Summary
Vi beskriver både in vitro- och in vivo infektion analyser som kan användas för att analysera verksamheten i värd-encoding faktorer.
Abstract
Det finns en mängd strategier bakteriella patogener anställa att överleva och föröka sig en gång i eukaryota cellen. De så kallade 'cytosoliska' patogenerna (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisoch Rickettsia spp.) få tillgång till den infekterade cellen cytosolen av fysiskt och enzymatiskt förnedrande primära vacuolar membranet. En gång i cytosolen, dessa patogener föröka såväl som generera tillräckliga mekaniska krafter att penetrera plasmamembranet av värdcellen för att infektera nya celler. Här visar vi hur denna terminal steg av cellulära infektion cykeln av L. monocytogenes (Lm) kan kvantifieras genom både kolonibildande enhet analyser och flödescytometri och ge exempel på hur både patogen - och host-kodad faktorer påverkar detta processen. Vi visar också en nära korrespondens av Lm infektion dynamiken i odlade celler infekterade in vitro- och de av nedsatt celler från möss infekterade Invivo. Dessa funktionsbaserade testmetoder är relativt enkel och kan lätt skalas upp för discovery-baserade hög genomströmning skärmar för modulatorer av eukaryota cellens funktion.
Introduction
Infektion-baserade experimentella modeller är till sin natur utmanande på grund av deras beroende av start staten villkoren för värd och patogen, olika patogen infektion strategier och svårigheten att tillskriva patogen - och host-driven processer baserat på resultat. Bakterien Listeria monocytogenes (Lm) har blivit en idealisk patogen sond värd försvar Svaren på grund av dess genetiska och mikrobiologiska tractability, snabb och processive cellulära infektion strategin och den relativt klara förhållandet mellan dess cell - och organismnivå-nivå infektion fenotyper. Cellulära infektionen av Lm fortskrider genom fyra distinkta faser1: (i) cellulär invasion som avslutas med Lm inneslutas inom en vakuol; (ii) Lm-regisserad upplösningen av vakuol membranet och utsättning av Lm i cytosolen; (iii) intracytosolic replikering. och (iv) fysiska genomträngningen av plasmamembranet som resulterar i antingen infektionen av direkt angränsande celler (t.ex. i en epitelial ark) eller i ensliga celler, utsättning av Lm i den extracellulära miljön. Var och en av dessa faser främjas av specifika Lm-kodade faktorer (benämnd 'virulensfaktorer') som, när bort, orsaka infektion defekter i både cellulära och djur modeller. Allmän infektion strategin har utvecklats självständigt av ett antal så kallade 'cytosoliska' patogener2.
Kolonibildande enhet (CFU) analyser används allmänt att utvärdera både in vitro-(dvs. cellulära) såväl som i vivo (dvs organismnivå) infektion resultat. Förutom deras hög känslighet, särskilt för Invivo infektioner, föreskriva CFU analyser en otvetydig avläsning patogen invasionen och intracellulär överlevnad/spridning. CFU analyser har använts i stor utsträckning att analysera både Lm och mottagande cell bestämningsfaktorer som påverkar infektion. Så informativ som dessa tidigare studier har varit att analysera cellulära invasionen och intracytosolic replikering, CFU analyser har inte, till bäst av vår kunskap, använts för att spåra den fjärde fasen av Lm infektionsprocessen: cellulär fly. Här beskriver vi relativt enkelt hur cellulära utrymningsvägar (hädanefter benämnd 'uppkomst') kan övervakas av CFU assay (liksom av flödescytometri) och Visa exempel på hur både patogen - och host-kodad faktorer reglera denna fas av Lm infektion cykel. Analysen av den terminala fasen av cellulära Lm infektion cykeln kan göra det möjligt att identifiera ytterligare patogen och värd cell infektion-specifika faktorer och aktiviteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Möss behandlades humant i enlighet med alla lämpliga regeringens riktlinjer för vård och använda av försöksdjur av National Institutes of Health och deras användning var godkänd för hela studien av University of Miami institutionella djur vård och användning kommittén (protokoll 16-053).
1. förbereda celler för infektion
- Propagera mus makrofag-liknande cellinje RAW 264,7 i DMEM vävnadsodling media kompletteras med 10% fetalt kalvserum (hädanefter benämnd DMEM/FCS) använder en 125 mL-kolv och en vävnadskultur inkubator underhålls på 37 °C/5% CO2.
- Dagen innan infektionen, använda en cell-skrapa att ta bort celler från expansion kolven och samla i en 15 mL skruvlock koniska rör. Centrifugera celler vid 800 x g i 10 min, Dekantera supernatanten och centrifugerade cell i 1 mL DMEM/FCS (utan antibiotika) och bestämma titern med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cell räknare.
-
Justera titer till 2 x 106 celler/mL och tillsätt 0.10 mL (2 x 105 celler) till brunnar i en 48-väl vävnadsodling maträtt. Se till att cellsuspensionen täcker hela ytan av brunnen.
- Platta celler i ytterligare brunnar för en senare källa av konditionerat media. Också placera 0.10 mL DMEM/FCS i tre ytterligare borrningar att fungera som en 'ingen cell control'.
- Inkubera över natten i en vävnadskultur inkubator på 37 °C/5% CO2. Nästa dag, ta inte ur inkubatorn tills det bakterien inokulatet är beredda och redo att använda.
2. förbereda Listeria monocytogenes (Lm) för infektion
- Inokulera 2 mL av hjärnan-hjärta infusion (BHI) med en enda koloni från en färsk strimmiga agarplatta (< 2 dagar) LM och inkubera över natten vid 37 ° C med skakningar vid 130 varv/min.
- Nästa dag, tillsätt 0.10 mL övernattning kultur till 2 mL före värmde BHI och fortsätta inkubation vid 37 ° C under skakning tills den optiska densiteten (OD600) är mellan 0,4 och 0,6.
- Fastställa ungefärlig bakteriell titer empiriskt härledda omvandling formulan. I vårt labb en exponentiellt växande Lm kultur i BHI är cirka 1,3 x 109 kolonibildande enheter (CFU) /OD600. Minimera mängden tid bakteriekulturer utsätts för rumstemperatur.
- Strax före infektion justera titern till 5 x 107 CFU/mL använda pre värmde DMEM/FCS som spädningsvätska.
3. infektion
- Arbeta snabbt och exakt, tillsätt 20 µL (1 x 106 CFU; multiplicity av infektion, MOI = 5) av den nylagade Lm inokulatet (steg 2.4 ovan) till brunnar genom något luta skålen och noggrant placera Pipettera spetsen i överliggande media;
Obs: Undvik att vidröra väggarna i brunnen med Pipettera spetsen. - Försiktigt Pipettera innehållet i varje brunn för att säkerställa komplett blandning; inte skaka eller avsevärt luta plattan eftersom detta kommer att sprida Lm över väggarna i brunnen. Returnera cell kultur maträtt till 37 °C/5% CO2 inkubator.
- Bered en 10 µg/mL gentamicin med luftkonditionerade medier från oinfekterade brunnar som spädningsvätska.
- 30 minuter efter infektion (mpi), tillsätt försiktigt 30 µL gentamicin lösning (slutlig koncentration 2,5 µg/mL) och försiktigt Pipettera innehållet i den liksom före och återvändande cell kultur maträtt till 37 °C/5% CO2 inkubator.
- På 60 mpi, skörda lämpliga brunnar för antingen CFU assay (60 mpi tidpunkt) eller FCM analys (som beskrivs nedan i avsnitten 4 och 5, respektive).
- För resterande brunnar, vid olika tillfällen därefter antingen skörda celler som innan eller för Lm uppkomsten analysen, helt ta bort medier från brunnen och ersätta med 150 µL gentamicin-fria luftkonditionerade medier.
4. provtagning bearbetning och analys av intracellulära och framväxande Lm av CFU Assay
- Att skörda, luta lätt skålen och ta försiktigt bort hela media från brunnen. Lägg till 0,50 mL destillerat sterilt vatten (dsH2O) till brunnen. Efter 30 s, överföra det resulterande vattnet lysate (100) i en 1,5 mL mikrocentrifug rör och vortex kraftigt i 10 s.
- Förbereda 10-1 och 10-2 utspädningar genom att lägga till antingen 4,5 µL eller 50 µL lysate till 450 µL av dsH2O vattnet och kort vortex att säkerställa omsorgsfull blandning.
- Sprida 50 µL 100, 10-1 och/eller 10-2 prover på lysogeny buljong (LB) agarplattor.
- Assay för framväxande Lm (steg 3.6 ovan), ta bort 10 µL överdra media och dela den i två 5 µL portioner: till en alikvot Tillsätt 5 µL av DMEM/FCS och den andra alikvoten Tillsätt 5 µL DMEM/FCS innehållande 5 µg/mL gentamicin. Den sistnämnda kontrollen skiljer mellan extracellulära Lm (gentamicin känsliga) och intracellulära Lm (gentamicin resistent) i den efterföljande CFU assay.
- Efter 5 min i rumstemperatur, lägga till 90 µL dsH2O, vortex kraftigt i 10 s, och spridning 50 µL på LB agarplattor.
- Räkna upp Lm kolonier på LB agarplattor efter 2 dagars inkubation vid 37 ° C.
5. provtagning bearbetning och analys av intracellulära och framväxande Lm av flödescytometri (FCM)
- Förbereda RAW 264,7 celler som beskrivs i steg 1,1-4. Justera celler till 1 x 106 celler/mL och tillsätt 1 mL (1 x 106 celler) till brunnar i en 6-väl vävnadsodling maträtt.
- Förbereda bakterien inokulum som beskrivs i steg 2.1-2.3 och infektera celler med volym av inokulatet motsvarar en MOI 50 (5 x 107 CFU).
- På 1,5 timmar post infektion (hpi), samla media från första uppsättningen av brunnar och placera i en 1,5 mL mikrocentrifug rör med 500 µL 4% paraformaldehyd (PFA) och plats på is tills alla brunnar har bearbetats.
- Samla in intracellulära Lm, tillsätt 1 mL dsH2O till brunnen och efter 60 s, överföra lysate resulterande vattnet till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör med 500 µL av 4% PFA. Vortex kraftigt i 10 s och plats på is tills alla brunnar har bearbetats. (Provet behandling beskrivs i steg 5,8 nedan.)
- För resterande brunnar, ta bort media och ersätta med 1 mL DMEM/FCS med 5 µg/mL gentamicin att döda extracellulära Lm och omedelbart återvända celler till inkubatorn.
- Efter 30 min (2 hpi) ta bort media och ersätta med DMEM/FCS utan gentamicin.
- Efter 2 och 4 h (4 och 6 hpi) ta andra och tredje gången poäng genom att samla media och lysates som steg 5.3 och 5.4.
- Centrifugera rören vid 10 000 x g för 7 min. ta bort supernatanten utan att störa pelleten.
- Upphäva varje pellet i färgning cocktail av 50 µL av 4% PFA och 15 µL av phalloidin. Inkubera rören i mörker vid 4 ° C i 20 min.
- Tillsätt 1 mL FACS buffert i varje rör och pipett upp och ner för att blanda efter inkubation.
- Snurra rören vid 10 000 x g för 7 min. ta bort supernatanten utan att störa pelleten.
- Upphäva varje pellet i 400 µL av FACS buffert för omedelbar användning, eller 200 µL FACS buffert och 200 µL 4% PFA om lagra för senare analys.
- Köra prover på en flödescytometri och analysera insamlade data.
6. provtagning bearbetning och analys av Lm Colonization och värd svaren i levern
- Förbereda Lm för infektion som beskrivs i steg 2.1-2.3.
- Beräkna den nödvändiga mängden subkultur för önskad titer för 3 x 106 CFU/mL.
- Strax före infektion späd mängden beräknade bakterier med pre värmde Hank's Balanced Salt lösning (HBSS) i en slutlig volym av 1 mL. Detta är de ingående inokulum som injiceras i musen.
- Rita 100 µL (3 x 105 CFU) av ingående inokulatet med en 28 G½ 100U insulinspruta och avlägsna eventuella synliga luftbubblor.
- Placera musen (stam C57BL/6; män mellan 6 och 12 veckor gamla) i fasthållningsanordningen för innehav och Använd varmt vatten (inte mer än 45 ° C) för att vidga svans venen och injicera det ingående inokulatet i venen.
- Platta 10-2 och 10-3 utspädningar av de ingående inokulatet på LB agar 10bcm plattor och inkubera över natten vid 37 ° C att fastställa faktiska ingående doseringen.
- På 18 hpi, humant sätt avliva musen (CO2 kvävning följt av cervikal Dislokation) och med steril sax klippa öppna mus bukhinnan att samla in frontal LOB i levern med separata par pincett och sax för utsidan och insidan av musen. Lägg levern i en 6 cm petriskål på is.
- Skär levern i små tärningar och lägges i en injektionsflaska av glas med magnetiska rör bar. Tillsätt 2 mL av 2 mg/mL kollagenas D beredas i DMEM utan FCS. Inkubera injektionsflaskor vid 37 ° C på en magnetomrörare för 30−45 min. När vävnaden är homogeniserad, tillsätt 3 mL DMEM/FCS att inaktivera kollagenas.
- Filtrera cellerna genom en sil med 70 µm i cellen i ett koniskt rör, lägga till fler DMEM/FCS vid behov.
- Centrifugera celler vid 800 x g pellets vid 4 ° C i 10 min, ta bort supernatanten och avbryta cellpelleten i 500 µL buffert för ACK att lysera röda blodkroppar.
- Inkubera cellerna i rumstemperatur i 5 min i ACK buffert. Avbryta celler i 1 mL av DMEM/FCS.
- Centrifugera celler vid 800 x g pellets vid 4 ° C i 10 min, ta bort supernatanten och avbryta i 1 mL av DMEM/FCS. Sedan räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cell räknare.
- Överföra 1 x 106 celler i 1,5 mL mikrocentrifug rör och snurra till pellet. Så stänga i 1 mL dsH2O och vortex att lysera celler. Plåt 50 µL på LB pläterar på outspädd och 10-2 utspädningar och inkubera vid 37 ° C att räkna upp Lm för CFU analys.
- Överföra 1 x 106 celler in FACS rören för varje vävnadsprov enligt blodkroppar och tvätta med 1 mL FACS buffert.
- Centrifugera celler vid 800 x g pellets vid 4 ° C i 10 min och ta bort supernatanten.
- Förbereda en antikropp cocktail som innehåller antikropparna i ränta baserat på den rekommendera koncentrationen för varje antikropp och FACS buffert. Se Tabell för material för rekommenderade mängder används i analysen.
- Suspendera pelleten i 100 µL av antikroppar cocktail och inkubera rören i mörker vid 4 ° C i 30 min.
- Efter inkubation, tillsätt 2 mL av FACS buffert till varje rör och avbryta celler.
- Centrifugera celler vid 800 x g pellets vid 4 ° C och kasta bort supernatanten. Sedan centrifugerade i 400 µL av FACS buffert för omedelbar användning, eller 200 µL FACS buffert och 200 µL 4% PFA om lagra för senare.
- Analysera celler genom flödescytometri (se steg 5.13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bedömningen av patogen och värd-kodade faktorer som påverkar cellulära infektion roll
0,15% av ingående vildtyp Lm använder infektion förhållandena som beskrivs ovan, och återvinns efter 1,5 h samtidig inkubering med odlade makrofager (figur 1A). I den efterföljande 1,5 h samtidig inkubering (3 h post infektion, hpi), fanns en 4-faldig ökning av återvinning av livskraftiga Lm och från 3 till 6 hpi fanns det ytterligare en 7.5-fold ökning i återhämtningen av livskraftiga Lm. Eftersom den cell-impermeable antibiotika gentamicin läggs till samtidig kulturer på 1 hpi att eliminera extracellulära Lm, representerar den 30-fold ökningen livskraftig Lm nivåer mellan 1,5 och 6 hpi uteslutande intracellulära spridning.
LM får snabbt tillgång till cytosolen efter dess internalisering inom eukaryota celler (se Inledning). Cytosoliska Lm associates med aktin polymerisation maskiner av vilket innebär det framdriver sig kan penetrerande plasmamembranet. I in vitro-infektion-analysen ovan, om gentamicin tas bort från brunnarna på 6 hpi, extracellulär Lm kan lätt upptäckas 1 h senare (7 hpi) i överliggande media (figur 1B). Ingen CFUs har återkrävts från kontrollbrunnar som inte var seedad med makrofager men som var annars behandlas identiskt som seedade brunnar visar därmed att uppkomsten av extracellulära Lm var helt beroende av förekomsten av makrofager och inte ett resultat av ofullständig antibiotika dödande (visas inte).
Förmågan att Lm att överleva och föröka sig intracellulärt är till stor del beroende av en uppsättning gener vars uttryck är kontrolleras av Transkriptionfaktorn positiv reglerande faktor en (PrfA)1. Inledningsvis finns det en jämförbar återhämtning av vildtyp Lm stam och en Lm mutant stam bort för denna faktor (ΔprfA) (figur 1A). Det finns dock en efterföljande minskning av återvinning av ΔprfA stammen efter långvarig samtidig inkubering sådan att återhämtningen på 6 hpi är 3 gånger mindre än återvinning på 1,5 hpi. Relatedly och expectedly, upptäcktes ΔprfA bakterier inte i överliggande media på 7 hpi (figur 1B).
Aktiviteten av PrfA regleras på flera olika nivåer. Ett antal konstitutivt aktiv PrfA varianter, kodas av hyper-virulent prfA * alleler, har varit isolerade3. En Lm stam som har en prfA * har en initial infektion-profil som är jämförbar med syngena vildtyp påfrestningen på 1,5 och 3 hpi (figur 1A). Dock mellan 3 och 6 hpi, vik-ökningen av stammen prfA * avsevärt skilde sig från som vildtyp stam. Igen, relatedly och expectedly, upptäcktes lätt stammen prfA * i överliggande media på 7 hpi på nivåer som överträffade som observerats för vildtyp Lm stammen (figur 1B).
Efter dess release i cytosolen associates Lm med cellulära aktin polymerisation maskiner som resulterar i bakterien att vara omsluten av polymeriserat aktin. För att bekräfta att extracellulära Lm härleds från aktin-rika cytosolen infekterade värdcellens, var makrofager antingen vänster oinfekterade eller infekterade med en GFP-uttryckande prfA * stam och överliggande media samlades på 1,5, 4 och 6 hpi, fläckade phalloidin som binder polymeriserat aktin, och analyseras med flödescytometri. Media som överliggande både oinfekterade och infekterade makrofager innehöll ljus-spridning bakterien-storlek partiklar (figur 2A), dock bara media från infekterade makrofagerna besatt GFP-positiva signaler inom denna storlek gating (Figur 2B, vänstra panelen). Det var en tidsberoende ökning i utseendet på phalloidin-positiv Lm i media överliggande infekterade makrofager (figur 2B; höger tre paneler). Phalloidin-positiv GFP-uttryckande Lm upptäcktes också i lysates beredd från infekterade makrofagerna (figur 2C; vänstra panelen). Dock upptäcktes ingen phalloidin-positiv Lm i lysates beredd från makrofager infekterade med en GFP-uttryckande Lm mutant stam som saknade virulens faktor ActA som krävs för att rekrytera aktin-polymerisation maskiner till den yttre ytan av Lm efter dess release i cytosolen (figur 2C; högra panelen). Dessa data support ett scenario som i en in vitro-infektion modell 'emergent' extracellulära Lm härleds från den infekterade cellen cytosolen.
Utöver Lm-kodning faktorer, ett antal värd faktorer har identifierats som påverkar Lm cellulära infektion (se diskussion). Nyligen, den värd faktorn Perforin-2 (P2) har visat sig vara en kritisk komponent i cell-nivå försvar mot ett antal bakteriella patogener. Peritoneal exsudat makrofager (PEMs) isolerade från vildtyp (P2+/ +) och P2- / - möss är initialt comparably infekterade av Lm mätt som CFU assay på 1 hpi (figur 3A). I P2+/ + PEMs antalet CFUs återvinns på 6 hpi är 10 gånger högre jämfört med nivåerna återvinns på 1 hpi. Liknar tidigare publicerade fynden, i P2- / - PEMs antalet CFUs återvinns på 6 hpi är 80-fold större jämfört med nivåerna återvinns på 1 hpi4. Förbättrad Lm intracellulära spridning i P2- / - PEMs åtföljdes med högre nivåer av livskraftiga Lm upptäckts i överliggande media jämfört med nivåerna som upptäckts i P2+/ + PEMs ( Figur 3B). Dessa uppgifter visar att i ett in vitro-test att utseendet på framväxande extracellulära Lm kan också rapportera på värd faktorer att inverkan infektion.
In vivo infektion och analys av levern
Förutom de in vitro-infektion-analyser som beskrivs ovan, kan relativa smittsamheten av vildtyp, försvagat och hyper-virulent Lm stammar också bedömas av Invivo infektion analyser. Möss var intravenöst samtidig infektion med en lika blandning av vild-typen och ΔprfALm stammar och 18 h senare var humant avlivas, lever exciderad och enda cell förberedelser gjordes. Isolerade leverceller var lyserat och den resulterande lysates utsätts för en CFU analysmetod som kunde skilja mellan vildtyps- och ΔprfALm stammar. Jämfört med 1:1 förhållandet mellan dessa två stammar i den ursprungliga inokulatet ('input'), ΔprfA/wild type förhållandet på 18 hpi ('output') var betydligt mindre än unity (för 6 möss var 0,001 till 0.330; menar 0,100) (figur 4). Däremot möss co-infekterade med en lika blandning av vild-typen och prfA * Lm stammar prfA */wild type nyckeltalen varierade från 2,4 till 10,2 (menar 7.1). Detta experiment visar att relativa smittsamheten dessa tre Lm -stammar (vildtyp, ΔprfAoch prfA *) i en intakt organism liknar som observerats i in vitro-infektion analyser.
Värden kan också kontrolleras för att fastställa huruvida den varierande nivån av smittsamhet av vildtyp, ΔprfAoch prfA * stammar är associerade med en motsvarande gradering av medfödda immunsvar. Det har tidigare visat att bosatta makrofager (Küpffer celler) och infiltrera inflammatoriska monocyter och neutrofiler spela kritisk och sammanhängande roller i skydda levern under Lm infektion5,6, 7,8. Celler beredd från icke-infekterade möss och möss som infekterats med GFP-uttryckande vildtyp Lm stam för 18 h var fläckade av cell typspecifika markörer och analyseras med flödescytometri. När det gäller icke-immun cellerna i levern (t.ex. hepatocyter och endotelceller) fanns det inga påvisbara skillnader mellan oinfekterade och infekterade möss. Däremot fanns det anmärkningsvärda infektionsrelaterade förändringar i levern när det gäller andelen immunceller som positivt färgas för den gemensamma leukocytantigen CD45 (figur 5A). Specifikt, möss som infekterats med vildtyp och prfA*Lm stammar hade signifikant högre nivåer av CD45+ celler i levern jämfört med icke-infekterade möss medan nivåerna av CD45+ levern celler i möss som infekterats med försvagat ΔprfALm stam var inte särskilt annorlunda än nivåer som observerats i icke-infekterade möss. Att ytterligare karakterisera både inhemska och infiltrera immunceller populationer, CD45+ celler kan vara främjat subtyped. Som observeras av andra9, en anmärkningsvärd förskjutning med infektion är nästan komplett försvinnandet av bosatta Küpffer celler (CD11bmitten av F4/80+i levern) och samtidig utseendet av en distinkt befolkningen av CD11bHej celler som representerar infiltrera neutrofiler (figur 5B; nedre mitten panelen). Också förekommer i levern på 18 hpi, är CD11bmitten av F4/80– celler visas som, eftersom de också är Ly6CHej, representerar infiltrera inflammatoriska monocyter (figur 5B, lägre mitten och höger paneler). I infekterade möss är dessa sistnämnda celler de enda cellerna där var märkbar GFP signal identifieras efter 18 hs av infektion (bild 5C). Detta sistnämnda konstaterande är liknande som nyligen rapporterats av Jones och D'Orazio som visade att hos möss, Lm primärt associerade med Ly6CHej -monocyter som infiltrerar tarmen efter livsmedelsburna infektioner10. Profilen för CD45Hej leverceller av möss som infekterats med Lm ΔprfA stam liknade det av icke-infekterade möss medan möss som infekterats med hyper-virulenta LmprfA * stam hade måttligt förhöjda nivåer av infiltrera neutrofiler och inflammatoriska monocyter jämfört med möss som infekterats med vildtyp Lm stam (inga data anges).
Figur 1 : Infektion av odlade makrofager av Listeria monocytogenes (Lm). Mus makrofag cellinje RAW 264,7 smittades in vitro-med antingen vildtyp Lm (wt; fyllda cirklar), försvagat Lm (ΔprfA; öppna cirklar) eller hyper-virulent (prfA *; öppna rutor) Lm stammar (se text för detaljer). (A) på 1,5, 3 och 6 timmar efter infektion (hpi), makrofager var lyserat och cellulära innehållet analyserades av kolonibildande enhet (CFU) analys. (B) infekterade makrofager behandlades kort med den antibiotiska gentamicin att eliminera icke-internaliserat Lm och på 6 hpi överdra media samlades in och analyseras av CFU assay. Streckade linjen representerar detektionsgränsen för analysen. Varje datapunkt representerar en oberoende väl/infektion och P-värden bestämdes av Student's t-test. Visas utförs resultatet av en enda representativa experiment tre gånger med liknande resultat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Aktin-bundna Lm analyseras med flödescytometri. Mus makrofag cellinje RAW 264,7 lämnades antingen infekterade eller smittade in vitro-med GFP-uttryckande Lm. Överliggande media togs bort, centrifugeras, och det insamlade materialet färgas med aktin-bindande phalloidin. Det färgade materialet var analyseras med flödescytometri och visat ljus-scattering tomterna (A) indikerar den gating används för GFP - och phalloidin-associerade nivåer av extracellulära (dvs media-härlett) Lm visas i (B). (B) det angivna området representerar GFP/aktin dubbel positiv Lm och deras överflöd som en procentandel av de totala händelserna inom ljus-scattering grindarna. (C) mus makrofager var infekterade med antingen GFP-uttryckande Lm eller en GFP-uttryckande Lm stam saknar den gen som kodar ActA (ΔactA) som rekryterar aktin-polymerisation maskinen värdcellens till den LM cellytan. På 6 hpi, infekterade celler var lyserat och släppt cellulära innehållet, inklusive den intracellulära Lm, var färgas för aktin och analyseras med flödescytometri. Visas utförs resultatet av en enda representativa experiment tre gånger med liknande resultat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Infektion av vildtyp och Perforin-2 knockout makrofager av Lm. Peritoneal makrofager isolerade från antingen en vildtyp (P2+/ +; fyllda cirklar) eller knockout (P2- /-, prickade cirklar) smittades in vitro-med Lm. (A) vid 1 och 6 hpi, makrofager var lyserat och cellulära innehållet analyseras av CFU assay. (B) infekterade peritoneal makrofager behandlades kort med den antibiotiska gentamicin och på 2,5 och 6 hpi överdra media samlades in och analyseras av CFU assay. Varje datapunkt representerar en oberoende väl/infektion och P-värden bestämdes av Student's t-test. Visas utförs resultatet av en enda representativa experiment tre gånger med liknande resultat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Lm infektion av musen. Grupper av 6 möss var infekterade med en lika blandning av antingen vildtyp Lm (wt) och försvagade Lm (ΔprfA) stammar eller en lika blandning av vild typ Lm och hyper-virulent (prfA *) stammar. På 18 hpi möss Lm bestämdes börda i levern av CFU assay. I detta experiment äger vildtyp Lm stammen en antibiotika-resistens-gen som gör att den skiljer sig från de antibiotika-känsliga Lm mutant stammarna. Lever homogenates var klädd på läkemedel som innehåller både antibiotika och antibiotika-fria medier och förhållandet mellan muterade och vildtyp Lm var ritade. Den streckade linjen representerar mutant/vildtyps-förhållandet mellan den infekterande DOS. De absoluta nivåerna av vildtyp Lm i de två kohorterna av möss var 12 och 15 CFU/106 levern celler, respektive. Visas utförs resultatet av en enda representativa experiment två gånger med liknande resultat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Immunologiska svar på Lm infektion i mus levern. Möss var antingen icke-infekterade eller systemiskt infekterade med 2 x 105 CFU av GFP-uttryckande Lm stammar för 18 h. Single-cell preparat med lever analyserades av flödescytometri för uttryck av immun - och myeloisk-specifika markörer. (A), andelen celler färgning positiva för immun-specifik cell surface markören CD45+ per 106 isolerade totala levande leverceller visas för icke-infekterade möss och möss som infekterats med antingen vildtyp (wt Lm), försvagade (ΔprfA), eller hyper-virulent (prfA *) Lm stammar. Ritade är medelvärdet av tre möss per grupp och P-värden bestämdes av Student's t-test. (B) visas i vänstra panelerna är färgning profilen CD45-färgning levern celler från en enskild oinfekterade mus (överst) och en individuell wt Lm- infekterade (botten); i de mellersta panelerna visas uttrycksnivåerna av myeloisk-specifika markörer CD11b och F4/80 av CD45+ celler; och på de högra panelerna visas de Ly6C uttrycksnivåerna för de angivna gated cellerna. I panelen längst till höger visas en överlagring av Ly6C+ celler från oinfekterade och infekterade möss inklusive procent och genomsnittlig fluorescens stödnivåer (MFI) av CD11b+ F4/80– celler positivt för den indikerade Ly6C gaten. Visas är en representativ mus från 3 möss per grupp. (C) Ly6C+ celler härstammar från lever av oinfekterade och infekterade möss (beskrivs (B), mitten och höger paneler) analyserades för god Jordbrukarsed uttryck av flödescytometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av dess snabba och processive cellulära infektion program är Lm en idealisk patogen sond cellulära aktiviteter som påverkar infektion. Ett antal värd faktorer har identifierats som antingen positivt eller negativt påverkar Lm cellulära infektion11,12,13,14. Två sådana värd faktorer kännetecknas i vårt laboratorium, Perforin-2 och den reglerade Heme-hämmaren (P2 och Hej), reglera olika funktioner av Lm infektionsprocessen. Som visas i figur 3, P2 bristfällig celler är mycket mottagliga för Lm och detta förbättrad känslighet också är sant av P2 knockout möss4. Detaljerad jämförande studier av P2-uttryckande och P2-brist makrofager visade att sistnämnda cellerna bildas starkt försurade Lm-innehållande phagosomes som resulterade i förbättrad virulens genuttryck. Hypotesen att differential virulens genuttryck bidrar till förbättrad känslighet av P2-brist makrofager stöddes av konstaterandet att den hyper-virulent prfA * stam, att, som tidigare nämnts, uttrycker virulens gener på ett konstitutivt hög nivå, infekterade P2-uttryckande och P2-brist makrofager lika väl4. Således, tillgången till en hyper-virulent Lm stam gjort det möjligt att testa hypotesen att P2 värd faktorn negativt reglerar patogen virulens faktor distribution. För Hej, vi visade att denna värd faktor reglerar intracellulära människohandel Lm så att dess uppkomst från den infektera cellen är begränsad; Detta cellulär aktivitet är sannolikt baserna för förbättrad känslighet av Hej-brist möss för Lm infektion15,16.
I studier som dokumenterat cellulära aktiviteter som förekommer inom minuter efter infektion, är det avgörande att före deras samtidig inkubering, att både bakterier och värdcellerna inte är överdrivet utsätts för fluktuerande temperaturer eller andra miljömässiga villkor som kan aktivera stressreaktioner som skulle överlappa (och blanda ihop) infektion-inducerad aktiviteter. För de studier som beskrivs ovan, inkluderar detta sådana till synes enkla punkter som minimerar hanteringstiden LM precis innan infektion. Exempelvis om en bakterieodling tas bort från en skakande 37 ° C inkubator och tillåtet att sitta på en bänk, kommer att förändringar i både temperatur och syre tillgänglighet (bland annat) aktivera anpassningar som kan påverka den inledande fasen av den efterföljande interaktion med värdcellen. Likaså är värdceller också känsliga för temperatur och media förskjutningar som kan påverka initial infektion Svaren. Även om i praktiken är det omöjligt att helt eliminera alla svängningar i bakteriell och värdcell odlingsskålar villkor, genom att minska dem så mycket som möjligt och att upprätta en standard verksamhetsplan, variationen mellan experiment kommer att minimeras.
En ytterligare variabel, som enligt vår uppfattning vars betydelse är också undervärderade, är användningen av antibiotika i cell kultur infektion modeller. Gentamicin är ofta antibiotika val eftersom det är relativt ogenomtränglig för eukaryota plasmamembranet. I både äldre och aktuella litteratur, det är allmänt används på 50 µg/mL för att döda extracellulära (dvs. icke-internaliserat) bakterier. Nyligen visats det direkt att när närvarande på 25 µg/mL, det finns tillräcklig spridning av gentamicin över eukaryota membranet att döda intracellulära Lm17. I vår erfarenhet, denna nivå av gentamicin dödar Lm omedelbart vid kontakt, medan mycket lägre nivåer, i 2-5 µg/mL utbud döda > 99,9% Lm på mindre än 5 min4. Lawrenz och kollegor har visat att de utbredda gentamicin koncentrationerna av 25 – 50 µg/mL är också tillräckligt för att döda intracellulära Yersinia pestis18. Intressant, denna grupp visade också stora skillnader mellan cell typer i form av gentamicin vilket belyser de optimala förhållandena bör bestämmas för varje patogen-host cell ihopkoppling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS - Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28 G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
References
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
- Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
- Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
- Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
- Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
- Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
- Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
- Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
- Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
- Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
- Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
- Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
- Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
- Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
- VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).
