Summary
Vi beskriver både in vitro- og in vivo infektion assays, der kan bruges til at analysere aktiviteterne i host-kodning faktorer.
Abstract
Der er en række forskellige strategier bakterielle patogener ansætte til at overleve og formere sig en gang inde i den eukaryote celle. De såkaldte 'kemi' patogener (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisog Rickettsia spp.) få adgang til den inficerede celle cytosol af fysisk og enzymatisk nedværdigende primære vacuolar membranen. En gang i cytosol, disse patogener såvel formere sig som generere tilstrækkelig mekaniske kræfter at trænge igennem plasma membranen af cellen vært for at inficere nye celler. Her viser vi hvordan denne terminal trin af den cellulære infektion cyklus af L. monocytogenes (Lm) kan kvantificeres ved både kolonidannende enhed assays og flowcytometri og give eksempler på, hvordan både patogen - og host-kodet faktorer indvirkning dette proces. Vi også vise en tæt korrespondance af Lm infektion dynamikken i kulturperler celler inficeret in vitro- og dem af hepatiske celler, der stammer fra mus inficeret in vivo. Disse funktion-baserede assays er relativt simple og let kan skaleres til discovery-baserede høj overførselshastighed skærme for modulatorer af eukaryote cellefunktion.
Introduction
Infektion-baserede eksperimentelle modeller er i sagens natur udfordrende på grund af deres afhængighed af start stat betingelserne for vært og patogen, de forskellige patogen infektion strategier og vanskeligheden ved at tillægge patogen og værtsinitierede processer baseret på resultater. Bakterien Listeria monocytogenes (Lm) er blevet en ideel patogen at sonde vært forsvar svar på grund af dens genetiske og mikrobiologiske sporbarhed, sin hurtige og processive cellulær infektion strategi og den relativt klart forholdet mellem dens cellulær - og organismens-niveau infektion fænotyper. Den cellulære infektion af Lm gennemløber fire særskilte faser1: (i) cellulære invasion, der afslutter hos Lm er indkapslet i en vacuole; (ii) Lm-instrueret opløsning af vacuole membran og frigivelse af Lm i cytosol; (iii) intracytosolic replikering; og (iv) fysiske penetration af plasma membran, som resulterer i enten infektionen direkte tilstødende celler (f.eks. i en epitelial ark) eller ensomme celler, frigivelse af Lm i det ekstracellulære miljø. Hver af disse faser er fremmet af specifikke Lm-kodet faktorer (benævnt "virulens faktorer"), når slettet, forårsage infektion defekter i cellulær og animalske modeller. Denne generelle infektion strategi har været selvstændigt udviklet sig af en række af de såkaldte 'kemi' patogener2.
Kolonidannende enhed (CFU) assays er bredt ansat til at evaluere både in vitro (dvs., cellulære) samt in vivo (dvs. organismens) infektion resultater. Ud over deres høj følsomhed, især for in vivo infektioner, give CFU assays en utvetydig udlæsning for patogenet invasion og intracellulære overlevelse/spredning. CFU assays har været flittigt brugt til at analysere både Lm og vært celle determinanter, der påvirker infektion. Så informativ som disse forudgående undersøgelser har været at analysere cellulære invasion og intracytosolic replikering, CFU assays har ikke, at bedst af vores viden, blevet brugt til at spore den fjerde fase af Lm infektion proces: cellulære undslippe. Her beskriver vi relativt simpel, hvordan cellulære udgangsveje (i det følgende benævnt 'opståen') kan overvåges ved CFU assay (samt ved flowcytometri) og Vis eksempler på hvordan både patogen - og host-kodet faktorer regulere denne fase af Lm infektion cyklus. Analyse af den terminale fase af cellulære Lm infektion cyklus kan gøre det muligt at identificere yderligere patogen og vært celle infektion-specifikke faktorer og aktiviteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus blev behandlet humant i overensstemmelse med alle relevante offentlige retningslinjer for pleje og brug af forsøgsdyr af National Institutes of Health og deres anvendelse blev godkendt til denne hele studiet ved University of Miami institutionelle dyrs pleje og brug Udvalget (protokol 16-053).
1. forberedelse celler for infektion
- Udbrede mus makrofag-lignende cellelinie RAW 264.7 i DMEM vævskultur media suppleret med 10% føtalt kalveserum (herefter benævnt DMEM/FCS) ved hjælp af en 125 mL kolbe og en vævskultur inkubator vedligeholdes på 37 °C/5% CO2.
- Dagen før infektionen, bruge en celle skraber til at fjerne celler fra ekspansion kolben og indsamle i en 15 mL skruelåg koniske rør. Centrifugeres celler ved 800 x g i 10 min., dekanteres og suspendere celle pellet i 1 mL DMEM/FCS (uden antibiotika) og bestemme titer ved hjælp af en hemocytometer eller en automatiseret celle counter.
-
Justere titer på 2 x 106 celler/mL og tilføje 0,10 mL (2 x 105 celler) til wells af en 48-godt vævskultur parabol. Sikre at cellesuspension dækker hele overfladen af brønden.
- Plade celler i yderligere brønde for en senere kilde af konditioneret medier. Også placere 0,10 mL af DMEM/FCS i tre yderligere wells til at tjene som en 'ingen celle kontrol'.
- Der inkuberes natten over i en vævskultur inkubator på 37 °C/5% CO2. Den næste dag, Fjern ikke fra rugemaskinen, indtil bakterie inokulum er rede og klar til brug.
2. udarbejdelsen af Listeria monocytogenes (Lm) for infektion
- Podes 2 mL af hjerne-hjerte infusion (BHI) med en enkelt koloni fra en frisk stribet agar plade (< 2 dage) af Lm og inkuberes natten over ved 37 ° C under omrystning på 130 omdrejninger/min.
- Den næste dag, tilføje 0,10 mL af overnight kultur til 2 mL pre varmede BHI og fortsætte inkubation ved 37 ° C under omrystning, indtil det optisk densitet (OD600) er mellem 0,4 og 0,6.
- Bestemme omtrentlige bakteriel titer ved hjælp af en empirisk afledt Omregningsformel. I vores laboratorium, en eksponentielt voksende Lm kultur i BHI er ca. 1,3 x 109 kolonidannende enheder (CFU) /OD600. Minimere mængden tid bakteriel kulturer er udsat til stuetemperatur.
- Lige før infektionen justere titer til 5 x 107 CFU/mL ved hjælp af pre varmede DMEM/FCS som fortyndingsmiddel.
3. infektion
- Arbejder hurtigt og præcist, tilføje 20 µL (1 x 106 CFU; mangfoldighed af infektion, MOI = 5) af de frisklavede Lm inokulum (trin 2.4 ovenfor) til brønde ved lidt vippe fadet og omhyggeligt placere afpipetteres spidsen i de overliggende medier;
Bemærk: undgå at røre væggene i brønden med pipette spids. - Forsigtigt med pipette overfoeres indholdet af hver brønd at sikre komplet blanding; ikke ryste eller betydeligt vippe pladen som dette vil spredes Lm over væggene i brønden. Returnere celle kultur parabol til 37 °C/5% CO2 inkubator.
- Forberede en 10 µg/mL gentamicin løsning ved hjælp af konditioneret medier fra ikke-inficerede brønde som fortyndingsmiddel.
- På 30 minutter efter infektion (mpi), nøje tilføje 30 µL af gentamicin løsning (slutkoncentration 2,5 µg/mL) og forsigtigt med pipette overfoeres indholdet af samt før og retur celle kultur parabol til 37 °C/5% CO2 inkubator.
- På 60 mpi, høste relevante brønde for enten CFU assay (60 mpi tidspunkt) eller FCM analyse (som beskrevet nedenfor i afsnit 4 og 5, henholdsvis).
- For resterende brønde, på forskellige tidspunkter derefter høste enten celler som før, eller for Lm fremkomsten assay, helt fjerne medier fra godt og erstatte med 150 µL af gentamicin-gratis aircondition medier.
4. prøveudtagning behandling og analyse af intracellulære og Emergent Lm af CFU Assay
- Til høst, lidt tilt skålen og fjern forsigtigt det hele media fra brønden. Tilføje 0,50 mL sterilt vand (dsH2O) til brønden. Efter 30 s, overføre den resulterende vand lysate (100) til en 1,5 mL microcentrifuge rør og vortexes kraftigt i 10 s.
- Forbered 10-1 og 10-2 fortyndinger ved at tilføje enten 4,5 µL eller 50 µL vand lysate til 450 µL af dsH2O og kortvarigt vortex at sikre grundig blanding.
- Spred 50 µL af 100, 10-1 og/eller 10-2 prøver på lysogeny bouillon (LB) agar plader.
- Assay for emergent Lm (trin 3.6 ovenfor), fjerne 10 µL af de overliggende medier og opdele den i to 5 µL delprøver: en alikvot tilføje 5 µL af DMEM/FCS og til den anden alikvot tilsæt 5 µL af DMEM/FCS indeholdende 5 µg/mL gentamicin. Den sidstnævnte kontrol skelner mellem ekstracellulære Lm (gentamicin følsomme) og intracellulære Lm (gentamicin resistente) i den efterfølgende CFU assay.
- Efter 5 min ved stuetemperatur, tilføje 90 µL af dsH2O, vortex kraftigt i 10 s og spredning 50 µL på LB agar plader.
- Optælle Lm kolonier på LB agar plader efter 2 dages inkubation ved 37 ° C.
5. prøveudtagning behandling og analyse af intracellulære og Emergent Lm ved flowcytometri (FCM)
- Forberede RAW 264.7 celler, som beskrevet i trin 1,1-4. Justere celler til 1 x 106 celler/mL og tilsættes 1 mL (1 x 106 celler) brønde i en 6-godt vævskultur parabol.
- Forberede bakterie inokulum som beskrevet i trin 2.1-2.3 og inficere celler med volumen af inokulum svarende til et MOI 50 (5 x 107 CFU).
- På 1,5 timer efter infektion (hpi), indsamle medier fra første række brønde og sted i en 1,5 mL microcentrifuge tube med 500 µL af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) og sted på is, indtil alle brønde er blevet behandlet.
- For at indsamle intracellulære Lm, der tilsættes 1 mL af dsH2O til brønden og efter 60 s, overføre den resulterende vand lysate til en 1,5 mL microcentrifuge tube med 500 µL af 4% PFA. Vortex kraftigt i 10 s og sted på is indtil alle brønde er blevet behandlet. (Prøve behandling er beskrevet i trin 5.8 nedenfor.)
- For resterende brønde, fjerne medier og erstatte med 1 mL DMEM/FCS med 5 µg/mL gentamicin at dræbe ekstracellulære Lm og straks returnere celler til rugemaskine.
- Efter 30 min (2 hpi) fjerne medier og erstatte med DMEM/FCS uden gentamicin.
- Efter 2 og 4 h (4 og 6 hpi) tager anden og tredje gang point ved at indsamle medier og lysates som trin 5.3 og 5.4.
- Der centrifugeres rør på 10.000 x g for 7 min. Fjern supernatanten uden forstyrrende pellet.
- Suspendere hver pellet i farvning cocktail af 50 µL af 4% PFA og 15 µL af phalloidin. Inkuber rør i mørke ved 4 ° C i 20 min.
- Efter inkubering tilsættes 1 mL FACS buffer til hver tube og pipetteres op og ned at blande.
- Spin rør på 10.000 x g for 7 min. Fjern supernatanten uden forstyrrende pellet.
- Suspendere hver pellet i 400 µL af FACS buffer til øjeblikkelig brug, eller 200 µL af FACS buffer og 200 µL af 4% PFA hvis opbevaring til senere analyse.
- Køre prøver på en flowcytometri og analysere de indsamlede data.
6. prøvetagning behandling og analyse af Lm kolonisering og vært reaktionerne i leveren
- Forberede Lm infektion som beskrevet i trin 2.1-2.3.
- Beregne den nødvendige mængde af subkultur for ønskede titer af 3 x 106 CFU/mL.
- Fortynd mængden af beregnede bakterier med pre varmede Hank Balanced Salt løsning (HBSS) i en endelige mængden af 1 mL lige før infektionen. Dette er de input inokulum, der sprøjtes ind i musen.
- Bruger en 28 G½ 100U insulin sprøjte, trækker 100 µL (3 x 105 CFU) af input inokulum og fjerne enhver synlig luftbobler.
- Placer musen (stamme C57BL/6, mænd mellem 6 og 12 uger gammel) i bedriften tilbageholdenhed og bruge varmt vand (ikke mere end 45 ° C) til at spile hale vene, så injicere det input inokulum ind i venen.
- Plade 10-2 og 10-3 fortyndinger af det input inokulum på LB agar 10bcm plader og inkuberes natten over ved 37 ° C til at bestemme den faktiske input dosering.
- På 18 hpi, humant euthanize mus (CO2 kvælning efterfulgt af cervikal dislokation) og ved hjælp af steril saks skåret åben mus bughinden for at indsamle frontal lap af leveren ved hjælp af særskilte par af saks og pincet til ydersiden og indersiden af musen. Placer leveren i en 6 cm petriskål på is.
- Skær leveren i små tern og læg i et hætteglas med magnetiske rør bar. Der tilsættes 2 mL 2 mg/mL collagenase D rekonstitueres i DMEM uden FCS. Inkuber hætteglas ved 37 ° C på en magnetomrører i 30−45 min. Når vævet er homogeniseret, tilsættes 3 mL DMEM/FCS til at inaktivere collagenase.
- Filtrere cellerne gennem en 70 µm celle si ind i en konisk rør, tilføje mere DMEM/FCS, hvis nødvendigt.
- Der centrifugeres celler på 800 x g pellet ved 4 ° C i 10 min, Fjern supernatanten og suspendere celle pellet i 500 µL af ACK buffer til at lyse røde blodlegemer.
- Inkuber cellerne ved stuetemperatur i 5 min i ACK buffer. Suspendere celler i 1 mL DMEM/FCS.
- Der centrifugeres celler på 800 x g pellet ved 4 ° C i 10 min, Fjern supernatanten og suspendere i 1 mL DMEM/FCS. Derefter tælle de celler ved hjælp af en hemocytometer eller en automatiseret celle counter.
- Overføre 1 x 106 celler til 1,5 mL microcentrifuge tube og spin til pellet. Derefter suspendere i 1 mL dsH2O og vortex til lyse celler. Plade 50 µL på LB plader på ufortyndet og 10-2 fortyndinger og inkuberes ved 37 ° C til at optælle Lm for CFU analyse.
- Overføre 1 x 106 celler til FACS rør til hver vævsprøve ifølge celletal og vask med 1 mL af FACS buffer.
- Der centrifugeres celler på 800 x g pellet ved 4 ° C i 10 min og Fjern supernatanten.
- Forberede et antistof cocktail som indeholder antistoffer af interesse baseret på den anbefalede koncentration for hver antistof og FACS buffer. Se Tabel af materialer for anbefalede beløb anvendes i analysen.
- Suspendere pellet i 100 µL antistof cocktail og inkuberes rør i mørke ved 4 ° C i 30 min.
- Efter inkubering tilsættes 2 mL FACS buffer til hver tube og suspendere celler.
- Der centrifugeres celler på 800 x g pellet ved 4 ° C, og supernatanten. Derefter suspendere pellet i 400 µL af FACS buffer til øjeblikkelig brug, eller 200 µL af FACS buffer og 200 µL af 4% PFA hvis opbevaring til senere.
- Analysere celler ved flowcytometri (Se trin 5.13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vurdering af patogenet og vært-kodet faktorer påvirker cellulære infektion rolle
Bruger infektion betingelserne beskrevet ovenfor, er 0,15% af input vildtype Lm genoprettet efter 1,5 h Co inkubation med kulturperler makrofager (fig. 1A). I den efterfølgende 1,5 h Co inkubation (3 h efter infektion, hpi), der var en 4-fold stigning i nyttiggørelse af levedygtige Lm og fra 3 til 6 hpi var der en yderligere 7.5-fold stigning i nyttiggørelse af levedygtige Lm. Da den celle-vandtætte antibiotika gentamicin føjes til fælles kulturer på 1 hpi at fjerne ekstracellulære Lm, repræsenterer den 30-fold stigning i levedygtige Lm niveauer mellem 1,5 og 6 hpi udelukkende intracellulære spredning.
LM gevinster hurtigt adgang til cytosol efter sin internalisering i eukaryote celler (Se Introduktion). Cytosole Lm associates med aktin polymerisering maskiner med hvilke midler det slynger sig i stand til at trænge ind på plasmamembran. I in vitro-infektion assay beskrevet ovenfor, hvis gentamicin er fjernet fra brønde på 6 hpi, ekstracellulære Lm kan let påvises 1 time senere (7 hpi) i den overliggende medier (figur 1B). Ingen CFUs blev inddrevet fra kontrolhullerne der ikke var seedet med makrofager, men der blev ellers behandlet ens som seedede wells derved viser, at udseendet af ekstracellulære Lm var helt afhængig af tilstedeværelsen af makrofager og ikke et resultat af ufuldstændige antibiotika drab (ikke vist).
Mulighed for Lm at overleve og formere sig intracellulært er i høj grad afhængig af en række gener, hvis udtryk er kontrolleret af transkriptionsfaktor Positive regulerende faktor en (PrfA)1. I første omgang, er der en tilsvarende genopretning af vildtype Lm stamme og en Lm mutant stamme slettes denne faktor (ΔprfA) (fig. 1A). Men der er en efterfølgende reduktion i inddrivelse af ΔprfA stamme efter langvarig Co inkubation, opsving på 6 hpi er 3-fold mindre end opsving på 1,5 hpi. Boligområdet og forventeligt, blev ΔprfA bakterier ikke fundet i den overliggende medier på 7 hpi (figur 1B).
Aktiviteten af PrfA er reguleret på flere niveauer. En række constitutively aktive PrfA varianter, kodet af hyper-virulente prfA * alleler, har været isoleret3. En Lm stamme som besidder en prfA * har en første infektion-profil, der er sammenlignelig med den isogene wild-type belastning på 1,5 og 3 hpi (fig. 1A). Men mellem 3 og 6 hpi, fold-stigning af prfA * stamme væsentligt afveg fra i wild-type stamme. Igen, boligområdet og forventeligt, blev prfA * stamme let fundet i de overliggende medier på 7 hpi på niveauer, der væsentligt oversteg der er konstateret for vildtype Lm stamme (figur 1B).
Efter sin løsladelse i cytosol, Lm associates med cellulære actin polymerisering maskiner, der resulterer i bakterien er kappebærende af polymeriseret aktin. For at bekræfte, at ekstracellulære Lm er afledt af actin-rige cytosol af cellen inficerede vært, blev makrofager enten venstre ikke-inficerede eller inficeret med en normal god landbrugspraksis-udtrykker prfA * stamme og den overliggende medier blev indsamlet på 1,5, 4 og 6 hpi, farves med phalloidin, der binder polymeriseret actin, og analyseret ved flowcytometri. Media overliggende både ikke-inficerede og inficerede makrofager indeholdt lys-spredning bakterie mellemstore partikler (fig. 2A), dog kun medier fra inficerede makrofager besad normal god landbrugspraksis-positive signaler inden for denne størrelse gating (Figur 2B, venstre panel). Der var en tidsafhængig stigning i forekomsten af phalloidin-positive Lm i medierne overliggende inficerede makrofager (figur 2B; lige tre paneler). Phalloidin-positive udtryk for normal god landbrugspraksis Lm blev også fundet i lysates forberedt fra inficerede makrofager (figur 2C; venstre panel). Dog blev ingen phalloidin-positive Lm opdaget i lysates fremstillet af makrofager inficeret med en normal god landbrugspraksis-udtrykker Lm mutant stamme, der manglede virulens faktor ActA, der er nødvendige for at rekruttere actin-polymerisering maskiner til den ydre overflade af Lm efter dens udgivelse i cytosol (figur 2C; højre panel). Disse data støtte et scenario, der i en in vitro-infektion model 'emergent' ekstracellulære Lm er afledt fra den inficerede celle cytosol.
Ud over Lm-kodning faktorer, identificeret en række vært faktorer har været at indvirkning Lm cellulære infektion (Se diskussion). For nylig, vært faktoren Perforin-2 (P2) har vist sig at være et afgørende element i celle-niveau forsvar mod en række af bakterielle patogener. Peritoneal ekssudat makrofager (PEMs) isoleret fra wild-type (P2+/ +) og P2- / - mus er i første omgang sammenligneligt smittet af Lm som målt ved CFU assay på 1 hpi (fig. 3A). I P2+/ + PEMs antallet af CFUs inddrives ved 6 hpi er 10-fold øget i forhold til de niveauer, der er inddrevet på 1 hpi. Svarende til tidligere offentliggjorte resultater i P2- / - PEMs antallet af CFUs inddrives ved 6 hpi er 80-fold større i forhold til de niveauer, der er inddrevet på 1 hpi4. Forbedret Lm intracellulære spredning i P2- / - PEMs var ledsaget med større niveauer af levedygtige Lm opdaget i overliggende medierne i forhold til niveauet fundet i P2+/ + PEMs ( Figur 3B). Disse data viser, at i en in vitro assay, udseendet af emergent ekstracellulære Lm kan også rapportere på vært faktorer at indvirkning infektion.
In vivo infektion og analyse af leveren
Ud over de in vitro-infektion assays beskrevet ovenfor, kan den relative infektivitet af vildtype, svækket og hyper-virulente Lm stammer også vurderes ved in vivo infektion assays. Mus var intravenøst Co inficeret med en lige blanding af wild-type og ΔprfALm stammer og 18 h senere var humant aflives, lever skåret, og enkelt celle præparater blev foretaget. Isolerede leverceller var mængden og den resulterende lysates underkastes en CFU analyse, at kunne skelne mellem wild-type og ΔprfALm stammer. I forhold til 1:1 forholdet mellem disse to stammer i den oprindelige inokulum ('input'), ΔprfA/wild type ratio på 18 hpi ('output') var betydeligt mindre end enhed (for 6 mus område var 0,001 til 0.330; betyde 0,100) (figur 4). Derimod mus co-inficerede med en lige blanding af wild-type og prfA * Lm stammer /wild type nøgletal prfA *varierede fra 2,4 til 10.2 (mener 7.1). Dette eksperiment viser, at den relative infektivitet af disse tre Lm stammer (vildtype, ΔprfAog prfA *) i en intakt organisme ligner der observeret i in vitro-infektion assays.
Værten kan også overvåges for at afgøre, om det varierende niveau af smitteevne af vildtype, ΔprfAog prfA * stammer er forbundet med en tilsvarende graduering af det medfødte immunforsvar. Tidligere har har det vist at bosiddende makrofager (Küpffer celler) og infiltrerer inflammatoriske monocytter og neutrofile spille vigtige og indbyrdes forbundne roller i at beskytte leveren under Lm infektion5,6, 7,8. Celler fremstillet af ikke-inficerede mus og mus inficeret med normal god landbrugspraksis-udtrykker vildtype Lm stamme til 18 h var plettet med celle type-specifikke markører og analyseret ved flowcytometri. Med hensyn til ikke-immune celler i leveren (fx hepatocytter og endotelceller) var der ingen påviselige forskelle mellem ikke-inficerede og inficerede mus. Derimod var der markante infektion-relaterede ændringer i leveren med hensyn til andelen af immunceller, der positivt farvet for leukocyt fælles antigen CD45 (figur 5A). Specifikt, mus inficeret med wild-type og prfA*Lm stammer havde signifikant højere niveauer af CD45+ celler i leveren i forhold til ikke-inficerede mus, mens niveauerne af CD45+ leverceller i mus inficeret med svækket ΔprfALm stamme var ikke specielt anderledes end niveauer observeret i ikke-inficerede mus. Yderligere kendetegner både hjemmehørende og infiltrerer immun cellepopulationer, CD45+ celler kan fremmes subtyped. Som bemærket af andre9, et bemærkelsesværdigt Skift med infektion er den næsten fuldstændige forsvinden af hjemmehørende Küpffer celler (CD11bmidten af F4/80+i leveren) og den samtidige optræden af en særskilt population af CD11bHej celler der repræsenterer infiltrerer neutrofile (figur 5B; nederste midterste panel). Også optræder i leveren på 18 hpi, er CD11bmidten af F4/80- celler vises der, da de også er Ly6CHej, repræsenterer infiltrerer inflammatoriske monocytter (figur 5B, lavere midterste og højre paneler). I inficerede mus er disse sidstnævnte celler de kun celler, hvor mærkbare normal god landbrugspraksis signal blev opdaget efter 18 hs af infektion (figur 5C). Denne sidstnævnte konstatering er lig den, for nylig rapporteret af Jones og D'Orazio, der viste, at i mus, Lm primært er forbundet med Ly6CHej monocytter at infiltrere tarmen efter fødevarebåren infektion10. Profil af CD45Hej leverceller af mus inficeret med Lm ΔprfA stamme lignede af ikke-inficerede mus boer mus inficeret med hyper-virulente LmprfA * stammen havde beskedent øget niveauer af infiltrerer neutrofile og inflammatoriske monocytter i forhold til mus inficeret med vildtype Lm stamme (data ikke vist).
Figur 1 : Infektion af kulturperler makrofager af Listeria monocytogenes (Lm). Musen makrofager cellelinie RAW 264.7 var inficeret in vitro med enten vildtype Lm (wt, udfyldte cirkler), svækket Lm (ΔprfA; åben cirkler) eller hyper-virulente (prfA *; åbne pladser) Lm stammer (Se tekst for detaljer). (A) på 1,5, 3 og 6 timer efter infektion (hpi), makrofager blev mængden og cellulære indholdet blev analyseret af kolonidannende enhed (CFU) assay. (B) inficerede makrofager blev kort behandlet med antibiotika gentamicin at fjerne ikke-internaliseret Lm og på 6 hpi overliggende medierne blev indsamlet og analyseret af CFU assay. Prikkede linje repræsenterer detektionsgraensen for analysen. Hvert datapunkt repræsenterer en uafhængig godt/infektion og P-værdier blev bestemt af Student's t-test. Vist er resultatet af en enkelt repræsentant eksperiment udført tre gange med lignende resultater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Actin-bundet Lm analyseret ved flowcytometri. Musen makrofager cellelinie RAW 264.7 blev enten efterladt inficerede eller inficeret in vitro-med normal god landbrugspraksis-udtrykker Lm. Overliggende medierne blev fjernet, centrifugeres, og det indsamlede materiale farves med actin-bindende phalloidin. Det farvede materiale blev analyseret ved flowcytometri og vist er lys-spredning parceller (A) angiver den gating bruges til normal god landbrugspraksis - og phalloidin-associerede niveauer af ekstracellulære (dvs. media-afledt) Lm vist i (B). (B) det angivne område repræsenterer normal god landbrugspraksis/actin dobbelt positive Lm og deres overflod som en procentdel af de samlede begivenheder inden for lys-spredning gates. (C) musen makrofager blev smittet med enten udtryk for normal god landbrugspraksis Lm eller et udtryk for normal god landbrugspraksis Lm stamme mangler det gen, der koder ActA (ΔactA) der rekrutter actin-polymerisering maskineri af cellen vært til den LM cellens overflade. På 6 hpi, inficerede celler blev mængden og frigivne cellulære indholdet, herunder den intracellulære Lmvar farvet for actin og analyseret ved flowcytometri. Vist er resultatet af en enkelt repræsentant eksperiment udført tre gange med lignende resultater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Infektion i wild-type og Perforin-2 knockout makrofager ved Lm. Peritoneal makrofager isoleret fra enten en wild-type (P2+/ +; fyldt cirkler) eller knockout (P2- /-, stiplede kredse) blev inficeret in vitro-med Lm. (A) på 1 og 6 hpi, makrofager blev mængden og cellulære indholdet analyseret af CFU assay. (B) inficerede peritoneal makrofager blev kort behandlet med antibiotika gentamicin og på 2,5 og 6 hpi overliggende medierne blev indsamlet og analyseret af CFU assay. Hvert datapunkt repræsenterer en uafhængig godt/infektion og P-værdier blev bestemt af Student's t-test. Vist er resultatet af en enkelt repræsentant eksperiment udført tre gange med lignende resultater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Lm infektion i musen. Grupper af 6 mus var smittet med en lige blanding af enten de vilde-type Lm (wt) og svækket Lm (ΔprfA) stammer eller en lige blanding af vildtype Lm og hyper-virulente (prfA *) stammer. På 18 hpi mus Lm var byrde i leveren bestemt af CFU assay. I dette eksperiment besidder vildtype Lm stamme en antibiotika-resistens gen, der gør det muligt at skelne mellem mutantstammen antibiotikum-følsomme Lm . Leveren homogeniseret var belagt på begge antibiotikum-holdige og antibiotika-frie medier og forholdet mellem mutant og vildtype Lm var afbildet. Den prikkede linje repræsenterer mutant-vildtype forholdet mellem den inficerer dosis. De absolutte niveauer af vildtype Lm i de to kohorter af mus blev 12 og 15 CFU/106 leveren celler, henholdsvis. Vist er resultatet af en enkelt repræsentant eksperiment udføres to gange med lignende resultater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Immunologisk reaktion på Lm infektion i mus leveren. Mus var enten ikke-inficerede eller systemisk inficerede med 2 x 105 CFU af normal god landbrugspraksis-udtrykker Lm stammer til 18 h. encellede tilberedninger af lever blev analyseret ved flowcytometri for udtryk af immun - og myeloid-specifikke markører. (A) procentdelen af celler farvning positive for immun-specifikke celle overflade markør CD45+ pr. 106 isoleret samlede levende leveren celler vist for ikke-inficerede mus og mus inficeret med enten de vilde-type (wt Lm), svækket (ΔprfA), eller hyper-virulente (prfA *) Lm stammer. Plottet er gennemsnittet af tre mus pr. gruppe og P-værdier blev bestemt af Student's t-test. (B) vises i de venstre paneler er profilen farvning af CD45-farvning leveren celler fra en enkelte ikke-inficerede mus (øverst) og en individuel wt Lm- inficeret (nederst); i de midterste paneler er vist udtryk niveauer af myeloide-specifikke markører CD11b og F4/80 af CD45+ celler; og på de rigtige paneler er vist Ly6C udtryk niveauer af de angivne gated celler. I langt højre panel vises en overlejring af Ly6C+ celler fra ikke-inficerede og inficerede mus herunder procentdel og gennemsnitlige fluorescens intensiteter (MFI) af CD11b+ F4/80- celler positive for den angivne Ly6C gate. Vist er en repræsentativ mus fra 3 mus pr. gruppe. (C) Ly6C+ celler stammer fra lever af ikke-inficerede og inficerede mus (beskrevet (B), midterste og højre paneler) blev analyseret for normal god landbrugspraksis udtryk ved flowcytometri. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af sin hurtige og processive cellulær infektion program er Lm en ideel patogen at sonde cellulære aktiviteter, der påvirker infektion. En række vært faktorer er blevet identificeret, enten positivt eller negativt påvirker Lm cellulære infektion11,12,13,14. To sådanne vært faktorer karakteriseret i vores laboratorium, Perforin-2 og hæm reguleret Inhibitor (P2 og Hej), regulere forskellige funktioner af Lm infektion proces. Som vist i figur 3, P2 mangelfuld celler er stærkt modtagelige for Lm og denne forøget modtagelighed også gælder på P2 knockout mus4. Detaljeret sammenlignende undersøgelser af P2-udtrykker og P2-mangelfulde makrofager viste, at de sidstnævnte celler dannet meget syrnet Lm-der indeholder phagosomes, der resulterede i forøget virulence genekspression. Den hypotese, at differentieret virulens genekspression bidrager til øget modtagelighed af P2-mangelfulde makrofager blev støttet af den konstatering, at den hyper-virulente prfA * stamme, at, som nævnt tidligere, udtrykker virulens gener på et constitutively højt niveau, inficeret P2-udtrykker og P2-mangelfulde makrofager lige godt4. Således, tilgængeligheden af en hyper-virulente Lm stamme gjort det muligt at teste hypotesen at P2 vært faktor negativt regulerer patogen virulens faktor installation. For Hej, vi viste at denne vært faktor regulerer den intracellulære handel med Lm således, at dens fremkomst fra den inficerede celle er begrænset; denne cellulære aktivitet er sandsynligvis grundlaget for øget modtagelighed af hI-mangelfuld mus for Lm infektion15,16.
I undersøgelser, der dokumenteret cellulære aktiviteter, der forekommer inden for minutter efter infektion, er det afgørende, at før deres Co inkubation, at både bakterier og værtsceller ikke er alt for udsat for svingende temperaturer eller andre miljømæssige tilstande, der kan aktivere stress reaktioner, der ville overlappe (og forvirre) infektion-induceret aktiviteter. For de undersøgelser, der er beskrevet ovenfor, omfatter dette sådanne tilsyneladende enkle punkter som minimere håndtering tidspunktet for Lm lige før indlede infektion. For eksempel, hvis en bakteriekultur er fjernet fra en rystende 37 ° C inkubator og lov til at sidde på en bænk top, vil forskydninger i både temperatur og ilt tilgængelighed (blandt andet) aktivere tilpasninger, der kan påvirke den indledende fase af den efterfølgende interaktion med vært-cellen. Tilsvarende er værtsceller også følsomme over for temperatur og medier forskydninger, der kan påvirke initiale infektion svar. Men i praksis er det umuligt at helt eliminere alle udsving i bakteriel og vært celle dyrkning betingelser, ved at reducere dem så meget som muligt og etablere en standard driftsplan, variation mellem eksperimenter vil blive minimeret.
En yderligere variabel, der efter vores mening, hvis betydning er også underappreciated, er, at brugen af antibiotika i celle kultur infektion modeller. Gentamicin er ofte antibiotika valg, fordi det er relativt uigennemtrængelige for den eukaryote plasmamembran. I både ældre og nuværende litteratur, det er generelt bruges på 50 µg/mL til at dræbe ekstracellulære (dvs. ikke-internaliseret) bakterier. For nylig har det direkte påvist, når de findes på 25 µg/mL, der er tilstrækkelig informationsformidling gentamicin på tværs af de eukaryote membran til at dræbe intracellulære Lm17. Vores erfaring, dette niveau af gentamicin dræber Lm straks ved kontakt, mens meget lavere niveauer i 2-5 µg/mL vifte kill > 99,9% Lm i mindre end 5 min4. Lawrenz og kolleger har vist, at de udbredte gentamicin koncentrationer af 25 – 50 µg/mL er også tilstrækkeligt til at dræbe intracellulære Yersinia pestis18. Interessant, viste denne gruppe også betydelige forskelle mellem celle typer i form af gentamicin permeabilization fremhæver de optimale betingelser bør fastlægges for hver patogen-vært celle parring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS - Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28 G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
References
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
- Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
- Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
- Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
- Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
- Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
- Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
- Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
- Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
- Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
- Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
- Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
- Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
- Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
- VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).
