Summary
Her presenterer vi en flyt cytometric protokoll for å identifisere CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B celler, NK celler og monocytter i perifert menneskeblod med bare to fluorochromes i stedet for syv. Med denne tilnærmingen, kan fem ekstra markører registreres på de fleste flyt cytometers.
Abstract
Immun celle karakteristikk er sterkt avhengig av flerfarget flowcytometri å identifisere subpopulasjoner basert på annerledes uttrykk for overflate markører. Installasjonen av en klassisk multicolor panel krever high-end instrumenter, egendefinert merket antistoffer og nøye studie design å minimere spectral overlapping. Vi utviklet en multiparametric analyse for å identifisere store menneskelige immun populasjoner (CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B celler, NK celler og monocytter) i perifert blod ved å kombinere syv lineage markører bruker bare to fluorochromes. Vår strategi er basert på observasjon at lineage markører er stadig uttrykt i en unik kombinasjon av hver celle befolkningen. Kombinere denne informasjonen med en forsiktig titrering av antistoffer kan etterforskerne å spille fem ekstra markører, utvide optisk grensen på de fleste flyt cytometers. Head-to-Head sammenligning viste at det store flertallet av immun celle populasjoner i perifert blod kan være preget med tilsvarende nøyaktighet mellom vår metode og den klassiske "et fluorochrome-ett merke tilnærmingen", selv om sistnevnte er fortsatt mer nøyaktig identifisere bestander som NKT celler og γδ T celler. Kombinere syv markører bruker to fluorochromes tillater analyse av komplekse immun celle populasjoner og klinisk eksempler på rimelig 6-10 fluorochrome flyt cytometers, og selv om 2-3 fluorochrome feltet instrumenter i områder med begrensede ressurser. High-end instrumenter kan også fordelen av denne tilnærmingen med ekstra fluorochromes for å oppnå dypere flyt cytometri analyse. Denne tilnærmingen er også godt egnet for screening flere celle populasjoner i klinisk prøver med begrenset antall celler.
Introduction
Flowcytometri er en teknikk som ble utviklet for å analysere flere parametere på enkelt partikler med en hastighet på flere tusen av hendelser per andre1. Eksempler av analysert av flowcytometri omfatter, men er ikke begrenset til, celler, perler, bakterier, blemmer og kromosomer. Et fluidic system leder partikler i avhør punktet der hver partikkel krysser banen med én eller flere lasere, og flere parametere registreres for videre analyse. Fremover og side Scattere, generert av spredning av ren laserlys, brukes til å identifisere målgruppen og hente informasjon om den relative størrelsen og interne kompleksitet/detaljnivå av partikler, henholdsvis. Alle de andre parametrene, som står for mesteparten av dataene i en flyt cytometric analyse, er avledet av fluorochrome-merket sonder gjenkjenner og binder seg til konkrete mål på partikler av interesse.
Flowcytometri er hovedverktøy for immunologiske studier for å identifisere og karakterisere celle populasjoner. For å analysere kompleksiteten av immunsystemet, utvikling flerfarget paneler stadig for å utvide antall markører samtidig registrert for dyp immunophenotyping celle populasjoner1. Dette fører til utvikling av mer kapabel instrumenter og fluorochromes, med siste high-end flyt cytometers overstiger 20 fluorescerende parametere. Dette resulterer i komplekse studien design på grunn av fluorochrome spectral overlapping og høyere kostnader forbundet med egendefinerte antistoff merking og dyktige operatører. I flere tilfeller reduseres kompleksiteten og kostnadene med forskjellige paneler av markører for ulike celle populasjoner. Denne tilnærmingen, men er feil, reduserer informasjonen i hvert panel, og kan være vanskelig å bruke prøver med begrenset antall celler. Videre utelukker øke antall markører dyp immunophenotyping på instrumenter med færre fluorescerende parametere. Vi utviklet en fargeprotokoll for å identifisere store menneskelige immun populasjoner (CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B celler, NK celler og monocytter) i perifert blod mononukleære celler (PBMCs) ved å kombinere syv lineage markører bruker bare to fluorochromes i stedet for syv må bruke den tradisjonelle "en fluorochrome-en indikator" tilnærming (www.hcdm.org)2,3. Vår første rapport undersøkt og godkjent begrepet kombinere syv markører i to fluorochromes for dyp immunophenotyping. I denne rapporten presenterer vi en steg-for trinn protokoll for å isolere og flekken perifert blod celler, med fokus på det praktiske aspektet og feilsøkingstrinn for å oppnå en vellykket flekker.
Denne protokollen er basert på observasjon at lineage markører har et konstant uttrykk på celleoverflaten og at hver celle befolkningen har en eksklusiv kombinasjon av lineage markører. I PBMCs, CD3 uttrykk deler immunceller inn i to hovedkategorier: CD3-positive T-lymfocytter og CD3-negativ celler. I CD3 positiv undergruppen, CD4+, CD8+ og γδ T celler kan deles ved hjelp av antistoffer som er utelukkende rettet mot CD4 og CD8 γδ reseptoren. På en tilsvarende måte, innenfor CD3 negative undergruppen, kan B celler, NK celler og monocytter identifiseres med antistoffer mot CD19, CD56 og CD14, henholdsvis. I en standard en fluorochrome-en markør tilnærming, anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19, - CD56 og -TCR γδ antistoffer er oppdaget med syv forskjellige fluorochromes. Vår tilnærming kombinerer anti-CD3, - CD56 og -TCR γδ antistoffer i en fluorochrome (merket for bekvemmelighet fluorochrome A) og anti-CD4,-CD8, -CD14 og - CD19 antistoffer i en annen fluorochrome (fluorochrome B). Dette er mulig ved en kombinasjon av antistoff titrering og differensial antigen uttrykk. Begge CD4+ og CD8+ T celler er positive anti-CD3 antistoffer i fluorochrome A, men de kan skilles i fluorochrome B maksimere uttrykk for CD8 signalet mens plassere, med en ad hoc titrering, CD4 signalet mellom CD8 og CD3 positive-CD4/CD8 dobbel negative cellene. Γδ T-celler uttrykker høyere nivå av CD3 enn CD4 og CD8, og derfor de kan identifiseres som CD3 høy4. Signalet er ytterligere styrket av merking γδ T celler i fluorochrome A med en anti-TCR γδ antistoffer, dermed forbedre skille mellom CD3 lav T celler og CD3 høy γδ T celler. B celler kan identifiseres som CD3- i fluorochrome A og CD19+ i fluorochrome B. Separate CD3 negative NK celler fra B-celler, ble et anti-CD56 antistoff brukt i fluorochrome A som anti-CD3. Dette er mulig fordi CD56 uttrykt på NK celle på et mye lavere nivå enn CD3 på T celler5. Til slutt, monocytter kan identifiseres via en kombinasjon av frem-side scatter egenskaper og uttrykk for CD14 i fluorochrome B.
Ideen om å kombinere opp til fire markører bruker to fluorochromes har allerede har tidligere vært forsøkt6,7,8, og har vært brukt i en klinisk protokoll for å identifisere ondartet lymfatisk bestander9 . En tidligere rapport også kombinert syv markører (med ulike spesifisitet fra markører enn vi brukt i våre protokollen) bruker to fluorochromes, men denne tilnærmingen avhengig av en sammensatt merking av hver antistoff med varierende mengde fluorochrome10. Dette er vår metode som bruker kommersielt tilgjengelige antistoffer og kan tilpasses Instrumentkonfigurasjonen og kan dra nytte av den nye generasjonen av polymer fluorochromes.
Det overordnede målet med denne metoden er å utvide optisk grensene for de fleste flyt cytometers slik at innspillingen av fem ekstra markører kan forhøre komplekse celle populasjoner. Som en konsekvens, avansert immunologiske analyse kan utføres på rimelig 6-10 fluorochrome flyt cytometers, og 2-3 fluorochrome feltet instrumenter kan oppnå bemerkelsesverdige resultater i områder med begrensede ressurser. High-end instrumenter kan også fordelen av denne tilnærmingen med ekstra fluorochromes å oppnå dypere flyt cytometri analyse og opprette modulære flyt cytometric paneler målretting flere linjene på samme tid11. Dette kan potensielt redusere antall paneler som brukes i modulære immunophenotyping flowcytometri og redusere kostnader, feil og håndtering tid. Denne tilnærmingen er også godt egnet ved klinisk prøver med begrenset antall celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studier av menneskelig materialer ble godkjent av Johns Hopkins institusjonelle anmeldelsen bord under Health Insurance Portability and Accountability Act. Pasienten og kontroll var de identifiserte. PBMCs og blod fra sunn kontroller ble oppnådd ved samtykke.
Merk: Denne protokollen er testet på fersk eller frossen isolert perifert blod celler og hele blod.
1. celle forberedelse
-
Isolering av perifert blod celler (PBMC) fra fullblod
- Trekke blod i et 10 mL green-topp rør som inneholder natrium heparin. Når røret er fylt med blod, invertere umiddelbart røret flere ganger for å hindre koagulering.
Merk: Rør som inneholder andre antikoagulerende som ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) eller natriumsitrat kan brukes med sammenlignbare resultater. Hvis en annen mengde blod samles inn, skal følgende trinn i protokollen skaleres tilsvarende. - Nøye overføre trukket blod inn i et 50 mL konisk rør. Fortynne blodet med en lik mengde fosfat bufret saltvann (PBS) uten kalsium og magnesium.
- Legge til 15 mL av tetthet gradert medium (f.eks Ficoll) i bunnen av en ny 50 mL konisk tube og nøye overlegg utvannet blod på tetthet gradert medium, unngå en blanding mellom tetthet gradert medium og utvannet blod.
Merk: Dette er et kritisk punkt for en skikkelig separasjon av PBMCs fra røde celler. - Sentrifuge 400 x g i 30 min ved romtemperatur (RT), med ingen bremser å unngå avbrudd av grensesnittet.
- Etter sentrifugering, nøye Sug opp øvre laget med en pipette og kaste den, betaler oppmerksomhet til ikke fjerne celler på grensesnittet mellom plasma og tetthet gradert medium, dvs der PBMCs stratifies. Samle så mange celler som mulig fra grensesnittet uten å berøre den røde celle pellet nederst på 50 mL konisk tunnelbane og overføring til en ny 50 mL konisk tube.
- Legge til PBS for å bringe det siste bindet til 25 mL og invertere flere ganger å blande. Sentrifuge på 300 x g i 10 min på RT med brems på fjerne alle tetthet gradert middels forurensning fra cellen suspensjon.
- Nøye Sug opp nedbryting uten forstyrrende celle pellets. Legge til PBS for å bringe det siste bindet til 25 mL og invertere flere ganger å blande. Sentrifuge 200 x g i 10 min på RT med brems på Fjern blodplater.
- Nøye Sug opp nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet. Resuspend PBMCs i 1 mL av PBS/0.1% Natriumazid. Natriumazid reduserer capping, shedding, internalisering av antistoffer og øker celle utvinning, men dens toksisitet kan svekke celle levedyktighet. Derfor bør Natriumazid unngås i alle trinnene hvis cellene vil bli kultivert for etterfølgende eksperimenter. Cellen aisolering og flekker uten Natriumazid ga lignende resultater for flekker utført i nærvær av Natriumazid.
Forsiktig: Natriumazid kan føre til døden ved påvirker sentralnervesystemet. Kontakt kan forårsake brannsår til hud og øyne. - Fortynne celler for telling av overføring 30 µL av PBMCs i en 1,5 mL microcentrifuge tube. Legg deretter til 120 µL av PBS og 150 µL Trypan blå å bestemme celle nummer og levedyktighet (1:10 celle fortynning). Resuspend nøye.
- Overfør 10 µL til en hemocytometer, teller cellene tilsvarende til brukte opptellingen kammer og Finn nummeret på levedyktige cellers. Levedyktige cellers = antall Trypan blå negativ celler totalt x 10 (fortynningsfaktoren i denne protokollen) x 104.
Merk: I gjennomsnitt, 7-15 x 106 av PBMCs skal samles fra 10 mL blod. - Resuspend cellene på 10 x 106 per mL PBS/0.1% Natriumazid
Merk: PBMC kan være frosset og lagret i flytende nitrogen for en lengre periode. Uttrykk for markører som chemokine reseptorer kan imidlertid endres ved denne prosedyren.
- Trekke blod i et 10 mL green-topp rør som inneholder natrium heparin. Når røret er fylt med blod, invertere umiddelbart røret flere ganger for å hindre koagulering.
-
Utarbeidelse av celler fra frosne PBMC
Merk: forskjellige frysing prosedyrer kan påvirke celle utvinning og levedyktighet12. PBMCs for disse eksperimentene var frosset i spesialutviklet media eller fosterets bovin serum (FBS)/10% dimethyl sulfoxide (DMSO) med lignende resultater.
Forsiktig: DMSO kan være litt farlig ved innånding (lunge irriterende), hudkontakt (irriterende, permeator), på øyekontakt (irriterende), inntak.- Fjerne frosne PBMC fra flytende nitrogen og plasser på isen. Overføring av cryovial fra isen direkte i vannbad 37 ° C. Holde cryovial på vannflaten og forsiktig risting hetteglass gjenstår liten is pellets. Overføre cryovial tilbake på isen.
- Fjern alle vann med 70% etanol sprayet tømming. Sakte legger til 1 mL av PBS/0.1% Natriumazid 4 ° C og nøye overføre cellen til en 15 mL konisk rør. Sakte legge kaldt PBS/0.1% Natriumazid på 4 ° C til et endelig antall 15 mL.
- Sentrifuge på 300 x g for 10 min. nøye fjerne det supernatant, resuspend celler i 1 mL av PBS/0.1% Natriumazid.
Merk: Cellene kan også være resuspended i RPMI 10% FBS med lignende resultater. - Fortynne cellen for opptelling ved å overføre 30 µL av PBMCs i en 1,5 mL microcentrifuge tube. Legg deretter til 120 µL av PBS og 150 µL Trypan blå å bestemme celle nummer og levedyktighet (1:10 celle fortynning). Resuspend nøye.
- Overfør 10 µL til en hemocytometer, teller cellene tilsvarende til brukte opptellingen kammer og Finn nummeret på levedyktige cellers. Levedyktige cellers = antall Trypan blå negativ celler totalt x 10 (fortynningsfaktoren i denne protokollen) x 104.
- Resuspend cellene på 10 x 106 per mL i PBS/0.1% Natriumazid.
-
Utarbeidelse av celler fra fullblod
- Trekke blod i et 10 mL green-topp rør som inneholder natrium heparin. Når røret er fylt med blod, invertere umiddelbart røret flere ganger for å hindre koagulering.
Merk: Rør som inneholder andre antikoagulerende som EDTA eller natriumsitrat kan brukes med sammenlignbare resultater. Hvis en annen mengde blod samles inn, skal følgende trinn i protokollen skaleres tilsvarende. - Overføre 200 µL av fullblod slik 12 x 75 mm avkortet, legge 2 µL Natriumazid og vortex forsiktig i 2 s.
- Trekke blod i et 10 mL green-topp rør som inneholder natrium heparin. Når røret er fylt med blod, invertere umiddelbart røret flere ganger for å hindre koagulering.
2. celle flekker
Merk: Velge par fluorochromes med nesten ingen spectral overlapping er viktig å redusere spredningen av data på grunn av høy ringvirkninger av en fluorochrome på andre fluorochrome detektoren. For å oppnå en optimal identifikasjon av al celle undergrupper, bør fluorochromes med en høy quantum avkastning brukes som antistoff par PE-BV421 og PE-APC.
-
Farging av fersk og frossen PBMC
- Overføre 100 µL av PBMC (1 x 106 celler) til en 96-brønns V-bunnplaten.
Merk: Eventuelle antall celler som er lavere enn 1 x 106 kan brukes med lignende resultater2. - Sentrifuge 350 x g i 3 minutter på RT og nøye Sug opp nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet. Legge til hver vel 100 µL av PBS inneholder en live/dead fixable fargestoff som reagerer med gratis Amin på proteiner i 10 min å merke døde celler.
- Forberede hver eksempel 30 µL av en blanding som inneholder alle antistoffer (anti-CD3.-CD56, TCRγδ i fluorchrome A og anti-CD4, CD8, CD19, CD14 i fluorchrome B). Konsentrasjon av antistoffer er angitt i tabell 1 og Tabell2. På dette stadiet, titrerte antistoffer mot ulike molekyler og i forskjellige fluorochromes kan legges også (f.eks tabell 3).
Merk: Antistoffer konsentrasjon kan variere avhengig av produsent og partinummer. Foreløpige tester bør derfor gjøres for å oppnå optimal signalet. PBS, PBS/0.5% BSA, PBS/0.2% Natriumazid eller PBS/0.5% BSA/0.1% Natriumazid ble brukt med samme resultat for å fortynne antistoffer2. Cellen kan også være farget i bind forskjellig fra 30 µL enkelt integrere denne metodikken til allerede eksisterende Fargeprotokoller. - Sentrifuge 350 x g i 3 minutter på RT og nøye Sug opp nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet. Legg antistoff cocktail i hver brønn og resuspend nøye uten å generere bobler. Inkuber i 30 min på RT i mørket.
Merk: Det er mulig stain prøvene på 4 ° C med lignende resultater. - Legg til 150 µL av flekker buffer og sentrifuger 350 x g i 3 minutter på RT og nøye Sug opp nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet. Resuspend cellene i 200 µL av PBS og få data på en flyt cytometer. Dersom flekker volumer, Kontroller minst en 20-fold fortynning av den opprinnelige antistoff brukt til å vaske overskytende av antistoffer.
Merk: Farget celler kan være fast med i PBS/2% paraformaldehyde, oppbevares i kjøleskap på 4 ° C over natten og deretter kjøpt på en flyt cytometer dagen.
Forsiktig: Paraformaldehyde er skadelig hvis svelget og kan forårsake hudirritasjon
- Overføre 100 µL av PBMC (1 x 106 celler) til en 96-brønns V-bunnplaten.
-
Farging av fullblod
- Hver 12 x 75 mm avkortet rør, legge til cocktail av antistoffer (anti-CD3.-CD56, TCRγδ i fluorochrome A og anti-CD4, CD8, CD19, CD14 i fluorochrome B) og Inkuber på RT i 30 min på RT i mørket. Konsentrasjon av antistoffer er angitt i Tabell 4. På dette stadiet, titreres antistoffer mot ulike molekyler og i forskjellige fluorochromes kan legges også. Antistoff konsentrasjon kan variere avhengig av produsent og partinummer. Foreløpige tester bør derfor gjøres for å oppnå optimal signalet.
Merk: Det er mulig å flekken prøver på 4 ° C med lignende resultater. - Sentrifuge 350 x g i 3 minutter på RT og nøye Sug opp nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet. Lage en 1 x løsning av røde blodlegemer lyseringsbuffer følg produsentens instruksjoner.
Merk: Lysis løsningen bør være RT før bruk. - Legge til 2.0 mL 1 x røde blodlegemer lyseringsbuffer til hver tube, cap godt og invertere flere ganger å blande. Dekk med aluminiumsfolie og la sitte i 15 min.
- Nedspinning på 300 x g for 5 min. nøye Sug opp nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet.
- Legge 2 mL PBS og sentrifuger på 300 x g i 5 min.
Merk: på dette punktet, celle pellet bør ha en blek hvit farge indikerer en vellykket røde blodlegemer lysis. Nøye Sug opp nedbryting å ikke forstyrre celle pellets og forsiktig resuspend cellene i 200 µL av PBS. - Strain cellene til 12 x 75 mm rør med 40 µm filter caps å fjerne celle aggregater og hente data på en flyt cytometer.
- Hver 12 x 75 mm avkortet rør, legge til cocktail av antistoffer (anti-CD3.-CD56, TCRγδ i fluorochrome A og anti-CD4, CD8, CD19, CD14 i fluorochrome B) og Inkuber på RT i 30 min på RT i mørket. Konsentrasjon av antistoffer er angitt i Tabell 4. På dette stadiet, titreres antistoffer mot ulike molekyler og i forskjellige fluorochromes kan legges også. Antistoff konsentrasjon kan variere avhengig av produsent og partinummer. Foreløpige tester bør derfor gjøres for å oppnå optimal signalet.
3. antistoff titrering
Merk: Antistoff titrering er det viktigste trinnet for å få høy kvalitet og reproduserbar data. Titrering av anti-CD3,-CD8,-CD14, - CD19 og -TCR γδ følger standard prosedyre som konsentrasjonen av antistoff optimalt skille positive og negative topper er avledet av maksimalt flekker indeks13,14. Fortynninger topp eller nærmere toppen på stigende side av flekken indeks kurven bør være valgt (Figur 1A-C). Anti-CD4 antistoffer titreres for å plassere toppen av befolkningen CD4 positiv mellom CD3 enkelt positiv befolkninger og CD3 + CD8 + T celler, nærmere på CD3 enkelt positive signalet å bedre diskriminere CD8dim befolkningen (CD8 + γδ T celler og NK T celler). Langs samme linje, CD56 titrering mål posisjon NK CD56+ celler mellom CD3+ og CD3- befolkningen.
-
Maksimal flekken indeks kurve
Merk: Serine anti-CD3,-CD8,-CD14, - CD19 og -TCR γδ følger standard prosedyre som konsentrasjonen av antistoff optimalt skille positive og negative topper er avledet av maksimalt flekker indeks kurve15. Hvis antistoffer mot andre markører er lagt til i panelet, må de også være titreres med maksimal flekker indeks sving.- Forberede en 2-fold antistoff fortynning av fylle 10 brønner til en 96-brønns plate med 40 µL av flekker buffer. I den første brønnen, øke endelige volumet til 80 µL flekker bufferen og legge antistoffer rundt i en konsentrasjon 4 ganger konsentrasjonen foreslått av produsenten.
- Bland godt og overføre 40 µL til andre også. Bland godt og gjenta dette trinnet for alle de andre brønnene.
- Stain 10 prøver av PBMC eller fullblod med 30 µL av de 10 forskjellige 2-fold fortynninger av antistoffer følger protokollen beskrevet før.
- Hente data med en flyt cytometer og plotte signalet fra hver fortynning (figur 1A).
- Gate på de negative og positive befolkningene hver antistoff konsentrasjon. Øker konsentrasjonen av antistoffer kan føre til høyere bakgrunn. Derfor størrelsen negative porten tilsvarende.
- For hver antistoff konsentrasjon, ekstra informasjon om median og standardavvik for fluorescerende intensiteten av negative befolkningen og medianen for fluorescerende intensiteten av positiv befolkningen. Beregne for hvert antistoff konsentrasjon flekken indeksen med denne formelen: (median fluorescerende intensiteten av befolkningen positiv-median fluorescerende intensiteten av negative befolkningen) ÷ (2 x standardavvik fluorescerende intensitet av den negativ befolkningen) (figur 1B).
- Tegne flekken indeks vs. antistoff konsentrasjonen uttrykt som brøkdel av antistoff fortynning (f.eks 1:10 fortynning = 0.1), og identifisere konsentrasjonen av antistoff med maksimal flekken indeksverdien (figur 1 c).
-
Anti-CD4 og -CD56 antistoff titrering
Merk: Anti-CD4 og -CD56 antistoffer titrering avhengig tidligere titrering andre markører i to-fluorochrome-panelet. Anti-CD4 antistoffer Serine tar sikte på å plassere anti-CD4 signal mellom den doble CD8+/CD3+ signal og CD3 enkelt positiv befolkningen (figur 1 d).- Sjarmere anti-CD4 og CD56 antistoffer med en 2-fold fortynning som beskrevet tidligere, legge ekstra konsentrasjoner i mellom for å identifisere fint området konsentrasjon som tillater for å skille CD4+ T celler og NK celler fra andre cellen bestander.
- Sjarmere anti-CD4 antistoffer ved å plassere anti-CD4 signalet mellom den doble CD8+/CD3+ signal og CD3 enkelt positiv befolkningen (figur 1 d).
Merk: Forsiktighet bør gjøres for å skille CD4+ T celler fra CD8+ dim populasjoner. - Sjarmere anti-CD56 antistoffer følge en strategi som ligner anti-CD4 antistoff titrering, ved å plassere NK celler mellom CD3-negative og CD3-positive befolkningen.
4. gating strategi
-
Identifisere lymfatisk og monocytic celle populasjoner og fjerne døde celler og de fleste av de gjenværende røde blod cellene fra analysen.
- Velg hele befolkningen som inneholder lymfocytter og monocytter basert på fremover vs siden scatter området (FSC-A vs SSC-A). Fjerne celle aggregater fra analyse via frem scatter høyde vs frem scatter bredde (FSC-H vs FSC-W) og scatter høyde vs siden scatter sidebredden (SSC-H vs SSC-W).
- Bruk merketråd live/dead diskriminering ekskludere lyse positiv døde celler og gjenværende røde blod celler fra analyse. Gate på lymfocytter og monocytter basert på en annen FSC-A og SSC-en profil.
-
To-fluorochrome syv-markør gating strategi av lymfatisk befolkningen.
Merk: i CD3 positiv undergruppen, CD4+, CD8+ og γδ T celler kan deles ved hjelp av antistoffer som er utelukkende rettet mot CD4 og CD8 γδ reseptoren. På en tilsvarende måte, innenfor CD3 negative undergruppen, kan B celler, NK celler og monocytter identifiseres med antistoffer mot CD19, CD56 og CD14, henholdsvis.- Velg lymfocytt porten og lage en prikk med tomt i hver akse en av to fluorochromes brukes i denne protokollen (figur 2B).
- Gate på CD8+ T celler som CD3+/CD8+ dobbel positiv celler øverst i høyre hjørne av dot-handlingen (figur 2B). Ekskludere dim CD8 befolkningen som kan inneholde NKT celler. Gate på CD4+ T celler som befolkningen mellom CD8+ T celler og CD3 enkelt positiv populasjoner. Gate på γδ T celler identifisert som høy CD3 celler. Dele γδ T celler i CD8 positiv og CD8 negative.
- Gate på NK cellene som befolkningen mellom CD3-positive og CD3-negativ. Dele NK celler i CD8 positiv og CD8 negative. Porten på B celler som CD3-negativ CD19+ befolkningen på høyre nedre hjørne av dot tomten.
- Velg monocytt portene og lage en prikk med tomt i hver akse en av to fluorochromes brukes i denne protokollen (figur 2C). Gate på CD3-/CD14+ befolkningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oppsett og analyse av en flyt cytometri eksperimentet menneskeceller perifert blod farget med syv lineage markører (anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19, - CD56 og -TCR γδ antistoffer) bruke bare to fluorochromes presenteres.
Representant resultater er beskrevet for anti-CD8 og -CD56 antistoff titrering. For hver antistoff (i dette eksemplet anti-CD8), data fra ti påfølgende 2-fold fortynninger ble registrert for å beregne en flekk indeks kurve (Figur 1A-C). Optimal antistoff konsentrasjon ble bestemt av maksimale flekken indeks signal13,14. Fortynninger topp eller nærmere toppen på stigende side av flekken indeks kurven skal velges. Anti-CD4 og -CD56 antistoffer var titreres med flekker perifert blod celler sammen med andre markører i to-fluorochrome-panelet (tidligere titreres). Anti-CD4 antistoffer, titrering bør sikte på å plassere anti-CD4 signalet mellom den doble CD8+/CD3+ signal og CD3 enkelt positiv befolkningen (figur 1 d). Forsiktighet bør gjøres for å skille CD4+ T celler fra CD8+ dim populasjoner. PBMCs var farget med optimal konsentrasjon av de angitte markørene og ulike konsentrasjoner av anti-CD4. Fargekode for de: angir grønn konsentrasjoner som resulterer i en optimal separasjon av CD4+ T celler fra andre CD3+bestander; oransje indikerer konsentrasjoner som resulterer i en akseptabel, men ikke ideelt separasjon; rødt betyr konsentrasjoner som resulterer i dårlig separasjon av CD4+ T celler fra dim CD8 celler eller CD4/CD8 dobbel negative populasjoner. Anti-CD56 Serine ble gjort på en lignende måte som anti-CD4 antistoffer, ved å plassere NK cellene mellom CD3-negative og CD3-positive befolkningen.
Representant gating strategi viser hvordan å identifisere lymfatisk og monocytic celle populasjoner og fjerne fra analyse døde celler og de fleste av de gjenværende røde blodlegemene (figur 2A). Alle påfølgende analyse basert på denne gating strategien. Representant gating strategi brukes til å identifisere CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B celler, NK celler og monocytter i de to fluorochrome-sju markør flekker (figur 2B-C).
Representant negative resultater er avledet fra feil eksempel forberedelse og titrering anti-CD4 og - CD56 antistoffer. Sviktende å riktig sjarmere CD4 resulterer i dårlig separasjon av CD4+ T celler fra CD8+ T celler (figur 3A), mens en dårlig CD56 titrering kan føre til en dårlig separasjon av NK fra B-celler og celler negativt for alle indikatorene i flekker panelet ( Figur 3B). Dårlig RBC lysis kan oppstå med hele blod flekker. Hvis det primære målet av protokollen er å beregne prosentdelen av ulike celle befolkningen (f.eks % av CD4+ T celler), forurensning med RBC dobbel negativ celler, som vises i dot plottet som dobbel negative befolkningen, bør ekskluderes fra analyse (Figur 3 c). Basert på vår erfaring med denne protokollen, vi har merket den nøyaktige avstanden mellom B celler og NK CD8+ celler kan verifiseres ved hjelp av andre markører. Som et eksempel er NK celler dobbel negative HLA-DR og CCR6, mens B-celler er dobbel positive (figur 3D).
Protokollen presentert i dette manuskriptet er ment å være en del av en flerfarget flekker panel avhøre flere immun populasjoner i prøver med begrenset antall celler. Ved denne tilnærmingen undersøkt vi dynamics immun bestander av langsgående prøver fra givere med myelom mottar en stilk cellen transplantasjon (Clinicaltrials.gov NCT0056609816). Frosne PBMC var samlet og analysert av flowcytometri på dag 0, 14, 28, 60, 180, 360 etter transplantasjon. Bruker denne tilnærmingen, vi var i stand til å lage flere lymfocytt befolkningen fokuserer på profilen sin naiv/minne (CD45RA, CCR7) aktivisering og celle utmattelse status (HLA-DR, CD57, CD45RA + effektor minne, CD16), og T effektor fenotypen (CCR4, CCR6, CXCR3) i en enkelt flekker panelet17,18,19,20,21,22,23,24,25 , 26. Dette er spesielt nyttig med tanke på at antallet innsamlede celler for noen pasienter og tidspunkt var knapt nok for bare en enkelt flekker panel. Representant gating strategi (Figur 4) og dynamikken i valgt celle populasjoner (figur 5) av en relapsing pasienten over tid. I myelom B kan celler uttrykke NK merket CD56. Hvis du vil utelukke denne muligheten, brukte vi HLA-DR og CCR6 å fremme skille ut B celler fra NK celler (figur 4B). CD8+ minne og naiv T celler ble identifisert av uttrykk for CD45RA og CCR7: naiv (CD45RA+/CCR7+), sentrale minne (CM, CD45RA-/CCR7+), effektor minne (EM, CD45RA-/CCR7- ) og effektor minne CD45RA+ (EMRA, CD45RA+/CCR7+) (figur 4C). Uttrykk for HLA-DR og CD57 i CD8+ naiv, totalt minne T-celler (som omfatter CM, EM og EMRA), CM, EM og EMRA (Figur 4 d). CD4+ minne og naiv T celler ble identifisert av uttrykk for CD45RA og CCR7: naiv (CD45RA+/CCR7+), sentrale minne (CM, CD45RA-/CCR7+), effektor minne (EM, CD45RA-/CCR7- ) og effektor minne CD45RA+ (EMRA, CD45RA+/CCR7+) (figur 4E). HLA-DR og CD57 uttrykk i CD4+ naiv og minne befolkningen (som omfatter CM, EM og EMRA), CM, EM og EMRA (figur 4F). CCR4 og CCR6 ble brukt som markører for å identifisere i befolkningen minne Th9 CD4+ T celler (figur 4G). Th1, Th1/17, Th2 og Th17 CD4+ T helper subpopulasjoner ble identifisert av uttrykk for CCR4, CCR6 og CXCR3 (Figur 4 H). CD16 og CD57 uttrykk i NK celler (figur 4I). Stamceller transplantasjon resulterte i en vedvarende CD4+ og CD8+ T celle aktivering som vist av økt uttrykk av HLA-DR og CD57, og i en skew av T hjelper en Th1 fenotypen. På dag 60 prosenten av B-celler dramatisk utvidet forutsi det pasienten tilbakefall (figur 5).
Figur 1: representant antistoff titrering. (A) Dot plottet viser CD8 uttrykk på fersk PBMC farget med angitte konsentrasjonen av antistoffer. (B) tabellen representerer median og standardavvik av fluorescerende intensiteten av CD8+, median fluorescerende intensitet CD8- befolkningen, og avledede flekken indeksen for hver konsentrasjon testet. (C) grafen vist hvordan til derivate optimal konsentrasjonen av antistoffer som en funksjon av flekken indeks. (D) representant titrering CD4 antistoff. Panelet D er endret fra Boin et al. 20172. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant gating strategi og resultatene av subpopulasjon diskriminering. (A) skjematisk fremstilling av doublet eksklusjon, lever celler diskriminering og basert på størrelse gating av lymfocytter og monocytter. (B) lymfocytt subpopulasjoner identifisert med to fluorochrome tilnærming. (C) monocytter identifisert med to fluorochrome tilnærming. Figuren er endret fra Boin et al. 20172. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant resultatene fra feil eksempel separasjon og galt antistoff titrering. (A) feil titrering av CD4 antistoff resulterer i dårlig oppløsning mellom CD4+ og CD8+ bestander. (B) dårlig CD56 titrering kan føre til en dårlig separasjon av NK fra B-celler. (C) effekten av RBC ufullstendig lysis på subpopulasjoner diskriminering. (D) eksempel på bruk av andre markører bekrefte nøyaktige avstanden mellom B celler og celler NK: B-celler er HLA-DR og CCR6 dobbel positive, mens Celler NK er dobbel negative. Panelet D er endret fra Boin et al. 20172. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Gating strategi for å analysere prøver fra en pasient med myelom. (A) lymfocytter ble port på grunnlag av deres FSC-A og SSC-området og deres flyt cytometric profil med den to-fluorochrome immun-celle flekker vises. (B) separasjon av NK og B-cellene med CCR6 og HLA-DR. (C) Gating strategi for å identifisere CD8+ minne og naiv T-celler. (D) uttrykk av HLA-DR og CD57 i CD8+ naiv og minne T-celler. (E) Gating strategi for å identifisere CD4+ minne og naiv T-celler. (F) HLA-DR og CD57 uttrykk i CD4+ naiv og minne T-celler. (G) identifikasjon av Th9 CD4+ T celler (H) identifikasjon av Thelper CD4+ T celle subpopulasjoner (jeg) CD16 og CD57 uttrykk i NK celler. Figuren har blitt tilpasset fra Boin et al. 20172. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: dynamikken i celle befolkningen pasienter med multippel myelom. (A) dynamisk til store lymfocytt befolkningen i PBMC isolert og cryopreserved på den angitte dagen etter stilk cellen transplantasjon (SCT). (B) karakterisering av CD8 subpopulasjoner over tid. (C) karakterisering av CD4 subpopulasjoner over tid. (D) analyse av NK delsett. Dataene har blitt tegnet inn med GraphPad prisme. Figuren har blitt tilpasset fra Boin et al. 20172. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Mål | Klone | Fluorochrome | Leverandør | Konsentrasjon | Formål |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/20 | Avstamning |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | Bio | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Døde celler | L/D blå | LT | 1/300 | Live/Dead diskriminering | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | |||||
Tabell 1: Antistoffer panelet brukes for den to-fluorochrome immun-celle flekker av PBMC (BV421-PE kombinasjon).
| Mål | Klone | Fluorochrome | Leverandør | Konsentrasjon | Formål |
| CD3 | UCHT1 | APC | BD | 1/20 | Avstamning |
| CD56 | NCAM16.2 | APC | BD | 1/60 | |
| TCRΓΔ | B1 | APC | Bio | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Døde celler | L/D blå | LT | 1/300 | Live/Dead diskriminering | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | |||||
Tabell 2: Antistoff panel brukes for den to-fluorochrome immun-celle flekker av PBMC (APC-PE kombinasjon).
| Mål | Klone | Fluorochrome | Katalogen | Leverandør | Konsentrasjon | Formål |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | 562426 | BD | 1/20 | Avstamning |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | 562751 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | 331217 | Bio | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | 555347 | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | 555367 | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | 555398 | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | 555413 | BD | 1/300 | |
| CCR7 | G043H7 | AF647 | 353217 | Bio | 1/30 | Differensiering |
| CD45RA | HI100 | APC-H7 | 560674 | BD | 1/60 | |
| CCR4 | 1G 1 | PE-Cy7 | 561034 | BD | 1/60 | Th delsett |
| CCR6 | G034-E3 | BV605 | 353419 | Bio | 1/30 | |
| CXCR3 | 1C 6/CXCR3 | AF488 | 561730 | BD | 1/30 | |
| CD57 | NK-1 | PE-CF594 | 562488 | BD | 1/900 | Aktivisering/utmattelse |
| HLA-DR | G46-6 | BV510 | 563083 | BD | 1/30 | |
| CD16 | 3 G-8 | BUV395 | 563784 | BD | 1/30 | NK, Monocyte aktivisering |
| Døde celler | L/D blå | L-23105 | LT | 1/300 | Live/Dead diskriminering | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | ||||||
Tabell 3: Antistoff panelet brukes stain frosset PBMC fra en pasient med myelom.
| Mål | Klone | Fluorochrome | Leverandør | Konsentrasjon | Formål |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/80 | Avstamning |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/400 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | Bio | 1/200 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/1200 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/100 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/80 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Døde celler | L/D blå | LT | 1/300 | Live/Dead diskriminering | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | |||||
Tabell 4: Antistoff panel brukes for den to-fluorochrome immun-celle flekker av fullblod (BV421-PE kombinasjon).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen presenteres her har vist seg å være ganske fleksibel og ufølsom for endringer i flekker buffer, temperatur og eksterne blodlegemer forberedelse på grunn av høy uttrykk for lineage markører på cellens overflate. Det viktigste trinnet for å få høy kvalitet og reproduserbar data er antistoff titrering. Av notatet, siden Serine antistoffer skal alltid utføres under installasjonen av en flyt cytometric panel, legge dette trinnet ikke ekstra benk-tid til våre to-fluorochrome tilnærming. Titrering av anti-CD3,-CD8,-CD14, - CD19 og -TCR γδ følger standard prosedyre som konsentrasjonen av antistoff optimalt skille positive og negative topper er avledet av maksimalt flekker indeks13,14. Fortynninger topp eller nærmere toppen på stigende side av flekken indeks kurven bør være valgt (figur 1A-C). På den annen side, må en ad hoc titrering av anti-CD4 og anti-CD56 antistoffer utføres. Anti-CD4 antistoffer titreres for å plassere toppen av befolkningen CD4 positiv mellom CD3 enkelt positiv befolkninger og CD3+/CD8+ T celler, nærmere på CD3 enkelt positive signalet å bedre diskriminere CD8svak populasjoner ( CD8+ γδ T celler og NK T celler). Langs samme linje, CD56 titrering mål posisjon NK CD56+ celler mellom CD3+ og CD3 befolkningen. Naturlig nedre uttrykk for CD56 gjør Serine denne antistoffer enklere med konsentrasjon bruke nær verdien i en metning kurve. Bruke høy quantum avkastning fluorochromes er en kritisk faktor for en optimal separasjon av flere markører/bestander på samme detektoren. Vi anskaffet vellykkede resultater med APC, BV421 og PE, men andre fluorochromes, for eksempel den nye generasjonen av polymer fargestoff, bør gi sammenlignbare resultater. For å redusere muligheten for gjenstander på grunn av kompensasjon, er det også viktig å velge et par fluorochromes med lite, om noen, spectral overlapping, som PE og APC, eller PE og BV421. Velge par fluorochromes med nesten ingen kompensasjon er viktig å redusere spredningen av data på grunn av høy ringvirkninger av en fluorochrome på andre fluorochrome detektoren. Spre reduksjon forenkler gating immun subpopulasjoner ved å minimere signalforvrengning og lar deg bruke denne metoden, hvis begrenset til to fluorochromes, uten behov for kompensasjon kontroller.
Kombinasjonen av indikatorer som vi foreslått er tilpasses basert på kravene etterforsker. Faktisk kan noen av markører ekskluderes fra analysen hvis de ikke refererer til en befolkning på rundt. For eksempel er det mulig å fjerne anti-CD19 antistoffer utelate B celler eller anti-CD4 antistoffer å fokusere bare på CD8+ T celler. Av notatet, anti-CD8 antistoff er viktig å identifisere CD8+ NK celler og γδ T celler, og derfor bør ikke fjernes fra panelet. For å forbedre separasjon av sjeldne celle populasjoner, kan andre fluorochromes/detektorer brukes for noen av markørene for den to-fluorochrome flekker. Som et eksempel, kan CD56 flyttes til en annen detektor å oppdage NKT celler, som er ikke mulig med to-fluorochrome panel. Mens det er mulig å redusere antall indikatorer fra panelet, bør forsiktighet bli hatt i å legge til, endre eller bytte markører.
Forutsatt nødvendig instrumentering, antistoffer og ferdigheter sett, standard en fluorochrome en markør tilnærmingen er fortsatt den mest nøyaktige måten å identifisere flere immun bestander og diskriminere sjeldne subpopulasjoner, som NKT eller γδ T-celler. Hovedmålet med denne metoden er imidlertid ikke å erstatte den klassiske tilnærmingen, men heller å oppnå en dyp immunophenotyping når du arbeider med instrumenter med et lavt antall detektorer, eller prøver med begrenset antall celler, samtidig redusere kompleksitet og i eksperimentell systemet. Vi har gjort omfattende screening av klinisk prøver fra pasienter med multippel myelom, systemisk sklerose, dermatomyositis og Lyme sykdom viser at denne flekker prosedyren kan forbedre samtidige avhør av flere populasjoner med begrenset antall celler. Resultatene har så langt vist at denne prosedyren er ufølsom for kronisk immun aktivisering eller smittsomme sykdommer, men innledende tester skal utføres for å vurdere riktigheten av denne protokollen i forskjellige sykdomstilstander.
Fremtidige retninger å styrke potensialet i denne protokollen inkludere studier for å karakterisere infiltrere lymfocytter i primære vev fra klinisk prøver. Dette er relevant for svulst og autoimmune sykdommer immunologi hvor denne tilnærmingen kan gi uvurderlig informasjon for analyse av prøver med begrenset materiale. Vi planlegger å teste dette panelet på permeabilized celler å utvide potensialet for å oppdage cytokin uttrykk og signalnettverk molekyler på samme kliniske prøvene. Til slutt, bør det bemerkes at lignende tilnærminger, som tar sikte på å utvide antall skrivbar markører, kan også bli utviklet med ulike sett av indikatorer og kan også være utviklet fordifferent dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av nasjonalt Institutt for Arthritis Musculoskeletal og hudsykdommer, < https://www.niams.nih.gov/>, prisen nummer P30-AR053503; Stabler stiftelsen, www.stablerfoundation.org; National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina Irland Program for lunge helse (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler's guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
- Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12 (11), (2017).
- Zola, H., et al. Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , Wiley. (2007).
- Lambert, C., Genin, C. CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).
- Ginaldi, L., et al. Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).
- Park, J., Han, K. Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome. Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).
- Mansour, I., et al. Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two. Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).
- Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes. Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).
- Van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).
- Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).
- Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 49, Blackwell Science. (1997).
- Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis. Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).
- Maecker, H. T., et al. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A. , (2004).
- Noonan, K. A., et al. Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma. Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).
- Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells. Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).
- Bonecchi, R., et al. Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s. The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).
- Rivino, L., et al. Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).
- Ye, Z. -J., et al. Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. PloS One. 7 (2), e31710 (2012).
- Speiser, D. E., et al. Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells. European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).
- Caruso, A., et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).
- Brenchley, J. M., et al. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).
- Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction. The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).
- Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).
