Summary
Aquí, presentamos un protocolo de citometría de flujo para identificar CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos en sangre periférica mediante sólo dos fluorocromos en lugar de siete. Con este enfoque, se pueden grabar cinco marcadores adicionales en la mayoría los citómetros de flujo.
Abstract
Caracterización de células inmunitarias se basa pesadamente multicolor por citometría de flujo para identificar subpoblaciones basadas en la expresión diferencial de marcadores de superficie. Instalación de un panel multicolor clásico requiere instrumentos High-End, anticuerpos etiquetados personalizados y cuidadoso estudio diseño para minimizar la superposición espectral. Hemos desarrollado un análisis multiparamétrico para identificar las poblaciones inmunes humanas principales (CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos) en sangre periférica mediante la combinación de siete marcadores de linaje utilizando sólo dos fluorocromos. Nuestra estrategia se basa en la observación que los marcadores de linaje se expresan constantemente en una combinación única por cada población celular. Combinando esta información con una cuidadosa titulación de los anticuerpos permite a los investigadores grabar cinco marcadores adicionales, ampliando el límite óptico de la mayoría los citómetros de flujo. Comparación directa demostró que la gran mayoría de las poblaciones de células inmunitarias en la sangre periférica puede ser caracterizada con precisión comparable entre nuestro método y el "un marcador fluorocromo y un enfoque clásico", aunque este último sigue siendo más precisos para la identificación de las poblaciones, como las células NKT y células de T del γδ. La combinación de siete marcadores con dos fluorocromos permite el análisis de poblaciones celulares inmunes complejos y muestras clínicas en citómetros de flujo fluorocromo asequible 6-10 e incluso en 2-3 instrumentos de campo de fluorocromo en áreas con recursos limitados. Instrumentos de alta gama también pueden beneficiarse de este enfoque mediante el uso de fluorocromos extras para llevar a cabo análisis de citometría de flujo más profundo. Este enfoque es también muy adecuado para la detección de varias poblaciones de la célula en el caso de muestras clínicas con un número limitado de células.
Introduction
Citometría de flujo es una técnica que fue desarrollada para analizar varios parámetros en solas partículas a una velocidad de varios miles de sucesos por segundo1. Ejemplos de muestras analizadas por citometría de flujo incluyen, pero no se limitan a, las células, los granos, bacterias, vesículas y cromosomas. Un sistema fluídico dirige las partículas en el punto de interrogación donde cada partícula cruza su camino con uno o más láseres, y varios parámetros son grabados para su posterior análisis. Scatter delantero y lateral, generado por la dispersión de la luz láser puro, se utiliza para identificar la población objetivo y recuperar información sobre el tamaño relativo y la complejidad interna/granularidad de las partículas, respectivamente. Todos los otros parámetros, que representan la mayor parte de los datos en un análisis de citometría de flujo, se derivan por sondas marcadas con el fluorocromo que reconocen y se unen a objetivos específicos en las partículas de interés.
Citometría de flujo es una herramienta primaria para estudios inmunológicos identificar y caracterizar poblaciones celulares. Para diseccionar la complejidad del sistema inmune, paneles multicoloras evolucionan constantemente para ampliar el número de marcadores simultáneamente grabada para profunda Inmunofenotipificación de poblaciones de células1. Esto conduce al desarrollo de los instrumentos más capaces y fluorocromos, con citómetros de flujo gama alta reciente superior a 20 parámetros fluorescentes. El resultado en el diseño de estudio complejo debido a la superposición espectral fluorocromo y en costes más altos asociados con encargo anticuerpo etiquetado y calificados operadores. En varios casos, complejidad y los costes se reducen mediante el uso de distintos paneles de marcadores de diferentes poblaciones celulares. Este enfoque, sin embargo, es propenso a errores, reduce la información en cada panel y puede ser difícil de aplicar a las muestras con número limitado de células. Por otra parte, aumentar el número de marcadores excluye immunophenotyping profunda en los instrumentos con menos parámetros fluorescentes. Previamente hemos desarrollado un protocolo de tinción para identificar las poblaciones inmunes humanas principales (CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos) en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediante la combinación de siete marcadores de linaje mediante sólo dos fluorocromos en lugar de los siete necesarios usando el tradicional "un marcador fluorocromo y un" enfoque (www.hcdm.org)2,3. Nuestro informe inicial había explorado y había validado la noción de combinar siete marcadores de dos fluorocromos de immunophenotyping profundo. En este informe, presentamos un protocolo paso a paso para aislar y la tinción de células sanguíneas periféricas, centrándose en el aspecto práctico y solución de problemas de pasos para lograr una acertada coloración.
Este protocolo se basa en la observación que marcadores de linaje tienen una expresión constante en la superficie celular y que cada población celular tiene una exclusiva combinación de marcadores de linaje. En PBMCs, expresión de CD3 subdivide las células inmunes en dos categorías principales: los linfocitos T CD3-positive y células CD3 negativas. Dentro del subgrupo positivo de CD3, CD4+, CD8+ y las células de T del γδ se pueden separar utilizando anticuerpos dirigidos exclusivamente a CD4, CD8 y el receptor γδ. De manera similar, dentro del subgrupo negativo CD3, las células B, células NK y monocitos pueden identificarse unívocamente usando los anticuerpos contra CD19, CD56 y CD14, respectivamente. En un enfoque de un fluorocromo marcador uno estándar, anti-CD3-CD4,-CD8, CD14,-CD19, CD56 y - TCR γδ los anticuerpos se detectan con siete diferentes fluorocromos. Nuestro enfoque combina anti-CD3, CD56 y - TCR γδ anticuerpos en un fluorocromo (designada para el fluorocromo de conveniencia A) y anti-CD4,-CD8, CD14 y - CD19 anticuerpos en un fluorocromo diferente (fluorocromo B). Esto es posible por una combinación de valoración de anticuerpos y antígeno diferencial expresión. Ambos CD4+ y CD8+ T las células son positivas para el anticuerpo anti-CD3 en fluorocromo A, pero se pueden separar en fluorocromo B maximizar la expresión de la señal de CD8 colocando con una titulación especial, la señal de CD4 entre el CD8 y las células de CD3 positivo-CD4/CD8 dobles negativas. Las células de T del γδ expresa mayor nivel de CD3, CD4 y CD8, y por lo tanto pueden ser identificados como CD3 alto4. Esta señal es impulsada más por etiquetado γδ células de T en fluorocromo A con un anti-TCR γδ los anticuerpos, mejorando la separación entre células T baja de CD3 y células Tγδ alta T de CD3. Las células de B pueden identificarse como CD3– en el fluorocromo A y CD19+ en fluorocromo B. Para separar las células NK negativo CD3 de células B, fue utilizado un anticuerpo anti-CD56 en fluorocromo A como anti-CD3. Esto es posible porque expresa CD56 de células NK en un nivel mucho más bajo que el CD3 en células T5. Finalmente, los monocitos pueden ser identificados mediante una combinación de propiedades de dispersión hacia delante-lateral y expresión de CD14 en fluorocromo B.
La idea de combinar hasta cuatro marcadores con dos fluorocromos se ha intentado con éxito antes de6,7,8y se ha utilizado en un protocolo clínico para identificar poblaciones linfocíticas malignas9 . Un informe anterior también combinado siete marcadores (con diferente especificidad de los marcadores que utilizamos en nuestro protocolo) usando dos fluorocromos, pero ello dependía de un complejo etiquetado de cada anticuerpo con diferente cantidad de fluorocromo10. Esto está en contraste con el método que utiliza anticuerpos comercialmente disponibles y puede ser adaptado a la configuración del equipo y puede tomar ventaja de la nueva generación de fluorocromos de polímero.
El objetivo general de esta metodología es ampliar los límites ópticos de mayoría citómetros de flujo, permitiendo la grabación de cinco marcadores adicionales para interrogar a las poblaciones de la célula compleja. Como consecuencia, análisis inmunológicos avanzado pueden realizarse en citómetros de flujo fluorocromo asequible 6-10 y 2-3 instrumentos de campo de fluorocromo pueden lograr resultados notables en áreas con recursos limitados. Instrumentos de alta gama también pueden beneficiarse de este enfoque mediante el uso de fluorocromos extras para llevar a cabo análisis de citometría de flujo más profundo y crear flujo modular cytometric paneles dirigidos a varios linajes en el mismo tiempo11. Esto puede potencialmente reducir el número de paneles utilizados en citometría de flujo immunophenotyping modular y reducir los costos, errores y tiempo de manipulación. Este enfoque es también muy adecuado en el caso de muestras clínicas con un número limitado de células.
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Protocol
Todos los estudios de materiales humanos fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de Johns Hopkins bajo la Health Insurance Portability y Accountability Act. Muestras de paciente y control fueron anónima. PBMCs y sangre de controles sanos se obtuvieron mediante consentimiento informado.
Nota: Este protocolo ha sido probado en recién o congeladas aisladas células de sangre periféricas y sangre entera.
1. preparación de la célula
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Aislamiento de células de sangre periféricas (PBMC) de sangre entera
- Extraer la sangre en un tubo de tapa verde 10 mL que contiene heparina sódica. Después de que el tubo se ha llenado de sangre, inmediatamente para invertir el tubo varias veces para prevenir la coagulación.
Nota: Tubos con otros anticoagulantes como el ácido etilendiaminotetracético (EDTA) o citrato de sodio pueden ser utilizados con resultados comparables. Si se recoge una cantidad diferente de la sangre, los siguientes pasos en el protocolo deben adaptarse en consecuencia. - Cuidadosamente transfiera sangre dibujada en un tubo cónico de 50 mL. Diluir la sangre con la misma cantidad de tampón fosfato salino (PBS) sin calcio y magnesio.
- Añadir 15 mL de medio de gradiente de densidad (por ejemplo, Ficoll) a la parte inferior de un tubo cónico de 50 mL nuevo y cuidadosamente recubierto la sangre diluida en la parte superior medio de gradiente de densidad, evitando cualquier mezcla entre el medio de gradiente de densidad y la sangre diluida.
Nota: Este es un paso fundamental para una adecuada separación de PBMCs de glóbulos rojos. - Centrifugar a 400 x g durante 30 min a temperatura ambiente (RT), con ningún freno para evitar la interrupción de la interfaz.
- Después de la centrifugación, cuidadosamente aspirar la capa superior con una pipeta y descartarlo, prestando atención para no eliminar las células en la interfase entre el plasma y densidad gradiente medio, que es donde PBMCs laminadas. Recoger tantas células como sea posible desde la interfaz sin tocar el sedimento de glóbulos rojos en la parte inferior del tubo cónico de 50 mL y transferencia a un nuevo tubo cónico de 50 mL.
- Añadir PBS para llevar el volumen final de 25 mL e invertir varias veces para mezclar. Centrifugar a 300 x g por 10 min a temperatura ambiente con el freno en para eliminar cualquier contaminación medio gradiente de densidad de la suspensión de células.
- Cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin inquietante el sedimento celulares. Añadir PBS para llevar el volumen final de 25 mL e invertir varias veces para mezclar. Centrifugue a 200 x g durante 10 min a temperatura ambiente con el freno a quitar las plaquetas.
- Cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares. Resuspender PBMCs en 1 mL de PBS/0.1% de azida de sodio. Azida sódica reduce tapado, vertimiento, internalización de los anticuerpos y aumento de la recuperación de la célula, pero su toxicidad puede afectar la viabilidad celular. Por esta razón, azida de sodio se debe evitar en todos los pasos si las células se cultivan para experimentos posteriores. Aislamiento de células y tinción sin azida de sodio dieron resultados similares a la coloración realizada en presencia de azida sódica.
PRECAUCIÓN: Azida de sodio puede causar la muerte al afectar el sistema nervioso central. Contacto puede causar quemaduras en la piel y los ojos. - Diluir las células para contar mediante la transferencia de 30 μl de PBMCs en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Luego agregar 120 μl de PBS y 150 μL de azul tripán para determinar el numero de celular y viabilidad (dilución 1:10 de la célula). Resuspender cuidadosamente.
- Transferir 10 μL en un hemocitómetro, conteo de las células por consiguiente a la cuenta usada cámara y determinan el número de células viables. Células viables = número de Trypan azul negativo células total x 10 (el factor de dilución utilizado en este protocolo) x 104.
Nota: En promedio, 7-15 x 106 de PBMCs deben ser recogidos en 10 mL de sangre. - Resuspender las células en 10 x 106 / mL de PBS/0.1% de azida de sodio
Nota: PBMC puede ser congelado y almacenado en nitrógeno líquido durante un período prolongado de tiempo. Sin embargo, la expresión de marcadores como receptores del chemokine puede modificarse por este procedimiento.
- Extraer la sangre en un tubo de tapa verde 10 mL que contiene heparina sódica. Después de que el tubo se ha llenado de sangre, inmediatamente para invertir el tubo varias veces para prevenir la coagulación.
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Preparación de células de PBMC congelado
Nota: diversos procedimientos de congelación pueden afectar la recuperación y la viabilidad de la célula12. PBMCs de estos experimentos fueron congelados en especialmente formulados congelación medios o suero bovino fetal (FBS)/10% dimetil sulfóxido (DMSO) con resultados similares.
PRECAUCIÓN: DMSO puede ser ligeramente peligroso en caso de inhalación (irritante del pulmón), contacto (irritativa, permeator), de contacto con los ojos (irritante), de la ingestión de la piel.- Quitar congelado PBMC de nitrógeno líquido y coloque en hielo. Transferir el cryovial de hielo directamente en el baño de agua de 37 ° C. Mantener la cryovial en la superficie del agua y agítelo suavemente los frascos hasta que queden de un pellets de hielo. Transferencia de la cryovial en el hielo.
- Quite el agua con un trapo rociado de etanol 70%. Lentamente agregar 1 mL de PBS/0.1% de azida de sodio a 4 ° C y transferir cuidadosamente el celular a un tubo cónico de 15 mL. Lentamente añadir azida de sodio PBS/0.1% frío a 4 ° C hasta un volumen final de 15 mL.
- Centrifugar a 300 x g durante 10 minutos Retire con cuidado el sobrenadante, resuspender las células en 1 mL de PBS/0.1% de azida de sodio.
Nota: Las células también pueden ser suspendidas en RPMI 10% FBS con resultados similares. - Diluir el celular para contar mediante la transferencia de 30 μl de PBMCs en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Luego agregar 120 μl de PBS y 150 μL de azul tripán para determinar el numero de celular y viabilidad (dilución 1:10 de la célula). Resuspender cuidadosamente.
- Transferir 10 μL en un hemocitómetro, conteo de las células por consiguiente a la cuenta usada cámara y determinan el número de células viables. Células viables = número de Trypan azul negativo células total x 10 (el factor de dilución utilizado en este protocolo) x 104.
- Resuspender las células en 10 x 106 / mL en PBS/0.1% de azida de sodio.
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Preparación de las células de la sangre entera
- Extraer la sangre en un tubo de tapa verde 10 mL que contiene heparina sódica. Después de que el tubo se ha llenado de sangre, inmediatamente para invertir el tubo varias veces para prevenir la coagulación.
Nota: Tubos con otros anticoagulantes como EDTA o citrato de sodio puede ser utilizado con resultados comparables. Si se recoge una cantidad diferente de la sangre, los siguientes pasos en el protocolo deben adaptarse en consecuencia. - Transfiera 200 μL de sangre entera a un tubo de 12 x 75 mm tope, añadir 2 μl de azida de sodio y agitar suavemente durante 2 s.
- Extraer la sangre en un tubo de tapa verde 10 mL que contiene heparina sódica. Después de que el tubo se ha llenado de sangre, inmediatamente para invertir el tubo varias veces para prevenir la coagulación.
2. células de tinción
Nota: Elegir pares de fluorocromos con solapamiento espectral prácticamente no es importante para reducir la propagación de datos debido a la alta derrame de un fluorocromo en el otro detector de fluorocromo. Para lograr una identificación óptima de todos los subconjuntos de la célula, fluorocromos con un rendimiento de alto cuántico puede usarse como anticuerpo pares PE-BV421 y PE-APC.
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Tinción de PBMC fresco y congelado
- Transferir 100 μl de PBMC (1 x 106 células) a una placa de 96 pocillos fondo V.
Nota: Puede utilizarse cualquier número menor que 1 x 106 células con similares resultados2. - Centrifugue a 350 x g durante 3 min a temperatura ambiente y cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares. Añadir a cada pozo 100 μl de PBS con un tinte live/dead fijable que reacciona con la amina libre de proteínas durante 10 min a las células muertas de la etiqueta.
- Preparar para cada muestra 30 μl de una mezcla que contiene todos los anticuerpos (anti-CD3.-CD56, TCRγδ en fluorchrome A y anti-CD4, CD8, CD19, CD14 en fluorchrome B). Concentración de anticuerpos se indican en el cuadro 1 y cuadro 2. En esta etapa, titulados anticuerpos contra moléculas diferentes y en diferentes fluorocromos se pueden agregar así (p. ej., tabla 3).
Nota: Concentración de anticuerpos puede variar dependiendo del fabricante y número de lote. Por lo tanto, las pruebas preliminares deben hacerse para lograr la óptima de la señal. PBS, PBS/0.5% BSA, azida de sodio PBS/0.2% o PBS/0.5% BSA/0.1% de azida de sodio se utilizaron con resultados similares para diluir anticuerpos2. Celular también puede ser teñido en volúmenes diferentes de 30 μL integrar fácilmente esta metodología ya existentes protocolos de tinción. - Centrifugue a 350 x g durante 3 min a temperatura ambiente y cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares. Añadir el cóctel de anticuerpos a cada pocillo y resuspender cuidadosamente sin generar burbujas. Incubar por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
Nota: Es posible teñir las muestras a 4 ° C con resultados similares. - Añadir 150 μL de tampón de tinción y centrifugue a 350 x g durante 3 min a temperatura ambiente y cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares. Resuspender las células en 200 μL de PBS y adquirir datos en un citómetro de flujo. Si se cambian los volúmenes de tinción, asegúrese de que al menos una dilución de 20-fold de la mezcla original de anticuerpo utilizada para lavar el exceso de anticuerpos.
Nota: Células pueden fijo con en PBS/2% paraformaldehido, guardadas en un refrigerador a 4 ° C durante la noche y luego adquiridas en un citómetro de flujo al día siguiente.
PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es dañino si es ingerido y puede causar irritación de la piel
- Transferir 100 μl de PBMC (1 x 106 células) a una placa de 96 pocillos fondo V.
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Manchas de sangre
- Añadir a cada tubo de 12 x 75 mm tope, el cóctel de anticuerpos (anti-CD3.-CD56, TCRγδ fluorocromo A, y anti-CD4, CD8, CD19, CD14 en fluorocromo B) e incubar a temperatura ambiente por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Concentración de anticuerpos se indican en la tabla 4. En esta etapa, contiene anticuerpos contra moléculas diferentes y en diferentes fluorocromos pueden añadirse también. Concentración de anticuerpo puede variar dependiendo del fabricante y número de lote. Por lo tanto, las pruebas preliminares deben hacerse para lograr la óptima de la señal.
Nota: Es posible teñir las muestras a 4 ° C con resultados similares. - Centrifugue a 350 x g durante 3 min a temperatura ambiente y cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares. Hacer una solución de 1 x del buffer de lisis de glóbulos rojos siguiendo las instrucciones del fabricante.
Nota: La solución de lisis debe ser a temperatura ambiente antes de usar. - Añadir 2,0 mL de 1 x de tampón de lisis de eritrocitos a cada tubo, tapa bien e invertir varias veces para mezclar. Cubrir con papel aluminio y dejar reposar durante 15 minutos.
- Desactivación a 300 x g por 5 minutos cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares.
- Añadir 2 mL de PBS y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
Nota: en este punto, el precipitado de células debe tener una coloración blanco pálida indicando una lisis de eritrocitos exitoso. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante para no perturbar el sedimento celulares y resuspender suavemente las células en 200 μL de PBS. - Colar las células a través de tubos de 12 x 75 mm con tapas de filtro de 40 μm para remover agregados de células y adquirir datos en un citómetro de flujo.
- Añadir a cada tubo de 12 x 75 mm tope, el cóctel de anticuerpos (anti-CD3.-CD56, TCRγδ fluorocromo A, y anti-CD4, CD8, CD19, CD14 en fluorocromo B) e incubar a temperatura ambiente por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Concentración de anticuerpos se indican en la tabla 4. En esta etapa, contiene anticuerpos contra moléculas diferentes y en diferentes fluorocromos pueden añadirse también. Concentración de anticuerpo puede variar dependiendo del fabricante y número de lote. Por lo tanto, las pruebas preliminares deben hacerse para lograr la óptima de la señal.
3. titulación de anticuerpos
Nota: Titulación de anticuerpos es el paso más crítico para la obtención de datos de alta calidad, reproducibles. La titulación de anti-CD3-CD8,-CD14, CD19 y - TCR γδ sigue el procedimiento estándar por el cual la concentración de anticuerpos óptimo separar picos positivos y negativos se deriva de máxima tinción índice13,14. Diluciones en el pico o cerca del pico en el lado ascendente de la curva de índice de mancha deben ser seleccionada (Figura 1A-C). El anticuerpo anti-CD4 se titula para colocar el pico de la población positivo CD4 entre poblaciones positivo solo CD3 y CD3 + / CD8 + T células, más cerca a la señal positiva solo CD3 para discriminar mejor las poblaciones de CD8dim (células T NK y CD8 + células de T del γδ). En la misma línea, las células CD56 titulación pretende posición NK CD56+ entre el CD3+ y el CD3– población.
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Curva de índice máximo de la mancha
Nota: la titulación de anti-CD3-CD8,-CD14, CD19 y - TCR γδ sigue el procedimiento estándar por el cual la concentración de anticuerpos óptimo separar picos positivos y negativos se deriva tinción índice curva15como máximo. Si se añaden anticuerpos contra otros marcadores en el panel, también deba titularse con una máxima curva de índice tinción.- Preparar una dilución del anticuerpo 2 veces llenando 10 pocillos de una placa de 96 pocillos con 40 μl de tampón de tinción. En el primer pozo, aumentar el volumen final a 80 μl de tampón de tinción y añadir el anticuerpo de interés en una concentración 4 veces la concentración sugerida por el fabricante.
- Mezcle bien y transfiera 40 μl al segundo pocillo. Mezcla bien y repita este paso para los todos los otros pozos.
- Mancha de 10 muestras de sangre entera o de PBMC con 30 μl de las diluciones de 2 dobleces diferentes 10 de anticuerpos siguiendo el protocolo descrito antes.
- Adquirir datos con un citómetro de flujo y la trama de la señal de cada dilución (figura 1A).
- Puerta en las poblaciones de positivas y negativas para cada concentración de anticuerpo. Aumento de la concentración de anticuerpos puede conducir a un mayor fondo. Por lo tanto, cambiar el tamaño de la puerta negativa en consecuencia.
- Para cada concentración de anticuerpo, extraer información de la mediana y la desviación estándar para la intensidad fluorescente de la población negativa y la mediana de la intensidad fluorescente de la población positivo. Calcular para cada concentración de anticuerpo el índice de la mancha con esta fórmula: (mediana intensidad fluorescente de la población positiva: mediana intensidad fluorescente de la población negativa) ÷ (2 x desviación estándar de la intensidad fluorescente de la negativo de población) (figura 1B).
- Parcela las mancha índice vs. la concentración de anticuerpo expresada como fracción de la dilución del anticuerpo (por ejemplo, 1:10 dilución = 0.1) y determinar la concentración de anticuerpo con el valor del índice máximo de la mancha (figura 1).
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Titulación de anticuerpo anti-CD4 y - CD56
Nota: titulación de anticuerpos Anti-CD4 y - CD56 basa en la titulación anterior los otros marcadores en el panel de dos fluorocromo. Para el anticuerpo anti-CD4 la titulación tiene como objetivo colocar el anti-CD4 de señal entre el CD8 doble+/CD3+ señal y el CD3 solo población positiva (figura 1).- Valorar el anti-CD4 y CD56 anticuerpos con una estrategia de dilución 2 veces como descrito antes, añadiendo concentraciones adicionales en medio para finalmente identificar el rango de concentración que permiten separar CD4+ T las células y las células NK de la otra célula poblaciones.
- Valorar el anticuerpo anti-CD4 colocando la señal anti-CD4 entre CD8 doble+/CD3+ señal y el CD3 solo población positiva (figura 1).
Nota: Cuidado especial se debe hacer para separar claramente CD4+ T células de CD8+ dim poblaciones. - Valorar el anticuerpo anti-CD56 siguiendo una estrategia similar a la valoración de anticuerpos anti-CD4, colocando las células NK entre el CD3 negativo y las poblaciones de CD3-positive.
4. estrategia de control
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Identificar poblaciones de la célula monocítica y linfocítica y eliminar las células muertas y la mayoría de los eritrocitos residuales del análisis.
- Seleccionar toda la población que contiene linfocitos y monocitos basadas en el área de dispersión hacia adelante vs lado (FSC-A vs SSC-A). Remover agregados de células desde el análisis a través de dispersión hacia adelante vs scatter delantero ancho (FSC-H vs FSC-W) y lado dispersión vs lado dispersión ancho (SSC-H vs SSC-W).
- Use un marcador vivo o muertos discriminación excluir brillantes positivo células muertas y glóbulos rojos residuales del análisis. Puerta en linfocitos y monocitos basados en los diferentes perfiles A de FSC y SSC-A.
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Dos fluorocromo marcador siete estrategia bloquea de la población linfocítica.
Nota: en el subgrupo positivo de CD3, CD4+, CD8+ y las células de T del γδ se pueden separar utilizando anticuerpos dirigidos exclusivamente a CD4, CD8 y el receptor γδ. De manera similar, dentro del subgrupo negativo CD3, las células B, células NK y monocitos pueden identificarse unívocamente usando los anticuerpos contra CD19, CD56 y CD14, respectivamente.- Seleccione la puerta de linfocito y crear una trama de punto con en cada eje de dos fluorocromos utilizados en este protocolo (figura 2B).
- Puerta en CD8+ T células identificadas como CD3+/CD8+ dobles células positivas en la esquina superior derecha de la trama de puntos (figura 2B). Excluir la población CD8 dim que podría contener las células NKT. Puerta en CD4+ T células identificadas como población entre CD8+ T las células y el CD3 solo poblaciones positivo. Puerta en las células de T del γδ identificado como células CD3 alta. Subdividen a las células de T del γδ en CD8 positivo y CD8 negativo.
- Puerta de las células NK identificadas como la población entre CD3-positive y células CD3 negativas. Subdividen a las células NK CD8 positivo y CD8 negativo. Puerta en las células de B identificado como CD19 CD3 negativo+ población en la esquina derecha inferior de la trama de punto.
- Seleccionar las puertas de monocito y crear una trama de punto con en cada eje de dos fluorocromos utilizados en este protocolo (figura 2). Puerta en el CD3–/CD14+ población.
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Representative Results
Configuración y análisis de un experimento de citometría de flujo de células humanas de sangre periféricas teñidas con siete marcadores de linaje (anti-CD3-CD4,-CD8, CD14,-anticuerpos de CD19, CD56 y - TCR γδ) usando sólo dos fluorocromos se presentan.
Se describen resultados representativos para anti-CD8 y - CD56 titulación de anticuerpos. Para cada anticuerpo (en este ejemplo, anti-CD8), se registraron datos de diez diluciones 2 veces sucesivas para calcular una curva de índice de tinción (Figura 1A-C). Concentración óptima del anticuerpo fue determinada por la mancha máximo índice señal13,14. Deben seleccionarse las diluciones en el pico o cerca del pico en el lado ascendente de la curva de índice de la mancha. Anti-CD4 y - CD56 anticuerpos se titulan mediante tinción de células sanguíneas periféricas junto con los otros marcadores en el panel de dos fluorocromo (previamente graduado). Para el anticuerpo anti-CD4, la valoración debería tender a colocar la señal anti-CD4 entre CD8 doble+/CD3+ señal y el CD3 solo población positiva (figura 1). Cuidado especial se debe hacer para separar claramente CD4+ T células de CD8+ dim poblaciones. PBMCs fueron manchados con la concentración óptima de los marcadores indicados y diferentes concentraciones de anti-CD4. Código de las concentraciones de color: verde indica que las concentraciones que resultan en una separación óptima de CD4+ T de las células de los otros CD3+las poblaciones; naranja indica concentraciones que resulten en una separación aceptable pero no ideal; rojo indica que las concentraciones que resultan en pobre separación de CD4+ T células de dim células CD8 o CD4/CD8 negativo doble poblaciones. La titulación de anti-CD56 se hizo de una manera similar como el anticuerpo anti-CD4, colocando las células NK entre el CD3 negativos–y las poblaciones de CD3-positive.
Representante de gating estrategia muestra cómo identificar poblaciones celulares monocítica y linfocítica y retire las células muertas del análisis y la mayoría de los glóbulos rojos residuales (figura 2A). El posterior análisis se basó en esta estrategia bloquea. Representante de gating estrategia se utiliza para identificar CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos en la tinción de fluorocromo y siete marcador dos (figura 2B-C).
Representante resultados negativos son derivados de la inadecuada preparación y titulación de anti-CD4 y - CD56 anticuerpos. Pudiendo valorar adecuada resultados de CD4 en la mala separación de CD4+ T células de CD8+ T de las células (Figura 3A), mientras que una pobre valoración de CD56 puede conducir a una pobre separación de NK de las células B y las células negativas para todos los marcadores en la tinción (panel Figura 3B). Pobre lisis RBC pueden ocurrir con manchas de sangre. Si el objetivo principal del protocolo es calcular el porcentaje de población de diferentes células (por ejemplo, % de CD4+ T las células), contaminación con células de la negativa doble de RBC, que aparecerá en la trama de punto como población de negativa doble, debe ser excluida de el análisis (figura 3). Basándonos en nuestra experiencia con este protocolo, nos hemos dado cuenta que la separación exacta entre linfocitos B y NK CD8+ las células pueden ser verificadas mediante el uso de otros marcadores. Por ejemplo, las células NK son doble negativo para HLA-DR y CCR6, mientras que las células de B son doble positivo (figura 3D).
El protocolo presentado en este manuscrito está destinado a ser parte de un panel de coloración multicolor para interrogar a varias poblaciones inmunes en las muestras con número limitado de células. Mediante este enfoque, hemos investigado dinámica en poblaciones inmunes de muestras longitudinales de donantes con mieloma múltiple que recibieron un trasplante de células madre (Clinicaltrials.gov NCT0056609816). PBMC congelado fueron recogidos y analizados por citometría de flujo en el día 0, 14, 28, 60, 180, 360 después del trasplante. Mediante este enfoque, hemos sido capaces de interrogar a varias poblaciones de linfocitos, enfocándose en su perfil de ingenua/memoria (CD45RA, CCR7), activación y celular el estado de agotamiento (HLA-DR, CD57, CD45RA + memoria efectoras, CD16) y T efectoras fenotipo (CCR4, CCR6, CXCR3) en un solo panel17,18,19,20,21,22,23,24,25 la coloración , 26. esto ha sido particularmente útil teniendo en cuenta que el número de células colectadas para algunos de los pacientes y el tiempo de puntos era apenas suficiente para solamente un solo panel de tinción. Representante de control estrategia (figura 4) y la dinámica de las poblaciones de la celda seleccionada (figura 5) de un paciente recaída con el tiempo. En el mieloma múltiple B las células pueden expresar el marcador NK CD56. Para excluir esta posibilidad, utilizamos HLA-DR y CCR6 para diferenciar aún más las células de B de las células NK (Figura 4B). CD8+ las células T memoria e ingenuos fueron identificadas por la expresión de CD45RA y CCR7: ingenua (CD45RA+/CCR7+), central de la memoria (CM, CD45RA–/CCR7+), memoria efectoras (EM, CD45RA /CCR7–- ) memoria efectoras CD45RA y+ (EMRA, CD45RA+/CCR7+) (figura 4). Expresión de HLA-DR y CD57 en CD8+ ingenuo, células T de memoria total (que incluye CM, EM y EMRA), CM, EM y EMRA (figura 4). CD4+ las células T memoria e ingenuos fueron identificadas por la expresión de CD45RA y CCR7: ingenua (CD45RA+/CCR7+), central de la memoria (CM, CD45RA–/CCR7+), memoria efectoras (EM, CD45RA /CCR7–- ) memoria efectoras CD45RA y+ (EMRA, CD45RA+/CCR7+) (figura 4E). Expresión de HLA-DR y CD57 en CD4+ población ingenua y memoria (que comprenden CM, EM y EMRA), CM, EM y EMRA (figura 4F). CCR4 y CCR6 fueron utilizados como marcadores para identificar dentro de la población de memoria CD4 D9+ T las células (figura 4). Th1, 17/Th1, Th2 y Th17 CD4+ T subpoblaciones ayudante fueron identificadas por la expresión de CCR6, CCR4 y CXCR3 (figura 4 H). Expresión de CD16 y CD57 en las células NK (figura 4I). Trasplante de células madre resultó en un sostenido CD4+ y CD8 aumentó de+ activación de la célula de T como se muestra en la expresión de HLA-DR y CD57 y en una posición oblicua del ayudante de T a un fenotipo Th1. En 60 días el porcentaje de células B aumentada dramáticamente predecir la recaída del paciente (figura 5).
Figura 1: titulación de anticuerpos representante. Punto (A) muestra expresión de CD8 en PBMC fresco teñido con la concentración indicada del anticuerpo. (B) tabla representan la media y la desviación estándar de intensidad fluorescente de los CD8+, mediana intensidad fluorescente CD8 población– y el índice de mancha derivada para cada concentración probada. (C) la gráfica se muestra como derivados de la concentración óptima del anticuerpo en función del índice de la mancha. (D) valoración representante de anticuerpo CD4. Panel D se ha modificado de Boin et al 20172. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: representante de bloquear la estrategia y los resultados de la discriminación de la subpoblación. (A) representación esquemática del doblete exclusión, discriminación de células vivas y basado en el tamaño que bloquean de linfocitos y monocitos. (B) subpoblaciones linfocitarias identificadas con el enfoque de dos fluorocromo. Monocitos (C) identifican con el enfoque de dos fluorocromo. Se ha modificado la figura de Boin et al 20172. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: resultados representativos obtienen de muestra incorrecta separación y valoración de anticuerpos mal. (A) incorrecta valoración de los resultados de anticuerpos CD4 en mala resolución entre CD4+ y CD8+ poblaciones. (B) CD56 pobre valoración puede llevar a una mala separación de NK de las células de B. (C) efecto de la lisis incompleta de RBC en la discriminación de subpoblaciones. (D) ejemplo de uso de otros marcadores para verificar la correcta separación entre las células B y células NK: las células de B son HLA-DR y CCR6 doble positivo, mientras que las células NK son negativa doble. Panel D se ha modificado de Boin et al 20172. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: estrategia de análisis de muestras de un paciente con mieloma múltiple que bloquean. (A) los linfocitos fueron cerrados sobre la base de la FSC-A y área de SSC y su perfil de citometría de flujo con la tinción de células inmune dos fluorocromo se muestra. (B) separación de NK y B células utilizando CCR6 y HLA-DR. (C) estrategia de control para identificar CD8+ las células T memoria e ingenuos. (D) expresión de HLA-DR y CD57 en CD8+ las células de T ingenuas y memoria. (E) bloquear estrategia para identificar CD4+ las células T memoria e ingenuos. Expresión (F) HLA-DR y CD57 en CD4+ las células de T ingenuas y memoria. (G) identificación de D9 CD4+ T (H) identificación de Thelper CD4+ expresión de CD16 y CD57 de las subpoblaciones () de la célula de T en las células NK de las células. La figura ha sido adaptada de Boin et al 20172. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: dinámica de la población de la célula en paciente con mieloma múltiple. (A) dinámica de poblaciones de linfocitos grandes en PBMC aisladas y criopreservado en el día indicado después de trasplante de células madre (SCT). (B) caracterización de las subpoblaciones CD8 con el tiempo. (C) caracterización de subpoblaciones CD4 con el tiempo. (D) análisis de subconjuntos NK. Datos han sido trazados con GraphPad Prism. La figura ha sido adaptada de Boin et al 20172. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Blanco | Clon | Fluorocromo | Proveedor | Concentración | Propósito |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/20 | Linaje |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | Bio | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Células muertas | L/D azul | LT | 1/300 | Discriminación en vivo/muerto | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | |||||
Tabla 1: Panel de anticuerpos para la tinción de células inmune dos fluorocromo de PBMC (combinación de BV421-PE).
| Blanco | Clon | Fluorocromo | Proveedor | Concentración | Propósito |
| CD3 | UCHT1 | APC | BD | 1/20 | Linaje |
| CD56 | NCAM16.2 | APC | BD | 1/60 | |
| TCRΓΔ | B1 | APC | Bio | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Células muertas | L/D azul | LT | 1/300 | Discriminación en vivo/muerto | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | |||||
Tabla 2: Panel de anticuerpos utilizado para la tinción de células inmune dos fluorocromo de PBMC (combinación de APC-PE).
| Blanco | Clon | Fluorocromo | Catálogo | Proveedor | Concentración | Propósito |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | 562426 | BD | 1/20 | Linaje |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | 562751 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | 331217 | Bio | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | 555347 | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | 555367 | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | 555398 | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | 555413 | BD | 1/300 | |
| CCR7 | G043H7 | AF647 | 353217 | Bio | 1/30 | Diferenciación |
| CD45RA | HI100 | APC-H7 | 560674 | BD | 1/60 | |
| CCR4 | 1 DE 1 | PE-Cy7 | 561034 | BD | 1/60 | Subconjuntos de TH |
| CCR6 | G034-E3 | BV605 | 353419 | Bio | 1/30 | |
| CXCR3 | 1C 6/CXCR3 | AF488 | 561730 | BD | 1/30 | |
| CD57 | NK-1 | PE-CF594 | 562488 | BD | 1/900 | Activación/agotamiento |
| HLA-DR | G46-6 | BV510 | 563083 | BD | 1/30 | |
| CD16 | 3 8 | BUV395 | 563784 | BD | 1/30 | NK, activación de monocitos |
| Células muertas | L/D azul | L-23105 | LT | 1/300 | Discriminación en vivo/muerto | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | ||||||
Tabla 3: Panel de anticuerpos a la mancha congelada PBMC de un paciente con mieloma múltiple.
| Blanco | Clon | Fluorocromo | Proveedor | Concentración | Propósito |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/80 | Linaje |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/400 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | Bio | 1/200 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | BD | 1/1200 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | BD | 1/100 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/80 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| Células muertas | L/D azul | LT | 1/300 | Discriminación en vivo/muerto | |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies | |||||
Tabla 4: Panel de anticuerpos utilizado para la tinción de células inmune dos fluorocromo de sangre entera (combinación de BV421-PE).
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Discussion
El protocolo presentado aquí se ha demostrado para ser bastante flexible e insensible a los cambios en la coloración de tampón, la temperatura y la preparación de células de sangre periférica debido a la alta expresión de marcadores de linaje en la superficie celular. El paso más crítico para obtener datos reproducibles y de alta calidad, es la titulación de anticuerpos. De la nota, ya que la titulación de anticuerpos debe realizarse siempre durante la instalación de un panel de citometría de flujo, este paso no añadir Banco-tiempo extra a nuestro enfoque dos fluorocromo. La titulación de anti-CD3-CD8,-CD14, CD19 y - TCR γδ sigue el procedimiento estándar por el cual la concentración de anticuerpos óptimo separar picos positivos y negativos se deriva de máxima tinción índice13,14. Diluciones en el pico o cerca del pico en el lado ascendente de la curva de índice de mancha deben ser seleccionada (figura 1A-C). Por otro lado, una especial valoración de anticuerpos anti-CD4 y anti-CD56 debe realizarse. El anticuerpo anti-CD4 se titula para colocar el pico de la población positivo CD4 entre poblaciones positivo solo CD3 y CD3+/CD8+ T las células, más cercano al CD3 solo señal positiva para discriminar mejor los CD8dim () las poblaciones Células T NK y las células de T del γδ CD8+ ). En la misma línea, las células CD56 titulación pretende posición NK CD56+ entre el CD3+ y la población de CD3. La natural menor expresión de CD56 facilita la valoración de este anticuerpos con la concentración a utilizar cerca del valor obtenido en una curva de saturación. Utilizando fluorocromos de quantum alto rendimiento es otro factor crítico para una separación óptima de múltiples marcadores/poblaciones en el detector mismo. Se obtuvieron resultados exitosos con APC, BV421 y PE, pero otros fluorocromos, tales como la nueva generación de tinte de polímero, deberían dar resultados comparables. Para disminuir la posibilidad de artefactos debido a la compensación, también es importante elegir un par de fluorocromos con poco, si cualquier, solapamiento espectral, como APC, o PE, PE y BV421. Elegir pares de fluorocromos con virtualmente ninguna indemnización es importante para reducir la propagación de datos debido a la alta derrame de un fluorocromo en el otro detector de fluorocromo. Reducción facilita bloquear subpoblaciones inmunes al minimizar la distorsión de la señal y permite para utilizar esta metodología, si se limita a dos fluorocromos, sin necesidad de controles de compensación.
La combinación de marcadores que hemos propuesto es altamente personalizable y basado en los requerimientos del investigador. De hecho, algunos de los marcadores pueden ser excluidos del análisis si no refieren a una población de interés. Por ejemplo, es posible quitar el anticuerpo anti-CD19 para excluir las células de B y el anticuerpo anti-CD4 centrarse sólo en los CD8+ T las células. De nota, anticuerpo anti-CD8 es importante identificar CD8+ NK células y células de T del γδ y por lo tanto no se debe retirar del panel. Para mejorar la separación de poblaciones celulares poco comunes, otros fluorocromos/detectores puede utilizarse para algunos de los marcadores de la tinción de fluorocromo dos. Por ejemplo, CD56 puede mover a un detector diferente para detectar células NKT, que no es posible con el panel de dos fluorocromo. Mientras que es posible reducir el número de marcadores del panel, debe ejercer precaución en agregar, cambiar o cambiar marcadores.
Siempre y cuando el conjunto instrumental, anticuerpos y habilidad necesario, el enfoque estándar marcador fluorocromo uno sigue siendo la forma más precisa para identificar varias poblaciones inmunes y discriminar subpoblaciones raras, como las células de T de NKT o γδ. Sin embargo, el objetivo principal de este método es no para sustituir el enfoque clásico, sino a lograr una profunda immunophenotyping al trabajar con instrumentos con un bajo número de detectores, o muestras con un número limitado de células, mientras que reduce la complejidad y costos en el sistema experimental. Hemos hecho una investigación extensa de muestras clínicas de pacientes con mieloma múltiple, la esclerosis sistémica, dermatomiositis y enfermedad de Lyme que muestra que este procedimiento de tinción puede mejorar la interrogación simultánea de varias poblaciones con limitada número de células. Nuestros resultados hasta ahora han demostrado que este procedimiento es insensible a la activación inmune crónica o enfermedades infecciosas, pero pruebas preliminares deben realizarse para evaluar la exactitud de este protocolo en Estados diferentes de la enfermedad.
Direcciones futuras para reforzar el potencial de este protocolo incluyen estudios para caracterizar la infiltración de linfocitos en los tejidos primarios de las muestras clínicas. Esto es relevante para el tumor y de la inmunología de la enfermedad autoinmune donde este enfoque podría proporcionar información valiosa para el análisis de las muestras con material limitada. Estamos pensando en probar este panel en células permeabilized ampliar la potencialidad para detectar la expresión del cytokine y señalización de moléculas en las mismas muestras clínicas. Finalmente, debe señalarse que enfoques similares, destinados a ampliar el número de marcadores de grabación, podrían también desarrollarse utilizando diferentes tipos de marcadores y también pueden ser modelos animales fordifferent desarrollados.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de artritis y lesiones músculo-esqueléticas y enfermedades de la piel, < https://www.niams.nih.gov/>, Premio número P30-AR053503; La Fundación más estable, www.stablerfoundation.org; Nacional Instituto de alergias y enfermedades infecciosas, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Programa de Irlanda de Nina para la salud pulmonar (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
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