 min, verwijderen van supernatant en Suspendeer in 1 mL van DMEM/FCS. Vervolgens met behulp van een hemocytometer of een teller geautomatiseerde cel cellen te tellen.
- 1 x 106 cellen naar 1,5 mL microcentrifuge buis en spin te pellet overbrengen. Dan opschorten in 1 mL dsH2O en vortex Lyse de cellen. Typeplaatje 50 µL op LB platen op onverdunde en 10-2 verdunningen en Incubeer bij 37 ° C bij het inventariseren van Lm CFU p.a..
- 1 x 106 cellen overboeken naar FACS buizen voor elk weefsel monster volgens de graven van de cel en wassen met 1 mL FACS buffer.
- Centrifugeer cellen bij 800 x g pellet bij 4 ° C gedurende 10 minuten en verwijder de bovendrijvende vloeistof.
- Voorbereiden van een antilichaam cocktail met de antilichamen van belang op basis van de aanbevolen concentratie voor elke antilichaam en FACS buffer. Zie Tabel van materialen voor aanbevolen hoeveelheden gebruikt bij de analyse.
- Schorten pellet in 100 µL van antilichaam cocktail en buizen in het donker bij 4 ° C gedurende 30 minuten uit te broeden.
- Na incubatie, voeg toe 2 mL FACS buffer aan elke buis en schorten cellen.
- Centrifugeer cellen bij 800 x g pellet bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen. Vervolgens Suspendeer de pellet in 400 µL van FACS buffer voor onmiddellijk gebruik of 200 µL van FACS buffer en 200 µL van 4% PFA als opslaan voor later.
- Analyseren van cellen door stroom cytometry (zie stap 5.13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beoordeling van de rol van pathogenen en host-gecodeerde factoren invloed van cellulaire infectie
De voorwaarden van de infectie hierboven beschreven gebruiken, wordt 0,15% van de invoer van wild-type Lm hersteld na 1,5 uur van co incubatie met gekweekte macrofagen(Figuur 1). In de daaropvolgende 1,5 h co incubatietijd (3 h post infectie, hpi), was er een toename van de terugwinning van levensvatbare Lm 4-fold en van 3 tot 6 hpi was er een extra verhoging van de 7.5-fold bij het herstel van levensvatbare Lm. Aangezien de cel-ondoordringbare antibioticum gentamicine wordt toegevoegd aan de co culturen op 1 hpi te elimineren extracellulaire Lm, vertegenwoordigt de 30-fold stijging van de levensvatbare Lm niveaus tussen de 1,5 en 6 hpi uitsluitend intracellulaire proliferatie.
LM krijgt snel toegang tot het cytosol na haar internalisering binnen eukaryotische cellen (Zie Inleiding). Cytosolische Lm koppelt aan de actine polymerisatie machines door waardoor het stuwt zelf kunnen doordringen van het plasma-membraan. In de in vitro infectie assay hierboven beschreven, als gentamicine wordt verwijderd uit de putten op 6 hpi, extracellulaire Lm kan gemakkelijk gedetecteerd worden 1 uur later (7 hpi) in de bovenliggende media (Figuur 1B). Geen CFUs werden teruggevonden uit controleputjes die niet waren bezaaid met macrofagen maar die werden anders behandeld identiek als geplaatste wells waardoor waaruit blijkt dat het uiterlijk van extracellulaire Lm volledig afhankelijk van de aanwezigheid van de macrofagen was en niet een gevolg van onvolledige antibiotica doden (niet afgebeeld).
Het vermogen van Lm om te overleven en intracellulair te vermenigvuldigen is grotendeels afhankelijk van een suite van genen waarvan de expressie worden gecontroleerd door de transcriptiefactor positieve regelgevende Factor A (PrfA)1. Aanvankelijk, is er een vergelijkbare herstel van de wild-type Lm stam en een gemuteerde stam van Lm verwijderd voor deze factor (ΔprfA)(Figuur 1). Er is echter een verdere verlaging in het herstel van de stam van deprfA Δ na een incubatieperiode van langdurige samenwerking zodanig zijn dat het herstel bij 6 hpi 3 katernen minder dan het herstel bij 1,5 hpi. Relatedly en onverwacht, zijn ΔprfA bacteriën niet waargenomen in de bovenliggende media op 7 hpi (Figuur 1B).
De activiteit van PrfA wordt geregeld op meerdere niveaus. Een aantal constitutively actieve PrfA varianten, gecodeerd door hyper-virulente prfA * allelen, geweest geïsoleerde3. Een stam van de Lm bezitten een prfA * heeft een eerste infectie-profiel dat vergelijkbaar is met de isogene wild-type stam op 1.5 en 3 hpi(Figuur 1). Echter, tussen 3 en 6 hpi, de fold-verhoging van de prfA -stam aanzienlijk verschilden van die van de stam van de wild-type. Opnieuw, relatedly en onverwacht, was de prfA -stam gemakkelijk gedetecteerd in de bovenliggende media op 7 hpi op een niveau dat aanzienlijk overschreden die waargenomen voor de wild-type Lm stam (Figuur 1B).
Na haar vrijlating in het cytosol, Lm koppelt aan de cellulaire actine polymerisatie machines die resulteert in de bacterie wordt omgeven door gepolymeriseerde actine. Om te bevestigen dat de extracellulaire Lm is afgeleid van de actine-rijke cytosol van de geïnfecteerde gastheercel, waren macrofagen ofwel links niet geïnfecteerde of geïnfecteerd met een uiting van het GFP prfA * stam en de bovenliggende media werd verzameld op 1.5, 4 en 6 hpi, gekleurd met phalloidin die gepolymeriseerde actine bindt, en geanalyseerd door stroom cytometry. Media bedekken van zowel niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde macrofagen opgenomen licht-verstrooiing bacterie-en kleinbedrijf zwevende deeltjes(Figuur 2), echter alleen media van besmette macrophages GFP-positieve signalen binnen deze grootte gating bezeten (Figuur 2B, linkerpaneel). Er was een tijd-afhankelijke toename van het uiterlijk van de phalloidin-positieve Lm in de media overlappend met geïnfecteerde macrofagen (Figuur 2B; rechts drie panelen). Phalloidin-positieve GFP-uiten Lm werden ook ontdekt in lysates bereid uit besmette macrophages (Figuur 2C; linkerpaneel). Echter werd geen phalloidin-positieve Lm ontdekt in lysates bereid uit macrofagen besmet met een uiting van het GFP Lm gemuteerde stam dat ontbrak de virulentiefactor ActA die vereist is voor het werven van de actine-polymerisatie-machines aan de buitenste oppervlakte van Lm na haar vrijlating in het cytosol (Figuur 2C; rechterpaneel). De steun van deze gegevens een scenario dat in een in vitro infectie 'emergente' extracellulaire Lm model zijn afgeleid van de geïnfecteerde cel cytosol.
Naast Lm-codering factoren, een aantal gastheer factoren geweest vastgesteld dat effect Lm cellulaire infectie (Zie discussie). Onlangs, de gastheer factor Perforine-2 (P2) is aangetoond dat een essentieel onderdeel van cel-niveau verdedigingen tegen allerlei bacteriële pathogenen worden. Peritoneale afgescheiden macrofagen (PEMs) geïsoleerd van wild-type (P2+/ +) en P2- / - muizen worden in eerste instantie vergelijkbaar besmet door Lm zoals gemeten door CFU assay op 1 hpi (Figuur 3A). In P2+/ + PEMs hetaantal CFUs ving op 6 hpi is 10-fold groter ten opzichte van de niveaus op 1 hpi hersteld. Vergelijkbaar met de eerder gepubliceerde bevindingen, in P2- / - PEMs hetaantal CFUs ving op 6 hpi 80-fold groter is in vergelijking met de niveaus op 1 hpi4hersteld. Verbeterde Lm intracellulaire proliferatie in P2- / - PEMs ging gepaard met grotere niveaus van levensvatbare Lm gedetecteerd in de bovenliggende media ten opzichte van niveaus ontdekt in P2+/ + PEMs ( Figuur 3B). Deze gegevens tonen aan dat in een in-vitro-assay dat het uiterlijk van opkomende extracellulaire Lm ook verslag over gastheer factoren die effect-infectie uitbrengen kan.
In vivo infectie en analyse van de lever
Naast de in vitro infectie testen hierboven beschreven, kan de relatieve infectiviteit van het wild-type, verzwakte en hyper-virulente stammen van Lm ook worden geëvalueerd door een in vivo infectie testen. Muizen waren intraveneus mede besmet met een gelijke mix van het wild-type en ΔprfALm stammen en 18 h later werden humaan euthanized, levers verwijderde en één cel voorbereidingen werden getroffen. Geïsoleerde cellen van de lever werden lysed en de resulterende lysates onderworpen aan een CFU-test die onderscheid tussen de wild-type en ΔprfALm -stammen maken kan. Vergeleken met de 1:1 verhouding van deze twee stammen in de oorspronkelijke entmateriaal (de ' input'), ΔprfA/wild type was de verhouding op 18 hpi (de ' uitgang') aanzienlijk minder dan de eenheid (voor 6 muizen bereik was 0.001 tot 0.330; bedoel 0.100) (Figuur 4). In tegenstelling, muizen mede besmet met een gelijke mix van het wild-type en prfA * Lm stammen van de prfA */wild type ratio's varieerden van 2,4 tot 10.2 (bedoel 7.1). Dit experiment toont aan dat de relatieve infectiviteit van deze drie stammen van de Lm (wild type, Δ,prfAen prfA *) in een intact organisme gelijkt op die is waargenomen in in vitro infectie testen.
De host kan ook worden gecontroleerd om te bepalen of de variërende hoeveelheid infectiviteit van het wild-type, Δ,prfAen prfA * stammen zijn geassocieerd met een overeenkomstige gradatie van de aangeboren immuunrespons. Eerder is aangetoond dat ingezeten macrofagen (Küpffer cellen) en het infiltreren van inflammatoire monocyten en neutrofielen spelen kritisch en onderling samenhangende rollen in het beschermen van de lever tijdens Lm infectie5,6, 7,8. Cellen die zijn bereid uit niet-geïnfecteerde muizen en muizen geïnfecteerd met het uiten van GFP wild-type Lm stam voor 18u werden gekleurd met cel type-specifieke markers en geanalyseerd door stroom cytometry. In termen van niet-immune cellen van de lever (bijvoorbeeld hepatocyten en endotheliale cellen) waren er geen aantoonbare verschillen tussen niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde muizen. Daarentegen waren er opmerkelijke infectie-gerelateerde veranderingen in de lever in termen van het aandeel van de immune cellen die positief gekleurd voor de leukocyten gemeenschappelijk antigeen CD45 (Figuur 5A). Specifiek, muizen geïnfecteerd met de wild-type en prfA*Lm stammen hadden aanzienlijk hogere niveaus van CD45+ cellen in de lever in vergelijking met niet-geïnfecteerde muizen, overwegende dat de niveaus van CD45+ cellen van de lever in muizen die geïnfecteerd het waren niet met name anders dan bij niet-geïnfecteerde muizen waargenomen niveaus met de verzwakte ΔprfALm stam. Om te verder karakteriseren beide verblijvende en infiltreren immuun cel populaties, CD45+ cellen kunnen worden bevorderd subtyped. Zoals opgemerkt door anderen9, een opmerkelijke verschuiving met infectie is de bijna volledige verdwijning van ingezetene Küpffer cellen (CD11bmedio F4/80+in de lever) en de daarmee gepaard gaande verschijning van een aparte populatie van CD11bHallo cellen die vertegenwoordigen infiltreren neutrofiele granulocyten (Figuur 5B; lagere midden paneel). Ook verschijnend in de lever op 18 hpi, zijn CD11bmedio F4/80- -cellen weergegeven die, omdat ze ook Ly6CHallo, vertegenwoordigen infiltreren inflammatoire monocyten (Figuur 5B; lager midden en rechts panelen). Bij besmette muizen zijn deze laatstgenoemde cellen de enige cellen waarin aanzienlijke GFP werd signaal na 18 hs van infectie (Figuur 5C). Deze laatste bevinding is vergelijkbaar met die onlangs gemeld door Jones en D'Orazio die liet zien dat bij muizen, Lm vooral wordt geassocieerd met Ly6CHallo monocyten die infiltreren in de darm dat voedsel overgedragen infectie10na. Het profiel van CD45hi cellen van de lever van muizen geïnfecteerd met de Lm ΔprfA stam leek op dat van niet-geïnfecteerde muizen overwegende dat muizen geïnfecteerd met de hyper-virulente stam LmprfA * bescheiden niveaus van had verbeterd Infiltrerend neutrofielen en inflammatoire monocyten in vergelijking met muizen geïnfecteerd met de wild-type Lm stam (gegevens niet worden weergegeven).
Figuur 1 : Infectie van de gekweekte macrofagen door Listeria monocytogenes (Lm). De muis macrofaag cellijn RAW 264.7 besmet waren in vitro met beide wild-type Lm (wt; gevulde cirkels), verzwakte Lm (ΔprfA; open cirkels) of hyper-virulente (prfA *; open pleinen) Lm stammen (zie tekst voor meer informatie). (A) op 1.5, 3 en 6 uren post infectie (hpi), macrofagen waren lysed en de cellulaire inhoud werden geanalyseerd door kolonievormend eenheid (CFU) assay. (B) Infected macrofagen werden kort behandeld met het antibioticum gentamicine te heffen van niet-geïnternaliseerd Lm en op 6 hpi de overlay media was verzameld en geanalyseerd door CFU assay. Gestippelde lijn vertegenwoordigt de detectiegrens van de bepaling. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een onafhankelijke goed/infectie en P-waarden werden bepaald door de Student t-test. Getoond worden de resultaten van een enkele vertegenwoordiger experiment uitgevoerd driemaal met vergelijkbare resultaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Actine-gebonden Lm geanalyseerd door stroom cytometry. De muis macrofaag cellijn RAW 264.7 bleven ofwel niet-geïnfecteerde of besmet in vitro met GFP-uiten Lm. De bovenliggende media werd verwijderd, gecentrifugeerd, en de verzamelde materiaal gekleurd met actine-bindende phalloidin. Het gekleurd materiaal werd geanalyseerd door stroom cytometry en komt te staan is de licht-verstrooiing percelen (A) die aangeeft het gating gebruikt voor de GLP - en phalloidin-geassocieerde niveaus van extracellulaire (dat wil zeggen, media-afgeleid) Lm in (B) weergegeven. (B) het aangegeven gebied vertegenwoordigt de dubbele positieve GFP/actine Lm en hun overvloed in procenten van de totale gebeurtenissen binnen de poorten van de licht-verstrooiing. (C) muis macrofagen waren besmet met GFP-uiten Lm of een uiting van het GFP Lm stam ontbreekt het gen ActA (ΔactA) dat werft de actine-polymerisatie-machine van de gastheercel te coderen de LM celoppervlak. 6 hpi, geïnfecteerde cellen werden lysed en de vrijgegeven cellulaire inhoud, met inbegrip van de intracellulaire Lm, werden gekleurd voor actine en geanalyseerd door stroom cytometry. Getoond worden de resultaten van een enkele vertegenwoordiger experiment uitgevoerd driemaal met vergelijkbare resultaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Infectie van wild-type en Perforine-2 knock-out macrofagen door Lm. Peritoneale macrofagen geïsoleerd van hetzij een wild-type (P2+/ +; gevuld cirkels) of knock-out (P2- /-; gestippelde cirkels) in vitro met Lmwerden besmet. (A) op 1 en 6 hpi, macrofagen waren lysed en de cellulaire inhoud geanalyseerd door CFU assay. (B) Infected peritoneale macrofagen werden kort behandeld met het antibioticum gentamicine en op de 2.5 en 6 hpi de overlay media werd verzameld en geanalyseerd door CFU assay. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een onafhankelijke goed/infectie en P-waarden werden bepaald door de Student t-test. Getoond worden de resultaten van een enkele vertegenwoordiger experiment uitgevoerd driemaal met vergelijkbare resultaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Lm infectie van de muis. Groepen 6 muizen werden besmet met een gelijke mix van ofwel de wild-type Lm (wt) en verzwakt Lm (ΔprfA) stammen of een gelijke mix van de wild-type Lm en hyper-virulente (prfA *) stammen. Op 18 hpi muizen de Lm werd last in de lever bepaald door CFU assay. In dit experiment bezit de wild-type Lm stam een antibioticum-resistentie gen waarmee het te onderscheiden van het antibioticum-gevoelige Lm gemuteerde stammen. Lever homogenates waren vergulde op beide antibioticum-bevattende en antibioticum-vrije media en de verhouding tussen de mutant en wild-type Lm werden uitgezet. De stippellijn geeft de verhouding van de mutant/wild-type van de infecteren dosis. De absolute niveaus van het wild-type Lm in de twee cohorten van muizen waren 12 en 15 CFU/106 lever cellen, respectievelijk. Getoond worden de resultaten van een enkele vertegenwoordiger experiment uitgevoerd tweemaal met vergelijkbare resultaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Immunologische reactie op Lm infectie in de lever muis. Muizen waren dat ofwel niet-geïnfecteerde of systemisch geïnfecteerd met 2 x 105 CFU van GFP-uiten Lm stammen voor 18 h. eencellige preparaten van levers werden geanalyseerd door stroom cytometry voor expressie van immuun - en myeloïde-specifieke markers. (A) het percentage cellen kleuring positief voor de immuun-specifieke cel oppervlakte markering CD45+ per 106 geïsoleerde totale levende cellen van de lever weergegeven voor niet-geïnfecteerde muizen en muizen die besmet zijn met ofwel de wild-type (wt Lm), verzwakt (ΔprfA), of Lm stammen hyper-virulente (prfA *). Uitgezet is het gemiddelde van de drie muizen per groep en P-waarden werden bepaald door de Student t-test. (B) getoond in de linker panelen zijn de kleuring Profiel van CD45-kleuring lever cellen van een afzonderlijke niet-geïnfecteerde muis (boven) en een individuele wt Lm- besmet (onder); in de middelste panelen wordt de expressie niveaus van myeloïde-specifieke markers CD11b en F4/80 van de CD45+ cellen; en op de juiste panelen de Ly6C expressie niveaus van de aangegeven gated cellen wordt weergegeven. In het rechtse paneel wordt weergegeven een overlay van de Ly6C+ cellen van het niet geïnfecteerde en geïnfecteerde muizen met inbegrip van het percentage en de gemiddelde fluorescentie intensiteiten (MFI's) van de CD11b+ F4/80- cellen positief voor de aangegeven Ly6C poort. Een representatieve muis van 3 muizen per groep wordt getoond. (C) Ly6C+ cellen afgeleid van lever van niet geïnfecteerde en geïnfecteerde muizen ((B) beschreven; midden en rechts panelen) werden geanalyseerd voor GFP expressie door stroom cytometry. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanwege zijn snelle en processive cellulaire infectie programma is Lm een ideale pathogen sonde van cellulaire activiteiten die van invloed zijn infectie. Een aantal gastheer factoren geïdentificeerd die positief dan wel negatief Lm cellulaire infectie11,12,13,14 beïnvloeden. Twee dergelijke gastheer factoren gekenmerkt in ons laboratorium, Perforine-2 en de Heem geregeld remmer (P2 en hI), reguleren verschillende functies van het proces van de infectie Lm . Zoals blijkt uit Figuur 3, P2 gebrekkig cellen zijn zeer gevoelig voor Lm en deze verbeterde gevoeligheid ook geldt voor de P2 knock-out muizen4. Gedetailleerde vergelijkende studies van P2-uiten en P2-deficiënte macrofagen bleek dat de laatstgenoemde cellen gevormd sterk aangezuurde Lm-bevattende phagosomes, dat resulteerde in virulentie genexpressie verbeterd. De hypothese dat differentiële virulentie genexpressie aan de verbeterde gevoeligheid van P2-deficiënte macrofagen bijdraagt werd gesteund door de bevinding dat de hyper-virulente prfA * stam, dat, als gezegd, spreekt virulentie genen op een constitutively hoog niveau, besmet P2-uiten en P2-deficiënte macrofagen evengoed4. Dus, de beschikbaarheid van een hyper-virulente stam van Lm maakte het mogelijk om te testen van de hypothese dat de P2 host factor negatief pathogeen virulentie factor implementatie regelt. Voor Hallo, we hebben laten zien dat deze host factor regelt de intracellulaire mensenhandel Lm zodanig dat de opkomst van de geïnfecteerde cel beperkt is; deze cellulaire activiteit is waarschijnlijk de basis voor de verbeterde gevoeligheid van hI-deficiënte muizen voor Lm infectie15,16.
In studies die gedocumenteerd cellulaire activiteiten die zich voordoen binnen minuten na infectie, is het van cruciaal belang dat vóór hun co incubatie, dat zowel de bacteriën en de cellen van de gastheer niet overdreven zijn blootgesteld aan schommelende temperaturen of andere milieu voorwaarden die stress reacties die elkaar overlappen (en verwarren) infectie-geïnduceerde activiteiten kunnen activeren. Voor de studies die hierboven beschreven, omvat dit deze schijnbaar eenvoudige punten als het minimaliseren van de verwerkingstijd van Lm net alvorens aan te vangen van de infectie. Bijvoorbeeld, als een bacteriële cultuur is verwijderd uit een schudden 37 ° C incubator en toegestaan om te zitten op een bank boven, zal verschuivingen in zowel de temperatuur en zuurstofconcentratie beschikbaarheid (onder andere) activeren aanpassingen die gevolgen voor de eerste fase van de latere hebben kunnen interactie met de gastheercel. Ook de gastheer cellen zijn ook gevoelig voor temperatuur en media verschuivingen die invloed kunnen hebben op de reacties van de initiële infectie. Hoewel in de praktijk is het onmogelijk om volledig te elimineren alle schommelingen in bacteriële en gastheercel culturing voorwaarden, door deze zoveel mogelijk te beperken en tot vaststelling van een standaard exploitatieplan, variatie tussen de experimenten zullen worden geminimaliseerd.
Een extra variabele, die naar onze mening het belang daarvan ook ondergewaardeerde is, is die van het gebruik van antibiotica in de cel cultuur infectie modellen. Gentamicine is vaak het antibioticum van keuze, omdat het relatief ondoordringbaar zijn voor de eukaryote plasmamembraan. In zowel de huidige als de oudere literatuur, is het over het algemeen gebruikt op 50 µg Mo/mL te doden extracellulaire (dat wil zeggen, niet-geïnternaliseerd) bacteriën. Onlangs is direct gebleken dat indien aanwezig bij 25 µg/mL, er voldoende verspreiding van gentamicine over de eukaryote membraan is te intracellulaire Lm17doden. In onze ervaring, dit niveau van gentamicine doodt Lm onmiddellijk bij contact, overwegende dat veel lagere niveaus, in de 2 tot en met 5 µg/mL bereik doden > 99,9% Lm in minder dan 5 min4. Lawrenz en collega's hebben aangetoond dat de gebruikte gentamicine-concentraties van 25 – 50 µg/mL zijn ook voldoende zijn om te doden van intracellulaire Yersinia pestis18. Interessant is dat deze groep bleek ook aanzienlijke verschillen tussen de cel typen in termen van gentamicine permeabilization benadrukken dat optimale omstandigheden moeten worden bepaald voor elke koppeling van de cel van de pathogeen-host.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS - Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28 G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
References
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
- Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
- Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
- Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
- Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
- Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
- Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
- Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
- Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
- Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
- Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
- Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
- Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
- Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
- VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).
